專利名稱：抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體及其應(yīng)用，更具體地說是抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體、其核苷酸序列及含有該核苷酸的載體，屬于分子生物學領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin Receptor，TfR)是一種跨膜糖蛋白，由兩個相同亞基組成同源二聚體，通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白的相互作用介導鐵的吸收。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在脊椎動物的具核細胞中表達，尤其富含于血腦屏障、胎盤組織和代謝旺盛、需要大量鐵的腫瘤細胞及一些快速分裂的細胞表面，是血腦屏障和腫瘤定向轉(zhuǎn)運的重要靶標。
血腦屏障由腦毛細血管內(nèi)皮細胞、基底膜和神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成，其顯著特點是腦毛細血管內(nèi)皮細胞連接緊密，除氣體分子和水分子外，限制了絕大多數(shù)物質(zhì)的入腦。近年來蛋白質(zhì)、多肽、多聚寡核苷酸等腦治療藥物(如芋螺毒素)的研究發(fā)展迅速，其中許多大分子具有很好的療效，但因血腦屏障的屏蔽無法進入腦中發(fā)揮作用，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的瓶頸。目前臨床上多應(yīng)用鞘內(nèi)或腦室穿刺直接給藥以繞過血腦屏障，或采用滲透壓休克法可逆性打開血腦屏障，這些方法技術(shù)要求高，副作用大，易造成顱內(nèi)感染。近年有文獻報道位于腦毛細血管內(nèi)皮細胞壁上的某些特異性受體能介導大分子藥物的轉(zhuǎn)運，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體、血管緊張素II受體、白介素受體I等，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和胰島素受體的轉(zhuǎn)運能力最強。但內(nèi)源性轉(zhuǎn)鐵蛋白在血中的含量很高，與受體的結(jié)合近于飽和，胰島素又會引起血糖的降低，因此轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素自身并不適于作為轉(zhuǎn)運載體。由于抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體或抗胰島素受體抗體與受體的結(jié)合位點不同于轉(zhuǎn)鐵蛋白或胰島素與受體的結(jié)合位點，在轉(zhuǎn)運中可避免競爭性抑制，將這些抗體作為腦轉(zhuǎn)運載體與外源藥物相連接，經(jīng)受體介導的胞吞胞吐作用，已將多種藥物轉(zhuǎn)運到了腦組織中。成功報道的例子有抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體OX26、128.1和抗胰島素受體的單克隆抗體83-14等。Pardridge WM的小組將ox26-BDNF化學交聯(lián)產(chǎn)物應(yīng)用于大鼠缺血性腦梗塞的治療，在永久性中腦動脈閉塞后，ox26-BDNF復(fù)合物5ug/rat和50ug/rat尾靜脈給藥，腦梗塞面積分別減少了43％和65％。這種受體介導的血腦屏障轉(zhuǎn)運載體特異性強、轉(zhuǎn)運效率高、安全性好，為大分子藥物跨血腦屏障的研究提供了新途徑。
除在血腦屏障富含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體外，作為腫瘤細胞表面特異性抗原，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體也受到了許多研究者的重視。他們發(fā)現(xiàn)腫瘤快速增殖過程中對鐵需求旺盛，使轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在許多腫瘤細胞中過表達。相對這些受體在正常組織中不表達或甚少表達，且在外周血中不存在的特性，將抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體與堿性磷酸酶、核素等偶聯(lián)，可用于腫瘤的定位診斷；與化療藥物、細胞毒素、酶解前藥等連接，還可用于腫瘤的定向治療。文獻報道將轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體與表阿霉素或卡鉑偶聯(lián)后，動脈插管灌注或局部注射治療晚期惡性腫瘤(肝癌、肺癌、胃癌、腸癌、卵巢癌等)，取得了滿意療效。說明轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體-藥物偶聯(lián)物對腫瘤有較好的靶向性，可進一步提高腫瘤的局部用藥濃度，增強殺傷腫瘤細胞能力。同時轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體-藥物偶聯(lián)物很少被人體正常組織細胞攝取，故可適當降低化療藥物的毒副作用。
