專利名稱：抗細胞增殖或抗腫瘤藥物的篩選試劑盒、篩選方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗細胞增殖、抗腫瘤藥物的篩選試劑盒，一種抗細胞增殖、抗腫瘤藥物的篩選方法以及Ste20家族激酶在篩選抗細胞增殖、抗腫瘤藥物中的用途。更具體地說，涉及到通過檢測加入待測藥物以及重組或天然的PDCD10以后，Ste20家族激酶的活性的變化來鑒定和評價該藥物是否為抗細胞增殖、抗腫瘤藥物。本發(fā)明屬于分子生物系及生物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明在于使用PDCD10基因及Ste20家族激酶來篩選抗細胞增殖、抗腫瘤藥物。
PDCD10基因(也曾命名為TFAR15)克隆自撤除生長因子GM-CSF培養(yǎng)條件下的TF-1細胞，染色體定位是3q26.1，基因長度50kb，編碼212個氨基酸，通過數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)該基因從線蟲到人類高度保守，其具體序列可見下面的序列表。并且，分析其氨基酸序列未發(fā)現(xiàn)信號肽、跨膜區(qū)及任何已知功能結(jié)構(gòu)域。
以前的研究提示PDCD10分子可能與細胞凋亡和腫瘤相關(guān)。去神經(jīng)支配后萎縮骨骼肌中PDCD10因表達水平下調(diào)，重組PDCD10蛋白可以抑制成纖維細胞系在某些凋亡誘導(dǎo)條件下(如staurosporine，放線菌酮，或TNF-a等)的自然死亡。這些結(jié)果提示PDCD10作為抗凋亡分子發(fā)揮作用(王玉剛，劉洪濤，張潁妹，馬大龍.一個人類凋亡相關(guān)新基因TFAR15的cDNA克隆化與表達中國科學(xué)-C輯生命科學(xué)，1999，Vol42，323-329)。進而，基因芯片數(shù)據(jù)提示PDCD10基因可能與腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，在胰腺癌、抵抗順鉑誘導(dǎo)的凋亡的轉(zhuǎn)移大腸癌細胞系、喉鱗狀細胞癌、抗腫瘤物質(zhì)cantharidin引起凋亡的肝癌Q-GY27703細胞及IFNγ轉(zhuǎn)化的肝癌細胞系HepG2等細胞中PDCD10 mRNA表達均有上調(diào)。Kamath R.S等還發(fā)現(xiàn)，用RNAi特異性關(guān)閉PDCD10在C.elegans基因組的同源基因會造成40％的胚胎致死；Shapshak P等在利用基因芯片對AIDS相關(guān)的癡呆癥患者腦組織和三體型癡呆癥患者的上皮成纖維細胞的基因表達譜進行研究時發(fā)現(xiàn)，在這兩類患者中PDCD10基因的表達都有明顯上調(diào)；最近的研究又發(fā)現(xiàn)PDCD10是腦海綿狀血管瘤的致病基因(Bergametti，F(xiàn).，Denier，C.，Labauge，P.，Arnoult，M.，and et al.Mutations within the Programmed CellDeath 10Gene Cause Cerebral Cavernous Malformations(2005)Am J Hum Genet.76，42-51)；以上結(jié)果顯示PDCD10在與細胞凋亡有關(guān)的疾病中確有作用。然而，PDCD10分子的功能和作用機制還尚未得到闡述。
Ste20是一種出芽酵母絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，在酵母、線蟲、果蠅及哺乳類中保守存在，現(xiàn)有證據(jù)提示該家族蛋白作為MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游的MAP4K分子發(fā)揮作用，進而影響細胞的凋亡、增殖、細胞形態(tài)及細胞骨架重排(Ippeita Dan，Norinobu M.Watanabe and Akihiro Kusumi.The Ste20 group kinases as regulators ofMAP kinase cascades.TRENDS in Cell Biology(2001)11；220-229)。MAPK通路是最經(jīng)典細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，廣泛存在于哺乳細胞中，目前發(fā)現(xiàn)的有最主要的三種MAPK通路，包括ERK、JNK和p38通路。其中ERK MAPK通路參與細胞生長、發(fā)育、分裂及細胞間的功能同步等多種生理過程，并在細胞惡性轉(zhuǎn)化等病理過程中起重要作用。越來越多的證據(jù)顯示ERK MAPK通路在人類癌癥的病理發(fā)生、發(fā)展和致癌行為方面起作用。異常的激酶磷酸化作用在許多疾病作用過程中都扮演了角色，例如癌癥、糖尿病致視網(wǎng)膜病、風濕性關(guān)節(jié)炎和帕金森氏癥等疾病。因而當前許多正在開發(fā)的新藥便以抑制蛋白質(zhì)激酶為目標。
MST4(曾被命名為MASK)是Ste20激酶家族成員，Northern印記分析顯示MST4廣泛表達，該基因定位于疾病相關(guān)基因富集的Xq26區(qū)域。有報道提示，在細胞骨架重排、形態(tài)發(fā)生、細胞凋亡及其他各種細胞事件中，MST4通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用。已有證據(jù)提示MST4通過調(diào)節(jié)Ras/Raf非依賴的ERK通路影響細胞的生長和轉(zhuǎn)化(Jei-Liang Lin，Hua-Chien Chen，Hsin-I Fang，Dan Robinson，Hsing-Jien Kungand Hsiu-Ming Shih.MST4，a new Ste20-related kinase that mediates cell growth andtransformation via modulating ERK pathway.Oncogene(2001)20，6559-6569)。近期研究證明，通過高爾基器基質(zhì)蛋白GM130的結(jié)合，MST4和YSK1(也被命名為STK25，MST3)這兩種Ste20激酶定位于高爾基器上。GM130是一種絞架蛋白，是MST激酶的激活分子，與GM130的結(jié)合可以使MST4和YSK1被活化?；罨腨SK1磷酸化14-3-3ζ及其他可能與正常細胞遷移有關(guān)的下游靶分子，而MST4則是通過未知途徑發(fā)揮作用。還有研究提示MST4在腫瘤形成過程中發(fā)揮作用，MST4在前列腺腫瘤和前列腺癌細胞系中的表達與腫瘤發(fā)生和AR狀態(tài)相關(guān)，過表達MST4可以導(dǎo)致細胞錨定非依賴生長及腫瘤發(fā)生，這些發(fā)現(xiàn)支持這種可能，即在前列腺癌進展過程中MST4可調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Victoria Sung，Wen Luo，Dapeng Qian，Isabelle Lee，Bahija Jalla，and Mikhail Gishizky.The Ste20 Kinase MST4 Plays a Role in Prostate CancerProgression.CANCER RESEARCH(2001)63，3356-3363)。盡管MST4的調(diào)節(jié)機制和分布尚未闡明，但哺乳動物Ste20樣激酶的磷酸化和雙體化可以調(diào)節(jié)細胞核質(zhì)的穿梭轉(zhuǎn)運現(xiàn)象已有報道。另外，Ste20激酶家族的另一個成員MST3，在它激酶結(jié)構(gòu)域的C端可能包含一個雙向核定位信號(氨基酸殘基278-292)，這段序列在MST3和MST4之間高度保守，而這兩個分子在該激酶家族中同源性最高。