一方面抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體在血腦屏障和腫瘤靶向轉(zhuǎn)運中有良好的應(yīng)用前景。另一方面現(xiàn)有的OX26抗體為小鼠抗大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體，其免疫原性和動物種屬選擇性較強，不能在人體應(yīng)用；128.1是小鼠抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體，鼠源抗體作為異源蛋白在人體內(nèi)應(yīng)用會受到限制如誘發(fā)鼠抗人抗體(HAMA)的生成、鼠源性Fc段不能有效發(fā)揮人源性Fc段的功能、鼠源性抗體的生物半衰期短等。即使進行人源化改造，仍會保留一定的鼠源序列，難以徹底解決抗體的免疫原性問題。且抗體人源化改造費時、費力，改造后往往親和活性降低，特異性下降。因此直接制備特異性的人源抗體具有重要的研究意義。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種特異性的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體。
本法明要解決的另一個技術(shù)問題是提供含有該人源抗體核苷酸序列的載體。
本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體的用途。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案 抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體H67，具有序列表SEQ ID No.1所示的單鏈抗體(single-chain variable fragment，scFv)的氨基酸序列。
MASYELTQPPSVSVAPGQTARITCSGDALGNKYASWYQQKPGQAPVLVIYEDSKRPSGIPERFSGSNSGNTA TLTISGTQAEDEADYYCSSGDSPCRAFGGGTKLTVLGSGGSTITSYNVYYTKLSSSGSEVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCARHSIYRCFFAVWGQGTLVTVSS。
單鏈抗體輕重鏈之間以linker相連接(序列中的下劃線處)，以確保VL和VH連接后形成正確的三維折疊，保持其全長抗體的結(jié)合活性。該linker通常為10-55個氨基酸殘基，優(yōu)化地，該linker為10-30個氨基酸殘基。該linker的另一個例子可以是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。
所述抗體還可以是Fab抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體或全抗體。
現(xiàn)已知抗體多樣性主要取決于CDRs的多樣性，CDRs的多樣性又以CDR3的多樣性為主。隨著對人類抗體胚系基因序列的深入了解，人們發(fā)現(xiàn)這些抗體胚系基因中有一些框架的使用頻率要遠高于其他框架。本發(fā)明使用的抗體庫PHB-pIX-scFv就是基于此種思路設(shè)計的，其輕重鏈的CDR1和CDR2區(qū)分別采用固定的氨基酸序列，在輕鏈CDR3區(qū)設(shè)計為使用頻率較高的Vκ1和Vλ3框架，重鏈CDR3區(qū)采用使用頻率較高的VH3框架，CDR3區(qū)的設(shè)計既保留個別關(guān)鍵位置上的固定氨基酸殘基，又充分考慮滿足多樣性的需要，構(gòu)建的全合成噬菌體單鏈抗體庫庫容量達到1.82×1010(新型pIX噬菌體展示系統(tǒng)的建立及初步評價，王雙；孫志偉；杜威世；張錦超；俞煒源；軍事醫(yī)學科學院院刊，2005，548)。
單鏈抗體(scFv)是用基因工程方法構(gòu)建的一種抗體片段，由抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一連接肽連接而成的重組蛋白，約為完整抗體分子的六分之一。
Fab抗體是由Fd(重鏈VH+CH1)和完整輕鏈組成的抗體片段，兩者通過一個鏈間二硫鍵連接，形成異二聚體，約為完整抗體分子的三分之一，有一個抗原結(jié)合位點。
雙鏈抗體(diabody)由兩個單鏈抗體組成，也稱二價二聚體。雙鏈抗體具有兩條鏈，每條鏈含有一個與VL結(jié)構(gòu)域連接的VH結(jié)構(gòu)域。接頭要足夠短，以防止同一條鏈上的結(jié)構(gòu)域之間配對，以促使不同鏈上的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而再現(xiàn)兩個抗原結(jié)合位點。上述肽接頭包括至少4個氨基酸和不多于10個的氨基酸，例如，(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)，(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2。上述雙鏈抗體的結(jié)構(gòu)是剛性而緊密的?？乖Y(jié)合位點位于該分子相對的兩端。雙鏈抗體可以如下表示VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH，或VL-L1-VH-L2-VH-L1-VL，或VH-L1-VL-L2-VH-L1-VL，或VH-L1-VL-L2-VL-L1-VH。