目前已知的PDCD10基因開放讀碼框序列、PDCD10氨基酸序列以及STE20家族激酶分子MST4的不同物種同源性比對示意圖分別如下1.PDCD10基因開放讀碼框序列Atgaggatgacaatggaagagatgaagaatgaagctgagaccacatccatggtttctatgcccctctatgcagtcatgtatcctgtgtttaatgagctagaacgagtaaatctgtctgcagcccagacactgagagccgctttcatcaaggctgaaaaagaaaatccaggtctcacacaagacatcattatgaaaattttagagaaaaaaagcgtggaagttaacttcacggagtcccttcttcgtatggcagctgatgatgtagaagagtatatgattgaacgaccagagccagaattccaagacctaaacgaaaaggcacgagcacttaaacaaattctcagtaagatcccagatgagatcaatgacagagtgaggtttctgcagacaatcaaggatatagctagtgcaataaaagaacttcttgatacagtgaataatgtcttcaagaaatatcaataccagaaccgcagggcacttgaacaccaaaagaaagaatttgtaaagtactccaaaagtttcagtgatactctgaaaacgtattttaaagatggcaaggcaataaatgtgttcgtaagtgccaaccgactaattcatcaaaccaacttaatacttcagaccttcaaaactgtggcctga2.PDCD10氨基酸序列MRMTMEEMKNEAETTSMVSMPLYAVMYPVFNELERVNLSAAQTLRAAFIKAEKENPGLTQDIIMKILEKKSVEVNFTESLLRMAADDVEEYMIERPEPEFQDLNEKARALKQILSKIPDEINDRVRFLQTIKDIASAIKELLDTVNNVFKKYQYQNRRALEHQKKEFVKYSKSFSDTLKTYFKDGKAINVFVSANRLIHQTNLILQTFKTVA3.STE20家族激酶分子MST4的不同物種同源性比對示意圖
——Protein Acc. GeneOrganism——NP 057626.2 MST4H.sapiensXP 521266.2 LOC465862 P.troglodytesXP 549261.2 LOC492140 C.familiarisNP 598490.1 2610018G03Rik M.musculusXP 229143.4 RGD1563568_pred R.norvegicusictedXP 420219.1 RCJMB04_2k24G.gallusNP 057626.2 --------------------------------------------XP 521266.2 1---------MAGKSGGPPTPRLSVILPLARP-------------22XP 549261.2 1--------MFITTKTTEKTPSWE---DDGDKMMELR--------25NP 598490.1 --------------------------------------------XP 229143.4 1MGRKKCKNGSIVIRSVITVVSVEIGLAEGNRLSDNTIVKSGGAK 44XP 420219.1 1--MEKAGKLKLPESPTVTTEGVGNDGPPSAPQRSHVCKRNGSVK 42NP 057626.2 --------------------------------------------XP 521266.2 23 -----------GSQERLPTLPKFQLKSSPRLPVPQP-----RTP 50XP 549261.2 26 -----------TSVRLSATWPRRGRTLTPRVTETPP-----FPP 53NP 598490.1 --------------------------------------------XP 229143.4 45 QTFATPDLWAATSTLASQACLQRGRVRSSGSPSYPPPHSRSRKL 88XP 420219.1 43 LE------RNPTYRYKATDDQRAGGVASPGASHSHPQERMPCHP 80NP 057626.2 --------------------------------------------XP 521266.2 51 PCNVAASGTPSYPQGFPNS---SILFPGP--------------- 76XP 549261.2 54 LAGPS---AGPPSPRLLLS--ACGGSPPP-----RRP------- 80NP 598490.1 --------------------------------------------XP 229143.4 89 FCSFS---RTSYVPGFSIP--AFCCSPQP-----LRAPCFANSD 122XP 420219.1 81 LCVPSPHPEHSLAPRTARSCQGWVCSTSSSIQLSLTAPELGDYG 124NP 057626.2 --------------------------------------------XP 521266.2 77 --AVSQVSGSPGSPLRVPG------------------------E 94XP 549261.2 81 --SRSPAPRGAPALLTPPG--------------------GRAEA 102NP 598490.1 --------------------------------------------XP 229143.4123 YFSQPGLQLEASAPLTPPG--------------------SGVEA 146XP 420219.1125 CTSMGTQGQNEIGDLSPPGELEGEEITLQGFSLVAAGWLQNLLA 168NP 057626.2 --------------------------------------------XP 521266.2 95 SPASQTPATPAKPLR----------------------------- 109XP 549261.2103 GPTAEPPPTASRAQRAGGLLGR---------------------- 124NP 598490.1 --------------------------------------------XP 229143.4147 GPTAEPPPAASQPRRSGGLLGR---------------------- 168XP 420219.1169 GPHVTARAAKAELGHGGHSPGRRASSEQGDNLAKGTNFPLRLPV 212NP 057626.2 --------------------------------------------XP 521266.2110 ---CLEPWLPRHRPAAGRGGEAQRSG------------------ 132XP 549261.2125 ----LHLLFLKRRGAEERHHSSPGPG------------------ 146NP 598490.1 --------------------------------------------XP 229143.4169 ----LHLLFLKRRGAAEPHHWSPGPS------------------ 190XP 420219.1213 KAMFVTFVLWEEFGCVCTYKSSPGSGWMMTVWQGEGKEEKTDSK 256NP 057626.2 --------------------------------------------XP 521266.2 --------------------------------------------XP 549261.2 --------------------------------------------NP 598490.1 --------------------------------------------XP 229143.4 --------------------------------------------
XP 420219.1257 KIKDVIEKDLQALAAQENPELEKAFYSQFFWWHQAAVTVLGTRG 300NP 057626.2 --------------------------------------------XP 521266.2133 ------------------------------------ITRAQVP- 139XP 549261.2147 --------------------------------------YRH--- 149NP 598490.1 --------------------------------------------XP 229143.4191 --------------------------------------HCR--- 193XP 420219.1301 TSTLCPGTHLCARDTAVRALWLCLWVLRSVAQGLQGTRHCHKAP 344NP 057626.2 --------------------------------------------XP 521266.2140 ---ATTTHSARRSGRGAAAEAAASAAG----------------- 163XP 549261.2150 ---TVRPAFGRRSGGGGGGNSGGRAPE----------------- 173NP 598490.1 --------------------------------------------XP 229143.4194 ---THSSAFRKRSGTATVRKLGGRASE----------------- 217XP 420219.1345 EGDTALDAEARAAAAAPPHKAGAETEEAAAAQQPPPPRPPPPAR 388NP 057626.2 --------------------------------------------XP 521266.2164 ----------GRQKGPVRKAWEGRRTTPGGR------------- 184XP 549261.2174 -----------RPRSKSLG---GPPSYPRRR------------- 190NP 598490.1 --------------------------------------------XP 229143.4218 -----------RPRSRSLG---ELQSYPRRR------------- 234XP 420219.1389 GPTWRSEPSPGRAESRHPGSTEQPPSPLREREGGHGQGRRGEPG 432NP 057626.2 --------------------------------------------XP 521266.2185 ------------SQSEPKAPPPQKRSEAAFAS------------ 204XP 549261.2191 ------------SQSEPKAPPPQEQCRAVFAF------------ 210NP 598490.1 --------------------------------------------XP 229143.4235 ------------SQSVPQEPPPQKQREVAAAS------------ 254XP 420219.1433 GHGRAALVDPFPPASRSSAPAPRPQRGPAAAQQQGGREEGAAGG 476NP 057626.2 1 -------MAHSPVAVQVPGMQNNIADPEELFTKLERIGKGSFGE 37XP 521266.2205 -------MAHSPVAVQVPGMQNKIXDXEELFTKLERIGKGSFGE 241XP 549261.2211 -------MAHSPVAVQVPGMQNNIADPEELFTKLERIGKGSFGE 247NP 598490.1 1 -------MAHSPVAVQVPGMQNNIADPEELFTKLERIGKGSFGE 37XP 229143.4255 -------MAHSPVAVQVPGMQNNIADPEELFTKLERIGKGSFGE 291XP 420219.1477 ARPPQPAMAHSPVAVQVPGMQNHRADPEELFTKLERIGKGSFGE 520NP 057626.2 38 VFKGIDNRTQQVVAIKIIDLEEAEDEIEDIQQEITVLSQCDSSY 81XP 521266.2242 VFKGIDNRTQQVVAIKIIDLEEAEDEIEDIQQEITVLSQCDSSY 285XP 549261.2248 VFKGIDNRTQQVVAIKIIDLEEAEDEIEDIQQEITVLSQCDSSY 291NP 598490.1 38 VFKGIDNRTQQVVAIKIIDLEEAEDEIEDIQQEITVLSQCDSSY 81XP 229143.4292 VFKGIDNRTQQVVAIKIIDLEEAEDEIE0IQQEITVLSQCDSSY 335XP 420219.1521 VFKGIDNRTQQVVAIKIIDLEEAEDEIEDIQQEITVLSQCDSPY 564NP 057626.2 82 VTKYYGSYLKGSKLWIIMEYLGGGSALDLLRAGPFDEFQIATML 125XP 521266.2286 VTKYYGSYLKGSKLWIIMEYLGGGSALDLLRAGPFDEFQIATML 329XP 549261.2292 VTKYYGSYLKGSKLWIIMEYLGGGSALDLLRAGPFDEFQIATML 335NP 598490.1 82 VTKYYGSYLKGSKLWIIMEYLGGGSALDLLRAGPFDEFQIATML 125XP 229143.4336 VTKYYGSYLKGSKLWIIMEYLGGGSALDLLRAGPFDEFQIATML 379XP 420219.1565 VTKYYGSYLKGTKLWIIMEYLGGGSALDLLRAGPFDEFQIATML 608NP 057626.2126 KEILKGLDYLHSEKKIHRDIKAANVLLSEQGDVKLADFGVAGQL 169XP 521266.2330 KEILKGLDYLHSEKKIHRDIKAANVLLSEQGDVKLADFGVAGQL 373XP 549261.2336 KEILKGLDYLHSEKKIHRDIKAANVLLSEQGDVKLADFGVAGQL 379NP 598490.1126 KEILKGLDYLHSEKKIHRDIKAANVLLSEQGDVKLADFGVAGQL 169XP 229143.4380 KEILKGLDYLHSEKKIHRDIKAANVLLSEQGDVKLADFGVAGQL 423XP 420219.1609 KEILKGLDYLHSEKKIHRDIKAANVLLSEQGDVKLADFGVAGQL 652NP 057626.2170 TDTQIKRNTFVGTPFWMAPEVIQQSAYDSKADIWSLGITAIELA 213XP 521266.2374 TDTQIKRNTFVGTPFWMAPEVIQQSAYDSKADIWSLGITAIELA 417XP 549261.2380 TDTQIKRNTFVGTPFWMAPEVIQQSAYDSKADIWSLGITAIELA 423NP 598490.1170 TDTQIKRNTFVGTPFWMAPEVIQQSAYDSKADIWSLGITAIELA 213XP 229143.4424 TDTQIKRNTFVGTPFWMAPEVIQQSAYDSKADIWSLGITAIELA 467XP 420219.1653 TDTQIKRNTFVGTPFWMAPEVIQQSAYDSKADIWSLGITAIELA 696NP 057626.2214 KGEPPNSDMHPMRVLFLIPKNNPPTLVGDFTKSFKEFIDACLNK 257XP 521266.2418 KGEPPNSDMHPMRVLFLIPKNNPPTLVGDFTKSFKEFIDACLNK 461
XP 549261.2424 KGEPPNSDMHPMRVLFLIPKNNPPTLVGDFTKSFKEFIDACLNK 467NP 598490.1214 KGEPPNSDMHPMRVLFLIPKNNPPTLIGDFTKSFKEFIDACLNK 257XP 229143.4468 KGEPPNSDMHPMRVLFLIPKNNPPTLVGDFTKSFKEFIDACLNK 511XP 420219.1697 KGEPPNSDMHPMRVLFLIPKNNPPTLLGEFSKPFKEFIDACLNK 740NP 057626.2258 DPSFRPTAKELLKHKFIVKNSKKTSYLTELIDRFKRWKAEGHSD 301XP 521266.2462 DPSFRPTAKELLKHKFIVKNSKKTSYLTELIDRFKRWKAEGHSD 505XP 549261.2468 DPSFRPTAKELLKHKFIVKNSKKTSYLTELIDRFKRWKAEGHSD 511NP 598490.1258 DPSFRPTAKELLKHKFIVKNSKKTSYLTELIDRFKRWKAEGHSD 301XP 229143.4512 DPSFRPTAKELLKHKFIVKNSKKTSYLTELIDRFKRWKAEGHSD 555XP 420219.1741 DPTFRPTAKELLKHKFIMKNAKKTSYLTELIDRFKRWKAEGHSS 784NP 057626.2302 DESDSEGSDSESTSRENNTHPEWSFTTVRKKPDPKKVQNGAEQD 345XP 521266.2506 DESDSEGSDSESTSRENNTHPEWSFTTVRKKPDPKKVQNG--AV 547XP 549261.2512 DESDSEGSDSESTSRENNTHPEWSFTTVRKKPDPKKLQNGAEQD 555NP 598490.1302 EESDSEGSDSESSSRESNPHPEWSFTTVRKKPDPKKLQNGEEQD 345XP 229143.4556 