三鏈抗體(triabody)是指由三個單鏈抗體組成的三價三聚體，是通過VL或VH結(jié)構(gòu)域的氨基端直接與VH或VL羧基端融合而構(gòu)建的，即無任何接頭序列。三體含有三個Fv頭部，其多肽以環(huán)形、頭尾連接的方式排列。三鏈抗體的一個例子為VL-L1-VH-VL-L1-VH-VL-L1-VH。
全抗體是指用基因工程方法構(gòu)建的包括兩個輕鏈和兩個重鏈的完整IgG抗體分子。
編碼抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體H67的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.2所示的堿基序列。
含有編碼抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體H67的核苷酸序列的表達載體。該表達載體能夠表達靶向血腦屏障或腫瘤細胞的轉(zhuǎn)運載體(即抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體)。轉(zhuǎn)運載體能將化學藥物、蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸、包裹藥物的脂質(zhì)體、納米粒等運載入腦或腫瘤細胞。
含有編碼抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體H67核苷酸序列的載體，該載體為原核表達載體pET-22b(+)，其5’端為T7啟動子，3’端帶有6個His(組氨酸)的標簽。包含pET-22b-H67的大腸桿菌保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center，CGMCC，北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100080，電話010-62542758)，保藏日為2007年2月8日，保藏號為CGMCC No.1941。建議的分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli。誘導表達條件為20℃，0.5mmol/L IPTG，16小時。
抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體H67具有靶向轉(zhuǎn)運治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或腫瘤藥物的用途。H67是能夠靶向血腦屏障或腫瘤細胞的抗體，能將化學藥物、蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸、包裹藥物的脂質(zhì)體、納米粒等運載入腦或腫瘤細胞，具有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或腫瘤的用途。
本發(fā)明選擇的檢測標簽可以是E.tag標簽(Amersham pharmacia公司)，其核苷酸序列是ACGCGGTTCCAGAGGATCAGGATACGGCACCGGCGCACC(SEQ ID No.3)。
抗體與芋螺毒素SO3之間以linker相連接，以確保兩者連接后形成正確的三維折疊，保持各自的生物學活性。該linker的一個例子可以是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。
本發(fā)明利用人轉(zhuǎn)鐵蛋白從人源全合成噬菌體單鏈抗體庫PHB-pIX-scFv中篩選抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體H67，將抗體基因插入原核表達載體pET-22b(+)中，在大腸桿菌中進行了可溶表達。單鏈抗體經(jīng)純化后尾靜脈注射小鼠，于腦組織中檢測到了抗體的存在。單鏈抗體與不能透過血腦屏障的芋螺毒素SO3在大腸桿菌中融合表達后尾靜脈注射小鼠，試驗顯示小鼠的疼痛域值明顯提高，說明SO3在抗體的轉(zhuǎn)運下通過血腦屏障，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮了鎮(zhèn)痛作用。此外該單鏈抗體與人宮頸癌Hela細胞和人肝細胞癌Hep G2細胞的ELISA試驗也顯示，抗體可與腫瘤細胞特異性結(jié)合。上述抗體可用作將化學藥物、蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸、包裹藥物的脂質(zhì)體、納米粒等運載入腦或腫瘤細胞的轉(zhuǎn)運載體。