EESDSEGSDSESSSRESNTHPEWSFTTVRKKPDPKKLQNGEEQD 599XP 420219.1785 DESDSDGSDSESSNKENNSHPEWSFTTVRKKPDAKKLQNGTDQD 828NP 057626.2346 LVQTLSCLSMIITPAFAELKQQDENNASRNQAIEELEKSIAVAE 389XP 521266.2548 FSRRIPLRNLLLAFVSYGPREPHQTYVKINNA------------ 579XP 549261.2556 LVQTLSCLSMIITPAFAELKQQDENNASRNQAIEELEKSIAVAE 599NP 598490.1346 LVQTLSCLSMIITPAFAELKQQDENNASRNQAIEELEKSIAVAE 389XP 229143.4600 LVQTLSCLSMIITPAFAELKQQDENNASRNQAIEELEKSIAVAE 643XP 420219.1829 LVKTLSCLTMIITPVFAELKQQDTNNASRKKAIEELEKSINMAE 872NP 057626.2390 AACPGITDKMVKKLIEKFQKCSADESP 416XP 521266.2 ---------------------------XP 549261.2600 AACPGITDKMVKKLIEKFQKCSADESP 626NP 598490.1390 TACPGITDKMVKKLIEKFQKCSADESP 416XP 229143.4644 AACPGITDKMVKKLIEKFQKCSADESP 670XP 420219.1873 ATCPGITDKMVKKLMEKFQK------- 892發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種抗細胞增殖、抗腫瘤藥物的篩選試劑盒，并建立一種抗細胞增殖、抗腫瘤藥物的篩選方法以及提供一種Ste20家族激酶在篩選抗細胞增殖、抗腫瘤藥物中的用途。
針對上述發(fā)明目的，發(fā)明人以所述的腫瘤細胞例如人前列腺癌PC-3細胞為靶細胞，以Ste20家族激酶作靶分子，檢測加入重組或天然的PDCD10并在待篩選藥物作用下，通過待篩選藥物對Ste20家族激酶表達或/和活性的影響，篩選合適的抗細胞增殖、抗腫瘤藥物。
具體的，本發(fā)明的工作原理如下將PDCD10分子和Ste20家族激酶分子混合，以ATP為激酶磷酸化反應(yīng)的磷酸供體，當Ste20家族激酶分子的天然底物或人工合成底物被磷酸化后，用抗該底物磷酸化形式的抗體進行反應(yīng)，再加入酶標記的二抗及顯色底物，檢測吸光值以檢測激酶活性。利用本試劑盒，如果加入不同藥物后激酶的活性發(fā)生改變，則該藥物將有可能用于腫瘤治療。
本發(fā)明的發(fā)明人通過酵母雙雜交實驗，發(fā)現(xiàn)PDCD10與Ste20家族激酶中MST4及YSK1的相互作用，并經(jīng)免疫共沉淀、細胞內(nèi)激光共聚焦共定位實驗進一步證實。經(jīng)過一系列的實驗證明PDCD10與MST4相互作用可以通過調(diào)節(jié)ERK MAPK通路促進細胞的增殖和轉(zhuǎn)化，而抑制PDCD10或MST4的表達可以降低腫瘤細胞系的增殖能力。經(jīng)過廣泛而深入的研究，本發(fā)明的發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)，單獨過表達PDCD10或MST4都可以促進細胞的增殖，而共同過表達的促增殖作用遠遠強于單獨過表達其中的一個分子。通過向腫瘤細胞系中轉(zhuǎn)染抑制PDCD10或MST4表達的siRNA，都可以抑制細胞的增殖。PDCD10和MST4的相互作用可以激活ERK MAPK通路，而抑制PDCD10或MST4表達后則不能激活ERK MAPK通路。本發(fā)明的發(fā)明人還同時發(fā)現(xiàn)，不論是內(nèi)源性還是過表達的PDCD10都可以在體外增加MST4的激酶活性，其中過表達的PDCD10的激活作用是對照的三倍以上，而內(nèi)源性PDCD10被抑制時MST4的激酶活性略有下降。由于Ste20家族激酶有可能作為MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游的MAP4K分子發(fā)揮作用，因此可推測，能夠抑制PDCD10對Ste20家族激酶的激活作用的物質(zhì)，可以抑制細胞的增殖，并可成為治療腫瘤的新藥物。
基于這些結(jié)果，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案。
一方面，本發(fā)明提供一種用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤藥物的組合產(chǎn)品，該組合產(chǎn)品的具體形式可以為檢測試劑盒。
其原理如前所述是通過檢測在PDCD10作用下，待篩選藥物對Ste20家族激酶表達或/和活性的影響，從而篩選出能夠抑制PDCD10對Ste20家族激酶的激活作用的物質(zhì)，即，用于抑制細胞增殖，治療腫瘤的藥物。
該組合產(chǎn)品包含以下組成部分重組的或天然的PDCD10分子，重組的或天然的Ste20家族激酶分子，Ste20家族激酶分子的天然底物或人工合成底物。
如權(quán)利要求1所述的用于篩選抑制細胞增殖或治療腫瘤藥物的組合產(chǎn)品，其特征在于，其具體形式為檢測試劑盒。
優(yōu)選的，該組合產(chǎn)品還包含ATP、抗Ste20家族激酶分子的天然底物或人工合成底物磷酸化形式的抗體?；蛘撸溥€包含選自激酶反應(yīng)緩沖液、酶標記的二抗、顯色底物、其它反應(yīng)緩沖液中的一種或幾種。
如前述任一權(quán)利要求所述的用于篩選抑制細胞增殖或治療腫瘤藥物的組合產(chǎn)品，其特征在于，所述重組的或天然的Ste20家族激酶分子為重組的或天然的MST4分子。
優(yōu)選的，所述Ste20家族激酶分子的天然底物或人工合成底物為人工合成底物Ezrin(Thr567)/Radixin(Thr564)/Moesin(Thr558)生物素標記多肽。
另一方面，本發(fā)明提供一種重組的或天然的Ste20家族激酶在篩選待篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤藥物中的用途。
優(yōu)選的，其中所述的抑制細胞增殖或抗腫瘤藥物包括蛋白、多肽、天然藥物、化學(xué)合成藥物以中草藥提取物。
第三方面，本發(fā)明還提供一種用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤藥物的方法，所述的方法包括以下步驟獲得重組的或內(nèi)源性表達的PDCD10分子；獲得重組的或內(nèi)源性表達的Ste20激酶家族分子；將獲得的PDCD10分子和Ste20激酶家族分子在體外與ATP、Ste20激酶家族分子的作用底物、待檢物質(zhì)混合反應(yīng)；終止反應(yīng)，檢測Ste20家族激酶的表達或/和活性。
本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中提供一種用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤藥物的檢測試劑盒，具體包含1.重組的或天然的PDCD10分子2.重組的或天然的Ste20家族激酶分子3.Ste20家族激酶分子的天然底物或人工合成底物4.ATP5.抗Ste20家族激酶分子的天然底物或人工合成底物磷酸化形式的抗體6.激酶反應(yīng)緩沖液7.酶標記的二抗8.顯色底物9.其它反應(yīng)緩沖液本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中提供一種用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤藥物的檢測試劑盒，具體包含1.重組的或天然的PDCD10分子2.重組的或天然的MST4分子3.MST4的天然底物或人工合成底物，如人工合成底物Ezrin(Thr567)/Radixin(Thr564)/Moesin(Thr558)生物素標記多肽4.ATP5.激酶反應(yīng)緩沖液6.抗MST4天然底物或人工合成底物磷酸化形式的抗體7.酶標記的二抗8.顯色底物9.其它反應(yīng)緩沖液本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中提供一種用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤藥物的方法，包括以下步驟1.獲得重組的或內(nèi)源性表達的PDCD10分子，可通過以下任意一種途徑1)獲得重組的原核表達PDCD10分子將原核PDCD10表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸桿菌中，培養(yǎng)細菌，從表達菌株中提取原核表達PDCD10分子。