本發(fā)明所述的抗體可以通過如下步驟生產(chǎn)或鑒定 1.設(shè)計適當?shù)囊?，從富含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的組織細胞中提取RNA，通過RT-PCR擴增人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的胞外區(qū)基因。獲得的基因測序正確后插入有關(guān)載體表達?；蛘咄ㄟ^制備轉(zhuǎn)鐵蛋白-Sepharose 4B親和層析柱的方法，從富含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的組織細胞裂解液中親和層析純化蛋白。肽指紋圖譜分析驗證所得蛋白。
2.將以上兩種途徑獲得的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體包被免疫管，對人源PHB-pIX-scFv噬菌體抗體庫進行篩選，對獲得的陽性克隆測序。
3.以測序后的陽性噬菌體單鏈抗體基因或其序列為模板，采用PCR或人工合成單鏈抗體基因的方法獲得帶有相應(yīng)酶切位點的單鏈抗體基因，并在其3’端插入特定檢測標簽，克隆入相應(yīng)表達載體中誘導表達，該表達載體可以是pET-22b(+)載體。純化抗體并測定親和力常數(shù)。用不同細胞系的人腫瘤細胞包被酶聯(lián)板，ELISA試驗檢測抗體與腫瘤細胞的結(jié)合活性?？贵w對腦的體內(nèi)靶向活性可通過如下試驗證實將純化的抗體尾靜脈注射小鼠，一定時間后取鼠腦剝離腦毛細血管，將腦實質(zhì)勻漿后用抗標簽的抗體進行Western Blot分析，以檢測單鏈抗體在腦實質(zhì)中的存在。
4.利用PCR的方法將上述單鏈抗體VH和VL之間的linker縮短到5-10個氨基酸，插入相應(yīng)載體中表達雙鏈抗體或是直接去除VH和VL之間的linker，插入載體表達三鏈抗體。以上表達載體可以是pET-22b(+)載體。利用PCR的方法擴增抗體重鏈的Fd段，與VL一起分別插入Fab表達載體中表達，該表達載體可以是pComb3載體。將抗體重鏈的Fd段和VL分別插入全抗體表達載體上，即可表達全抗體IgG，該表達載體可以是pAC-L-Fc載體。將以上表達產(chǎn)物純化后采用(3)中的方法檢測抗體與腫瘤細胞的結(jié)合活性。剝離腦毛細血管，檢測抗體在腦實質(zhì)中的存在。
5.為了驗證上述抗體是否能介導大分子物質(zhì)入腦，表達抗體與芋螺毒素SO3的融合蛋白。純化融合蛋白后將其尾靜脈注射小鼠，熱板法實驗檢測融合蛋白對小鼠的鎮(zhèn)痛作用，以此判斷抗體對SO3的靶向轉(zhuǎn)運作用。
本發(fā)明的優(yōu)點是人源抗體與之前的鼠源抗體和人源化抗體相比，解決了靶向抗體的免疫原性問題，使其在人體能夠長期反復(fù)給藥，有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明采用的從大容量抗體庫中篩選基因工程抗體的方法相對于單克隆抗體制備容易，易于大規(guī)模生產(chǎn)，抗體分子小，能夠深入組織內(nèi)部，具有明顯的優(yōu)勢。本發(fā)明采用的pET-22b(+)載體，含有較強的T7啟動子，可保證靶向抗體有較高的表達水平。20℃，0.5mmol/L IPTG，16小時的誘導表達條件使目的蛋白主要以易形成正確折疊的可溶形式表達，蛋白活性較高。pET-22b(+)載體3’端帶有6個His(組氨酸)的標簽，可方便的使用Ni-NTA agarose進行親合層析純化。
下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明，本發(fā)明的實施方式并不限于此，凡是根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容或原理，實施的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。



圖1為用基因工程方法表達的人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體胞外區(qū)蛋白的肽質(zhì)量檢測圖譜。
圖2為從胎盤中純化的人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白的肽質(zhì)量檢測圖譜。
圖3為ELISA試驗檢測噬菌體抗體與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合活性的圖。
圖4為pET-22b-H67重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中可溶表達的SDS-PAGE圖1.蛋白分子量Marker；2.pET-22b/BL21(DE3)重組菌表達上清；3.pET-22b-H67/BL21(DE3)重組菌表達上清。
圖5為Western Blot檢測腦組織中的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體的圖1.陽性對照(純化的H67-E.tag)；2.腦毛細血管；3.腦實質(zhì)；4.陰性對照(未注射H67-E.tag的腦實質(zhì))。
圖6為pET-22b/H67-SO3重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中可溶表達的SDS-PAGE圖1.蛋白分子量Marker；2.pET-22b/BL21(DE3)重組菌表達上清；3.4.pET-22b-H67-SO3/BL21(DE3)重組菌表達上清。
圖7為熱板法檢測H67-SO3、H67、SO3、生理鹽水以尾靜脈及腦室給藥時對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)鎮(zhèn)痛作用的圖1.H67-SO3融合蛋白(尾靜脈5ug/g小鼠，腦室700ng/只小鼠)；2.SO3(尾靜脈0.4ug/g小鼠，腦室60ng/只小鼠)；3.H67(尾靜脈5ug/g小鼠，腦室700ng/只小鼠)；4.生理鹽水(尾靜脈5ug/g小鼠，腦室700ng/只小鼠)。

具體實施例方式 下文列出的實施例是為幫助對發(fā)明的理解，并不應(yīng)被理解為用來在任何方面限制本發(fā)明的范圍。實施例不包括對常規(guī)方法的描述，如那些構(gòu)建載體和質(zhì)粒的方法，將基因插入載體或?qū)①|(zhì)粒導入宿主細胞的方法、噬菌體抗體庫的呈現(xiàn)、輔助噬菌體的制備、IPTG誘導表達、SDS-PAGE電泳方法、培養(yǎng)基配制等。這些方法對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是眾所周知的，并在許多出版物中都有描述，包括J薩姆布魯克，D.W.拉塞爾。2002，《分子克隆實驗指南(第三版)》。
實施例1基因工程方法表達人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體胞外區(qū)蛋白 一.TfR胞外區(qū)基因的克隆 許多腫瘤細胞表面富含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，用TRIzol試劑(Invitrogen公司，照說明書操作)從人宮頸癌HeLa細胞(中國科學院上海細胞庫)中提取總RNA。根據(jù)人TfR的基因序列設(shè)計引物，F(xiàn)W為5′-GAATTCATGTTATATTGGGATGACCTG-3′(SEQ IDNo.4)；RV為5′-CCGCTCGATTTAGTGATGGTGATGGTGATGAAACTC ATTGTCAATGTC-3′(SEQID No.5)，RT-PCR擴增人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的胞外區(qū)基因。
反轉(zhuǎn)錄基因的反應(yīng)體系為10μ LRNA中加入5.0μL RV(10mmol/L)，混勻后于70℃靜置5min，冰浴，加入以下成分5μL M-MLV RT 5×buffer、2.5μL dNTP(10mmol/L)、1.0μL RNas in 30U/μL、1.0μL M-MLV 200U/μL及0.5μL DEPC水，總體積為25μL?；靹蚝笥?2℃靜置1h。
PCR反應(yīng)體系為5μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、各2.0μL FW和RV(均為10mmol/L)、2.0μL dNTP(2mmol/L)、Taq plus DNA聚合酶反應(yīng)10×buffer 2.0μL、0.2μL Taqplus DNA聚合酶(5U/uL)及6.8μL H2O，總體積為20μL。
反應(yīng)條件為95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃2min，共30個循環(huán)，再于72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳分析可見一1.9kb的條帶。PCR產(chǎn)物回收后連接到pGEM-T載體上測序。
二.TfR胞外區(qū)基因的表達及純化、復(fù)性 測序正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I從pGEM-T載體(Promega公司)上切下目的基因片段，將之與經(jīng)相同酶切的pPROEXTMHTa載體(GibcoBRL公司)連接，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(華美生物公司)。1mmol/L IPTG 20℃誘導表達重組菌過夜，SDS-PAGE電泳可見一70kd的表達條帶。檢測到目的蛋白表達后，放大體積表達重組菌，超聲破碎后，以5000r/min離心10min，收集上清，再以12000r/min離心30min，取沉淀分別用1mL/L Triton X-100及2mol/L鹽酸胍(溶解在PBS緩沖液中)進行懸浮、洗滌并離心。沉淀用6mol/L鹽酸胍溶解后，于4℃放置過夜。取出，以12000r/min離心30min，將上清加入到用6mol/L鹽酸胍平衡的Ni-NTA agarose(Amersham pharmacia公司)親合層析柱中純化。通過線性梯度將鹽酸胍的濃度降到零，使表達的包涵體蛋白在柱上復(fù)性。最后用含0.5mol/L咪唑的PBS將目的蛋白洗下。