2)獲得重組的真核表達PDCD10分子將真核PDCD10表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞系中，培養(yǎng)細胞，從轉(zhuǎn)染細胞中獲取真核表達PDCD10分子。
3)獲得內(nèi)源性表達的PDCD10分子，從有內(nèi)源性PDCD10表達的組織或細胞中獲取內(nèi)源性表達的PDCD10分子。
2.獲得重組的或內(nèi)源性表達的Ste20激酶家族分子，可通過以下任意一種途徑1)獲得重組的原核表達Ste20激酶家族分子將原核Ste20激酶家族分子表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸桿菌中，培養(yǎng)細菌，從表達菌株中提取原核Ste20激酶家族分子。
2)獲得重組的真核表達Ste20激酶家族分子將真核Ste20激酶家族分子表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞系中，培養(yǎng)細胞，從轉(zhuǎn)染細胞中獲取真核表達Ste20激酶家族分子。
3)獲得內(nèi)源性表達的Ste20激酶家族分子，從有內(nèi)源性Ste20激酶家族分子表達的組織或細胞中獲取內(nèi)源性表達的Ste20激酶家族分子。
3.將通過以上任一途徑獲得的PDCD10分子和Ste20激酶家族分子在體外與ATP、Ste20激酶家族分子的作用底物、待檢物質(zhì)混合，在激酶反應(yīng)緩沖液中25℃孵育30分鐘，用等體積50mM EDTA終止反應(yīng)。
4.ELISA反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物1∶4稀釋于包被緩沖液(0.05M NaHCO3，pH 8.6)而且包被一個預(yù)處理的ELISA板，37℃孵育1小時。棄包被液，用PBST(PBS/0.05％Tween20)洗兩次，加胎牛血清(1∶100稀釋于PBST)室溫封閉30分鐘，加入抗Ste20家族激酶分子底物的磷酸化形式的抗體(1∶1000稀釋于1％BSA/PBST)，每孔100μL，37℃孵育1小時。洗滌五次，ELISA板加入HRP標記的二抗(1∶10000稀釋于1％BSA/PBST)，每孔100μl，37℃孵育1小時。洗滌五次，每孔加50μl TMB底物。室溫顯色10分鐘后450nm檢查吸光值。
本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中提供一種用于篩選抑制細胞增殖或治療腫瘤藥物的方法，包括以下步驟1.獲得重組真核表達的或內(nèi)源性表達的PDCD10分子，可通過以下任意一種途徑1)獲得重組的真核表達PDCD10分子將真核PDCD10表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HeLa細胞系中，培養(yǎng)細胞，48小時以后，裂解細胞并以Protein G磁珠處理1小時，然后與抗PDCD10單克隆抗體4℃孵育2小時，獲得的免疫復(fù)合物中的PDCD10主要為重組的真核表達PDCD10分子。
2)獲得內(nèi)源性表達的PDCD10分子，轉(zhuǎn)染PDCD10siRNA或不轉(zhuǎn)染siRNA的HeLa細胞，培養(yǎng)48小時以后，裂解細胞并以Protein G磁珠處理1小時，然后與抗PDCD10單克隆抗體4℃孵育2小時，獲得的免疫復(fù)合物中的PDCD10為內(nèi)源性表達的PDCD10分子。
2.重組MST4來自HTScanTMMst4激酶分析試劑盒(Cell signaling，Danvers，MA)3.將通過以上任一途徑獲得的PDCD10分子和重組MST4分子在體外與ATP、MST4的作用底物Ezrin(Thr567)/Radixin(Thr564)/Moesin(Thr558)生物素標記多肽(Cell signaling，Danvers，MA)、待檢物質(zhì)混合，在激酶反應(yīng)緩沖液中25℃孵育30分鐘，用等體積50mM EDTA終止反應(yīng)。
4.ELISA反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物1∶4稀釋于包被緩沖液(0.05M NaHCO3，pH 8.6)而且包被一個預(yù)處理的ELISA板，37℃孵育1小時。棄包被液，用PBST(PBS/0.05％Tween20)洗兩次，加胎牛血清(1∶100稀釋于PBST)室溫封閉30分鐘，加入抗磷酸化Ezrin(Thr567)/Radixin(Thr564)/Moesin(Thr558)多肽的一抗(Cell signaling，Danvers，MA)(1∶1000稀釋于1％BSA/PBST)，每孔100μL，37℃孵育1小時。洗滌五次，ELISA板加入HRP標記的二抗(1∶10000稀釋于1％BSA/PBST)，每孔100μl，37℃孵育1小時。洗滌五次，每孔加50μl TMB底物。室溫顯色10分鐘后450nm檢查吸光值。
本發(fā)明適用于各種抑制細胞增殖或治療腫瘤藥物的篩選，包括蛋白、多肽、天然藥物、化學(xué)合成藥物以中草藥提取物。本發(fā)明的優(yōu)點是操作簡便、快捷、準確。經(jīng)本發(fā)明提供的藥物篩選試劑盒或藥物篩選方法檢測，如果與不加待篩選藥物的對照相比，篩選到的待檢物質(zhì)可降低反應(yīng)體系的吸光值，則說明該物質(zhì)可抑制PDCD10對Ste20家族激酶的激活作用，即可作為抑制細胞增殖和腫瘤治療的候選藥物，進行進一步的研究和應(yīng)用。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明圖1是PDCD10在多種腫瘤細胞系中的表達結(jié)果；圖2是PDCD10與MST4的免疫共沉淀結(jié)果；圖3是PDCD10與MST4在Hela細胞中的激光共聚焦亞細胞共定位結(jié)果；圖4是siRNA抑制PDCD10表達的結(jié)果；圖5是PDCD10調(diào)節(jié)未過表達MST4和過表達MST4細胞增殖的MTT和H3-TdR實驗結(jié)果；圖6是PDCD10調(diào)節(jié)未過表達MST4和過表達MST4細胞增殖的克隆形成實驗結(jié)果；圖7是PDCD10抑制細胞失巢凋亡的結(jié)果；圖8是siRNA抑制MST4表達的結(jié)果；圖9是siMST4調(diào)節(jié)未過表達PDCD10和過表達PDCD10細胞增殖的MTT實驗結(jié)果；圖10是siMST4對PDCD10誘導(dǎo)的失巢凋亡抑制現(xiàn)象的影響結(jié)果；圖11是雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析PDCD10和MST4對ERK MAPK通路的作用的結(jié)果圖12是PDCD10、MST4及其二者相互作用對不同MAPK通路激酶磷酸化的Western Blot結(jié)果；圖13是MST4的RNAi對未過表達PDCD10和過表達PDCD10細胞ERK激酶活性的抑制實驗結(jié)果；圖14MST4體外激酶活性實驗結(jié)果。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。但這些實例僅限于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例1PDCD10在多種腫瘤細胞系中的表達研究按常規(guī)方法培養(yǎng)細胞，利用TRIZOLTM試劑提取細胞總RNA，利用Invitrogen公司的SuperScript II試劑盒合成單鏈cDNA，PCR檢測；提取培養(yǎng)細胞的蛋白，常規(guī)方法進行SDS-PAGE和Western印記。
PCR利用如下PDCD10特異引物上游引物ATGAGGATGACAATGGAAGAGATG(SEQ ID NO1)下游引物TCAGGCCACAGTTTTGAAGGT(SEQ ID NO2)及內(nèi)參GAPDH特異引物上游引物CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA(SEQ ID NO3)下游引物TCTAGACGGCAGGTCAGGTCAGGTCCACC(SEQ ID NO4)圖1A顯示在mRNA水平上，PDCD10在多種腫瘤細胞系中都有表達。圖1B顯示在蛋白水平，PDCD10在除HepG2以外的多種腫瘤細胞系中都有表達實施例2酵母雙雜交實驗將PDCD10構(gòu)建于pGBK-RC誘餌載體中，和上海睿星公司含有1500個已知與細胞凋亡、增殖和細胞周期有關(guān)的基因文庫的靶載體共轉(zhuǎn)化酵母Y190，并于SD/-T-L-H培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所得陽性酵母克隆中的質(zhì)粒被提取，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌，PDCD10釣得的靶蛋白包括MST4和YSK1。
實施例3免疫共沉淀分析
1過表達蛋白的免疫共沉淀構(gòu)建N端帶有c-Myc標簽的MST4、YSK1和N端帶有FLAG標簽的PDCD10于pCDEF載體中。測序鑒定DNA插入片斷正確。采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法將標簽標記的重組子瞬時轉(zhuǎn)染到HEK293細胞，轉(zhuǎn)染48小時后用PBS洗滌細胞三次，刮下培養(yǎng)細胞，離心500g，5分鐘。細胞團塊在4℃條件下于細胞裂解液中裂解，并用針頭反復(fù)吹打。裂解物經(jīng)離心(20分鐘，14,000×g，4℃)，其上清液與12.5μl抗c-Myc或抗FLAG M2親和瓊脂糖混合并孵育過夜(4℃)。離心(5分鐘，700×g)收集免疫吸附物，用裂解液洗滌三次(5分鐘，700×g)，再用含0.1％(w/v)SDS和150mM NaCl的50mM Tris(pH7.5)洗滌兩次。將樣品用60μl的SDS上樣緩沖液洗脫。以抗myc抗體和抗Flag抗體做Western印記，作檢測。圖2A顯示帶Flag標簽的PDCD10和帶myc標簽的MST4、YSK1在293T細胞中都表達，而且證明帶myc標簽的MST4或YSK1可將帶Flag標簽的PDCD10沉淀下來，提示在哺乳動物細胞中二者能夠相結(jié)合。
2內(nèi)源性蛋白的免疫共沉淀將1×107HeLa細胞懸浮于0.5ml裂解液(50mMTris，pH 8，0.4％Nonidet P-40，300mM NaCl，10mM MgCl2，2.5mM CaCl2)中，裂解液中含蛋白酶抑制劑(無EDTA)和DNase(10U/ul)，冰上孵育10分鐘。留出十分之一體積裂解物作為對照直接用于Western印記，其余進行免疫共沉淀。用小鼠抗PDCD10單抗和兔抗MST4抗體分別進行免疫共沉淀。免疫沉淀用Protein G磁珠40℃孵育2小時，用洗滌液(50mMTris，pH 8，150mM NaCl，5mM MgCl2，0.4％Nonidet P-40)洗三次。結(jié)合的蛋白進行SDS-PAGE，常規(guī)Western印記。圖2B顯示PDCD10和MST4在Hela細胞中都表達，而且證明在生理條件下二者存在相互作用。
實施例4PDCD10與MST4在Hela細胞中的激光共聚焦亞細胞共定位1過表達PDCD10與過表達MST4在Hela細胞中的激光共聚焦亞細胞共定位用pEGFP-C3-PDCD10和pDsred-N1-MST4瞬時轉(zhuǎn)染細胞，將細胞鋪于蓋玻片培養(yǎng)24小時。熒光顯微鏡觀察前，細胞被固定(室溫30分鐘，3％(wt/vol)PFA)，淬滅(10分鐘，50mM氯化銨)和滲透化(5分鐘，0.1％(vol/vol)Triton X-100)。所有溶液用PBS制備。蓋玻片浸于含10％(wt/vol)Moviol 4-88，1μg/ml DAPI，10％(wt/vol)甘油的PBS中。激光共聚焦顯微鏡觀察。圖3A和圖3B為同一視野不同倍數(shù)的觀察圖像，綠色為pEGFP-C3-PDCD10，紅色為pDsred-Nl-MST4，融合圖像顯示二者皆表達于細胞漿，而且共定位。
2內(nèi)源性PDCD10與MST4在Hela細胞中的激光共聚焦亞細胞共定位將細胞鋪于蓋玻片培養(yǎng)24小時。熒光顯微鏡觀察前，細胞被固定，淬滅和滲透化處理。依次用抗PDCD10抗體、FITC標記的羊抗鼠IgG、抗MST4抗體和TRITC標記的牛抗兔IgG染色。激光共聚焦顯微鏡觀察。圖3C為內(nèi)源性蛋白定位圖像，綠色為PDCD10，紅色為MST4，顯示二者皆表達于細胞漿，而且共定位。
實施例5siRNA抑制PDCD10表達的結(jié)果1PDCD10的siRNA的設(shè)計，以下為所采用的siRNA的序列siPDCD10-1 AGCGUGGAAGUUAACUUCA(SEQ ID NO5)siPDCD10-2 GGCAAUAAAUGUGUUCGUA(SEQ ID NO6)GFP siRNAGCAAGCUGACCCUGAAGUUC(SEQ ID NO7)Non-silencing siRNA UUCUCCGAACGUGUCACGU(SEQ ID NO8)2RT-PCR檢測siRNA對內(nèi)源性PDCD10mRNA表達的影響利用TRIZOLTM試劑提取細胞總RNA，利用Invitrogen公司的SuperScriptII試劑盒合成單鏈cDNA。PCR利用如下PDCD10特異引物上游引物ATGAGGATGACAATGGAAGAGATG(SEQ ID NO1)下游引物TCAGGCCACAGTTTTGAAGGT(SEQ ID NO2)及內(nèi)參GAPDH特異引物上游引物CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA(SEQ ID NO3)下游引物TCTAGACGGCAGGTCAGGTCAGGTCCACC(SEQ ID NO4)圖4A顯示與對照和non-silencing組比較，siPDCD10-1使內(nèi)源性PDCD10mRNA表達略有下降，而siPDCD10-2幾乎完全抑制內(nèi)源性PDCD10mRNA表達。
3用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測siRNA對GFP-PDCD10表達的抑制效果細胞共轉(zhuǎn)染pEGFP-PDCD10質(zhì)粒和siRNAs，通過熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測綠色熒光強度，以確定siRNA對GFP-PDCD10表達的抑制效果。圖4B顯示在熒光顯微鏡下，與單獨轉(zhuǎn)染GFP-PDCD10對照組(a)和non-silencing組(b)比較，siPDCD10-1(d)、siPDCD10-2(e)和陽性對照GFP siRNA(c)對外源性GFP-PDCD10的表達都有明顯的抑制作用。圖4C顯示用流式細胞儀檢測熒光強度，與單獨轉(zhuǎn)染GFP-PDCD10對照和non-silencing組比較，siPDCD10-1、siPDCD10-2和GFP siRNA均明顯降低綠色熒光強度。
4Western印記檢測siRNA對內(nèi)源性PDCD10蛋白表達的影響提取non-silencing、siPDCD10-1、siPDCD10-2三組細胞的蛋白，用抗PDCD10抗體進行Western印記檢測。圖4D顯示，與non-silencing組比較，siPDCD10-1對內(nèi)源性PDCD10蛋白水平幾乎沒有影響，而siPDCD10-2顯著抑制內(nèi)源性PDCD10蛋白的表達，這一結(jié)果在HeLa和PC-3兩種細胞中是一致的。
實施例6PDCD10調(diào)節(jié)未過表達MST4和過表達MST4細胞增殖的MTT和H3-TdR1MTT法檢測細胞增殖將轉(zhuǎn)染了特定質(zhì)?；騭iRNA的細胞以1000細胞/孔的密度接種于96孔板，進行MTT分析.按照指定的時間點加入MTT溶液，反應(yīng)4-6小時，加入甲囋，570nm檢測吸光值。圖5A顯示，與pCDEF組比較，pCDEF-PDCD10組和pCDEF-MST4組都能促進細胞增殖，而共轉(zhuǎn)染pCDEF-PDCD10和pCDEF-MST4組促增殖效果尤為顯著，遠遠高于單獨轉(zhuǎn)染組。圖5C顯示，與轉(zhuǎn)染了pGC-non-silencing(將non-silencing siRNA插入pGC-U6載體構(gòu)建)組比較，pGC-PDCD10(將siPDCD10-2siRNA插入pGC-U6載體構(gòu)建)組可以顯著抑制細胞的增殖。圖5D顯示，與共轉(zhuǎn)染pCDEF和non-silencing siRNA對照組比較，共轉(zhuǎn)染pCDEF-MST4和non-silencingsiRNA組能促進細胞增殖，而共轉(zhuǎn)染siPDCD10-2和pCDEF-MST4組中因降低了PDCD10的水平則可抑制由過表達MST4引起的細胞增殖。