三.轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的鑒定 將純化得到的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體超濾脫咪唑后SDS-PAGE電泳，將電泳后的凝膠置于明亮燈光白色背景上用修剪過的Eppendorf吸頭(直徑約1.5mm)戳取出蛋白質(zhì)點，放入預(yù)先加好50μL脫色液(25mmol/L NH4HCO3，50％乙氰)的0.25mL離心管。室溫放置30分鐘，吸去脫色液，更換1-2次脫色液直到膠塊無色透明。抽真空離心干燥30分鐘左右，至白色顆粒狀。加入2μL溶于20mmol/L碳酸氫銨的胰蛋白酶(濃度為10ng/uL)，4℃吸脹1小時，吸去多余的酶液，將管子倒置，37℃空氣浴10-12小時。加入8μL 5％三氟乙酸，37℃溫育1小時，將液體吸凈，轉(zhuǎn)移至一干凈的離心管中，再加入8μL 2.5％三氟乙酸/50％乙氰，30℃溫育1小時，吸出液體與前一次合并。抽真空離心干燥肽段提取液進行肽質(zhì)量圖譜的分析。將所得的肽質(zhì)量圖譜數(shù)據(jù)進行分析，確認該蛋白為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。圖1是用以上方法獲得的人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體胞外區(qū)蛋白的肽質(zhì)量檢測圖譜。
實施例2從胎盤中純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 一.樣品制備 人新鮮胎盤(濕重500g)去除臍帶和膜后，切成小塊，PBS清洗后，在11的PBS中勻漿。10,000g離心20min，收集沉淀。用PBS重懸后，繼續(xù)勻漿，離心。重復(fù)3次，以除去內(nèi)源性的轉(zhuǎn)鐵蛋白。將沉淀溶解于800mL PBS(含2％Triton X-100，1mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟))中，攪拌1h，然后超聲破碎40分鐘，以釋放膜蛋白。10,000g離心30min，收集上清，用于親和層析。以上操作均在4℃進行。
二.轉(zhuǎn)鐵蛋白受體-Sepharose 4B親和層析柱的制備 按照說明書，將人轉(zhuǎn)鐵蛋白以5mg蛋白/mL濕膠的比例連接到溴化氰活化的Sepharose 4B(Sigma公司)上。用0.1mol/L碳酸氫氨(含有1.0g/L檸檬酸鐵銨)平衡，使轉(zhuǎn)鐵蛋白充分結(jié)合Fe3+。此時柱材料由不含鐵時的白色變?yōu)楦缓F的鮭肉粉紅色。再用PBS(含0.5％Triton X-100)平衡，洗去富余的檸檬酸鐵銨。
三.純化 以1mL/min的流速將樣品上柱后，用以下溶液進行順序平衡(每種溶液至少用5個柱體積)①PBS，0.2％CHAPS(3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-1-丙磺酸)；②50mmol/L檸檬酸鈉pH 4.9，100mmol/L NaCl，2g/L CHAPS，1mmol/L去鐵胺；③50mmol/L HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)pH 7.5，100mmol/L NaCl，2g/L CHAPS。用50mmol/L HEPES pH 7.5，100mmol/LNaCl，2g/L CHAPS，2mol/L KCl洗脫，使轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白分離。
將以上步驟純化得到的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體超濾脫鹽后SDS-PAGE電泳，在90kd處可見兩條蛋白條帶出現(xiàn)。這兩條均為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，只是由于微觀修飾的不均一性而造成分子量的差別。將純化產(chǎn)物進行肽指紋圖譜的分析，確認為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。圖2是該純化蛋白的肽質(zhì)量檢測圖譜。
實施例3抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體的篩選 一.噬菌體抗體庫的篩選 分別以從胎盤中提取的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和表達的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體胞外區(qū)蛋白各10μg包被免疫管于4℃過夜，2g/L BSA 37℃封閉2h后，加入1mL人源PHB-pIX-scFv噬菌體抗體庫溶液(庫容1010cfu/L)(孫志偉博士惠贈。新型pIX噬菌體展示系統(tǒng)的建立及初步評價。王雙；孫志偉；杜威世；張錦超；俞煒源；軍事醫(yī)學科學院院刊，2005，548)，于37℃孵育2h。用PBS(含1mL/L Tween20)洗20次，每次5min。然后加入1mL 0.2mol/L Gly-HCl(pH2.2)，室溫振蕩10min后，用1mol/L Tris將pH中和到7.0左右。將中和后的溶液轉(zhuǎn)移到有9mL OD600＝0.5的大腸桿菌XL1-Blue(華美生物公司)的試管中，同時于免疫管中加入1mL OD600＝0.5的大腸桿菌XL1-Blue。兩管同時于37℃靜置20min后，于30℃以150r/min振搖培養(yǎng)1h。取少許大腸桿菌XL1-Blue涂平板計算克隆數(shù)；其余全部用于鋪板，于37℃培養(yǎng)過夜。次日，將平板上的菌落刮下，取1％接種于100mL 2×YT培養(yǎng)基中。待生長至OD600＝0.5時，加入輔助噬菌體M13K07(Amresco公司)至終濃度為4×109pfu/mL，于30℃振搖(150r/min)培養(yǎng)過夜。經(jīng)PEG沉淀后，用于第2輪的篩選。第3輪篩選時，用5μg TfR包被免疫管，以PBST洗20次后，加入1.5mol/L硫氰酸銨振蕩洗10min，以洗去親和力較低的抗體，其余操作同前。