2[3H]-TdR摻入法檢測細胞增殖將轉(zhuǎn)染了特定質(zhì)粒或siRNA的細胞以1000細胞/孔的密度接種于96孔板，按指定時間點加入[3H]-TdR(購自Amersham Biosciences公司)，濃度為1μCi/ml，繼續(xù)培養(yǎng)6小時后，收集細胞至96-孔Filtermat上，MicroBeta Windows Workstation(Wallac)測定[3H]-TdR的摻入情況。圖5B顯示與pCDEF組比較，pCDEF-PDCD10組和pCDEF-MST4組的[3H]-TdR摻入值都有升高，而共轉(zhuǎn)染pCDEF-PDCD10和pCDEF-MST4組[3H]-TdR摻入值遠遠高于單獨轉(zhuǎn)染組，與MTT分析結(jié)果一致，促增殖效果肯定。
3克隆形成實驗將轉(zhuǎn)染了特定質(zhì)粒或siRNA的細胞以200或400個的密度接種于35毫米培養(yǎng)板，48小時后加入800μg/ml Geneticin，每三天換一次培養(yǎng)基。第15天，固定(用2％PFA/PBS)Geneticin抵抗細胞，結(jié)晶紫染色后計數(shù)。圖6顯示與pCDEF組比較，pCDEF-PDCD10組和pCDEF-MST4組的克隆形成數(shù)目都有升高，而共轉(zhuǎn)染pCDEF-PDCD10和pCDEF-MST4組克隆形成數(shù)目遠遠高于單獨轉(zhuǎn)染組(A為克隆計數(shù)柱形圖)；與轉(zhuǎn)染了pGC-non-silencing組比較，pGC-PDCD10組由于抑制了內(nèi)源性PDCD10表達，克隆形成數(shù)目顯著下降(B為克隆計數(shù)柱形圖)，從而印證了PDCD10的促增殖作用。
實施例7PDCD10抑制細胞失巢凋亡的結(jié)果失巢凋亡分析方法參照Frisch和Francis的報道(Frisch，S.M.，and Francis，H.Disruption ofepithelial cell-matrix interactions induces apoptosis.J.Cell Biol 124，619-626，1994).培養(yǎng)板用Poly-HEME(4mg/ml溶于乙醇)包被兩次，再用PBS充分浸洗。以各種質(zhì)粒和siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基，并鋪于用Poly-HEME包被過的培養(yǎng)板上。培養(yǎng)24小時以后，用PBS洗滌兩次，將細胞懸浮于200μl Annexin-V結(jié)合緩沖液(10mMHEPES，140mM NaCl，2mM MgCl2，5mM KCl，2.5mM CaCl2，pH 7.4)，與FITC標記的Annexin V孵育(避光，室溫，20分鐘)。加入400μl結(jié)合緩沖液并立即用FACS Calibur(1×104cells)和CELLQuest軟件分析。圖7顯示與野生型和pCDEF組比較，pCDEF-PDCD10組的細胞失巢凋亡率顯著下降；與轉(zhuǎn)染了pGC-non-silencing組比較，pGC-PDCD10組由于抑制了內(nèi)源性PDCD10表達，細胞失巢凋亡率顯著上升，由于失巢凋亡率下降顯示細胞惡性生長能力增強，從而印證了PDCD10的促增殖作用。B為失巢凋亡細胞百分數(shù)柱形圖。
實施例8siRNA抑制MST4表達的結(jié)果1MST4的siRNA的設(shè)計，以下為所采用的siRNA的序列siMST4-1GAAUAACAUAGCUGAUCCA(SEQ ID NO9)siMST4-2CCAGAUUGCUACCAUGCUA(SEQ ID NO10)siMST4-3AGAUUGCUACCAUGCUAAA(SEQ ID NO11)GFP siRNA GCAAGCUGACCCUGAAGUUC(SEQ ID NO7)Non-silencing siRNA UUCUCCGAACGUGUCACGU(SEQ ID NO8)2RT-PCR檢測siRNA對內(nèi)源性MST4mRNA表達的影響利用TRIZOLTM試劑提取細胞總RNA，利用Invitrogen公司的SuperScript II試劑盒合成單鏈cDNA。PCR利用如下引物
上游引物ATGGCCCACTCGCCGGTG(SEQ ID NO12)下游引物GGGGGATTCGTCTGCTGAACA(SEQ ID NO13)及內(nèi)參GAPDH特異引物上游引物CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA(SEQ ID NO3)下游引物TCTAGACGGCAGGTCAGGTCAGGTCCACC(SEQ ID NO4)圖8A顯示與對照和non-silencing組比較，siMST4-2顯著抑制內(nèi)源性MST4mRNA的表達，而siMST4-1、siMST4-3對MST4mRNA表達影響不大。
3用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測siRNA對GFP-MST4表達的抑制效果細胞共轉(zhuǎn)染pEGFP-MST4質(zhì)粒和siRNAs，通過熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測綠色熒光強度，以確定siRNA對GFP-MST4表達的抑制效果。圖8B顯示與單獨轉(zhuǎn)染GFP-MST4對照組(a)和non-silencing組(b)比較，siMST4-1(d)、siMST4-3(f)對外源性GFP-MST4的表達沒有明顯的抑制作用，而si MST4-2(e)和陽性對照GFPsiRNA(c)對外源性GFP-MST4的表達都有明顯的抑制作用。圖8C顯示用流式細胞儀檢測熒光強度，與non-silencing組比較，si MST4-2和GFP siRNA均明顯降低綠色熒光強度，而siMST4-1、siMST4-3組則無顯著變化。
4Western印記檢測siRNA對內(nèi)源性PDCD10蛋白表達的影響提取non-silencing、siMST4-1、siMST4-2、siMST4-3四組細胞的蛋白，用抗MST4抗體進行Western印記檢測。圖8D顯示，與non-silencing組比較，siMST4-1、siMST4-3對內(nèi)源性MST4蛋白水平幾乎沒有影響，而siMST4-2顯著抑制內(nèi)源性MST4蛋白的表達。
實施例9siMST4調(diào)節(jié)未過表達PDCD10和過表達PDCD10細胞增殖的MTT實驗結(jié)果將轉(zhuǎn)染了特定質(zhì)?；騭iRNA的細胞以1000細胞/孔的密度接種于96孔板，進行MTT分析.按照指定的時間點加入MTT溶液，反應(yīng)4-6小時，加入甲囋，570nm檢測吸光值。圖9A顯示，與轉(zhuǎn)染了non-silencing siRNA組比較，siMST4-1、siMST4-3組對細胞增殖的抑制效果不明顯；而siMST4-2組顯著抑制細胞增殖。圖9B顯示，與共轉(zhuǎn)染pCDEF和non-silencing siRNA對照組比較，共轉(zhuǎn)染pCDEF-PDCD10和non-silencing siRNA組能促進細胞增殖，而共轉(zhuǎn)染siMST4-2和pCDEF-PDCD10組中因降低了MST4的水平則可抑制由過表達PDCD10引起的細胞增殖。
實施例10siMST4對PDCD10誘導(dǎo)的失巢凋亡抑制現(xiàn)象的影響失巢凋亡分析方法同實施例6。圖10顯示與pCDEF組比較，pCDEF-MST4組的細胞失巢凋亡率顯著下降；與轉(zhuǎn)染了non-silencing siRNA組比較，抑制表達效果明顯的siMST4-2組細胞失巢凋亡率顯著上升，而抑制效果差的siMST4-1和siMST4-3組失巢凋亡率無顯著變化；與共轉(zhuǎn)染pCDEF-PDCD10和non-silencing siRNA組相比，共轉(zhuǎn)染pCDEF-PDCD10和siMST4-2組由于內(nèi)源性MST4表達被抑制，細胞失巢凋亡率也顯著上升。B為失巢凋亡細胞百分數(shù)柱形圖。
實施例11雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析PDCD10和MST4對ERK MAPK通路的作用過表達組用pRL-TK(海腎熒光素酶載體，作為熒光內(nèi)對照)、報告基因載體(螢火蟲熒光素酶載體)、Gal4-ELK1表達載體、陽性對照載體MEK1、目的基因載體pCDEF-PDCD10、pCDEF-MST4，pCDEF作為空白對照，轉(zhuǎn)染細胞；PDCD10抑制表達組用用pRL-TK(海腎熒光素酶載體，作為熒光內(nèi)對照)、報告基因載體(螢火蟲熒光素酶載體)、Gal4-ELK1表達載體，pGC-non-silencing、pGC-PDCD10轉(zhuǎn)染細胞；細胞培養(yǎng)24小時后加入分別ERK特異抑制劑PD98059(5mM)，p38MAPK抑制劑SB20219(10mM)，或JNK MAPK抑制劑JNK inhibitor II(0.1uM)，12小時后進行熒光素酶報告基因分析。圖11A顯示，與pCDEF作為空白對照組相比，過表達PDCD10或MST4可提高熒光素酶報告活性，共轉(zhuǎn)染二者對熒光素酶報告活性的提高尤為顯著；而且這種活性可被ERK特異抑制劑PD98059抑制，而不被p38MAPK抑制劑SB20219或JNK MAPK抑制劑JNK inhibitor II減弱，說明二者的相互作用影響ERK通路；圖11B顯示，與pGC-non-silencing組比較，pGC-PDCD10組由于抑制了內(nèi)源性PDCD10的表達，造成熒光素酶報告活性的下降。
實施例12PDCD10、MST4及其二者相互作用對不同MAPK通路激酶磷酸化的Western印記分析收集轉(zhuǎn)染了特定質(zhì)?；騭iRNA的細胞，按常規(guī)方法裂解細胞，提取蛋白質(zhì)，定量后用常規(guī)方法進行Western印記實驗。圖12A顯示，用抗磷酸化ERK抗體和抗非磷酸化ERK抗體檢測，與pCDEF組比較，pCDEF-PDCD10組和pCDEF-MST4組都能提高細胞中磷酸化ERK的水平，而共轉(zhuǎn)染pCDEF-PDCD10和pCDEF-MST4組提高效果尤為顯著，遠遠高于單獨轉(zhuǎn)染組，MEK1為陽性對照組。與轉(zhuǎn)染了non-silencing siRNA組比較，siPDCD10-2組磷酸化ERK的比例顯著降低，而抑制內(nèi)源性PDCD10表達效果差的siPDCD10-1組磷酸化ERK的比例無明顯變化。圖12B顯示，用抗磷酸化JNK抗體和抗非磷酸化JNK抗體檢測，除陽性對照MEKK組以外，圖中各組磷酸化JNK水平均無明顯差異。圖12C顯示，用抗磷酸化p38抗體和抗非磷酸化p38抗體檢測除陽性對照MEK3組以外，圖中各組磷酸化p38水平均無明顯差異。以上結(jié)果證實，PDCD10與MST4的相互作用是通過調(diào)控ERK MAPK通路實現(xiàn)的。
實施例13MST4的RNAi對未過表達PDCD10和過表達PDCD10細胞ERK激酶活性的抑制細胞轉(zhuǎn)染，蛋白質(zhì)提取，Western印記實驗按常規(guī)方法進行。圖13A顯示，用抗磷酸化ERK抗體和抗非磷酸化ERK抗體檢測，與轉(zhuǎn)染了non-silencing siRNA組比較，siMST4-2組磷酸化ERK的比例有所降低，而抑制內(nèi)源性MST4表達效果差的siMST4-1和siMST4-3組磷酸化ERK的比例無明顯變化。圖13B顯示，用抗磷酸化ERK抗體和抗非磷酸化ERK抗體檢測，與共轉(zhuǎn)染pCDEF與non-silencing siRNA組比較，共轉(zhuǎn)染pCDEF-PDCD10與non-silencing siRNA組、共轉(zhuǎn)染pCDEF-PDCD10與siMST4-1組、和共轉(zhuǎn)染pCDEF-PDCD10與siMST4-3組細胞中磷酸化ERK的水平都有顯著提高，而共轉(zhuǎn)染pCDEF-PDCD10和siMST4-2組由于siMST4-2有效抑制內(nèi)源性MST4表達，可以降低由于過表達PDCD10引起的磷酸化ERK的水平。
實施例14MST4體外激酶活性分析激酶活性分析用HTScanTMMst4激酶分析試劑盒(Cell signaling，Danvers，MA)，按照其實驗手冊完成。各種表達載體及siRNA轉(zhuǎn)染到HeLa細胞中，48小時以后，裂解細胞并以Protein G磁珠處理1小時，然后與抗PDCD10單克隆抗體4℃孵育2小時。免疫沉淀復(fù)合物與10U Mst4激酶，200uM冷的ATP，底物Ezrin(Thr567)/Radixin(Thr564)/Moesin(Thr558)生物素標記多肽，25℃孵育30分鐘，用等體積50mM EDTA終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物1∶4稀釋于包被緩沖液(0.05M NaHCO3，pH 8.6)而且包被一個預(yù)處理的ELISA板，37℃孵育1小時。棄包被液，用PBST(PBS/0.05％Tween 20)洗兩次，加入抗磷酸化Ezrin(Thr567)/Radixin(Thr564)/Moesin(Thr558)多肽的一抗(1∶1000稀釋于1％BSA/PBST)，每孔100μL，37℃孵育1小時。洗滌五次，ELISA板加入HRP標記的抗兔IgG抗體(1∶10000稀釋于1％BSA/PBST)，每孔100μl，37℃孵育1小時。洗滌五次，每孔加50μl TMB底物(TMB Substrate Kit，Pierce)。室溫顯色10分鐘后450nm檢查吸光值。圖14顯示，與pCDEF組比較，pCDEF-PDCD10組能顯著增強MST4的激酶活性；與non-silencingsiRNA組比較，siPDCD10-2組可以降低MST4的激酶活性，而基本不能抑制內(nèi)源性PDCD10表達的siPDCD10-1組MST4的激酶活性無變化。
權(quán)利要求
1.一種用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤的藥物的組合產(chǎn)品，其特征在于，所述組合產(chǎn)品包含以下組成部分重組的或天然的PDCD10分子，重組的或天然的Ste20家族激酶分子，Ste20家族激酶分子的天然底物或人工合成底物。
2.如權(quán)利要求1所述的用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤的藥物的組合產(chǎn)品，其特征在于，其具體形式為檢測試劑盒。
3.如前述任一權(quán)利要求所述的用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤的藥物的組合產(chǎn)品，其特征在于，其還包含ATP、抗Ste20家族激酶分子的天然底物或人工合成底物磷酸化形式的抗體。
4.如前述任一權(quán)利要求所述的用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤的藥物的組合產(chǎn)品，其特征在于，其還包含選自激酶反應(yīng)緩沖液、酶標記的二抗、顯色底物、其它反應(yīng)緩沖液中的一種或幾種。
5.如前述任一權(quán)利要求所述的用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤的藥物的組合產(chǎn)品，其特征在于，所述重組的或天然的Ste20家族激酶分子為重組的或天然的MST4分子。
6.如權(quán)利要求5所述的用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤的藥物的組合產(chǎn)品，其特征在于，所述Ste20家族激酶分子的天然底物或人工合成底物為人工合成底物Ezrin(Thr567)/Radixin(Thr564)/Moesin(Thr558)生物素標記多肽。
7.重組的或天然的PDCD10分子與重組的或天然的Ste20家族激酶在篩選待篩選的抑制細胞增殖藥物或抗腫瘤藥物中的用途。
8.權(quán)利要求7所述的用途，其中所述的抑制細胞增殖或抗腫瘤藥物包括蛋白、多肽、天然藥物、化學(xué)合成藥物以中草藥提取物。
9.一種用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤藥物的方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟1)獲得重組的或內(nèi)源性表達的PDCD10分子；2)獲得重組的或內(nèi)源性表達的Ste20激酶家族分子；3)將獲得的PDCD10分子和Ste20激酶家族分子在體外與ATP、Ste20激酶家族分子的作用底物、待篩選藥物混合反應(yīng)；4)終止反應(yīng)，檢測Ste20家族激酶的表達或/和活性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤的藥物的組合產(chǎn)品，其具體形式可以為檢測試劑盒，該組合產(chǎn)品包含以下組成部分重組的或天然的PDCD10分子，重組的或天然的Ste20家族激酶分子，Ste20家族激酶分子的天然底物或人工合成底物。本發(fā)明還公開了一種重組的或天然的Ste20家族激酶在篩選待篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤的藥物中的用途。此外，本發(fā)明還提供一種用于篩選抑制細胞增殖或抗腫瘤的藥物的方法。
文檔編號C12Q1/48GK101050473SQ20071006378
公開日2007年10月10日 申請日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日
發(fā)明者趙紅珊, 馬曦, 馬大龍, 陳英玉, 張穎妹, 陳瑤瑤 申請人:北京大學(xué)