二.噬菌體單克隆抗體的制備 挑取單個菌落接種于2mL 2×YT(含50mg/L氯霉素及10mg/L四環(huán)素)培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.5時，加入輔助噬菌體M13K07(Amresco公司)，再于37℃靜置20min。于30℃振搖(150r/min)培養(yǎng)1h后，加入卡那霉素至終濃度為50mg/L，于30℃培養(yǎng)過夜。次日，離心收集上清，即為噬菌體單克隆抗體，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 三.噬菌體ELISA 以從胎盤中提取的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2μg包被酶聯(lián)板于4℃過夜，2g/L BSA 37℃封閉2h；甩去封閉液，加入預(yù)先用1％BSA及0.1％Tween 20處理過的單克隆抗體，37℃溫育2h；PBS洗3min×3次，加入HRP標記的抗M13噬菌體抗體(Amresco公司)(1∶5000稀釋)，37℃溫育1h；PBS洗3min×3次，滴加HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(中山生物公司)(1∶4000稀釋)，37℃溫育1h；PBS洗3min×3次，底物OPD顯色，待充分顯色后用1mol/L H2SO4終止顯色，在492nm波長讀取吸收值。對獲得的陽性克隆測序后進行序列分析。圖3是ELISA試驗檢測噬菌體抗體與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合活性的圖。
實施例4抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體的表達及活性鑒定 一.單鏈抗體基因的獲得 1.PCR方法從噬菌體抗體中擴增單鏈抗體基因 以上游引物FW’5’-ACGCGTCGACTAATGGCCAGCTACGAACTG-3’(SEQ ID No.6)和下游引物RV’5’-TTGCGGCCGCACGCGGTTCCAGAGGATCAGGATACGGCACCGGCGCACCAAGCTTGCTCGACACGGTCACCAG-3’(SEQ ID No.13)為引物，以2號陽性單克隆噬菌體抗體所提取的質(zhì)粒為模板，擴增抗體基因，并將該抗體命名為H67。上游引物中加入Sal I位點，下游引物中加入Not I位點及E.tag標簽。
PCR反應(yīng)體系為模板1μL、上下游引物各3μL(均為10mmol/L)、5μL dNTP(2mmol/L)、Pfu DNA聚合酶反應(yīng)10×buffer 10μL、2μL Pfu DNA聚合酶(5U/mL)及76μL H2O，總體積為100μL。
反應(yīng)條件為95℃3min，94℃30s，65℃30s，72℃2min，30個循環(huán)，再于72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳分析可見800bp大小條帶。
2.人工合成單鏈抗體基因 按照序列表SEQ ID No.2所示的堿基序列分段合成單鏈抗體基因。共分18段合成，其中片段1-17每段合成長度60bp，片段18長度67bp。每段基因首尾各有20bp的序列相互重疊搭橋，以利于PCR過程中片段的延伸。以下是合成的18段序列 NO1 atggccagct acgaactgac ccagccgccg agcgtgtcgg tggcgccggg tcagaccgcg NO2 tggcgccggg tcagaccgcg cgtatcacct gctcgggcga tgcgctgggc aataaatacg NO3 tgcgctgggc aataaatacg cgagctggta tcagcagaaa ccgggtcagg caccggtgct NO4 ccgggtcagg caccggtgct ggtgatttac gaagattcta aacgcccgtc tggcatcccg NO5 aacgcccgtc tggcatcccg gaacgcttta gcggctcgaa ttcgggcaac accgcgaccc NO6 ttcgggcaac accgcgaccc tgaccattag cggcacccag gcggaggatg aggcggacta NO7 gcggaggatg aggcggacta ttactgctcg tcgggtgata gtccgtgtcg ggcgtttggc NO8 gtccgtgtcg ggcgtttggc ggtggcacca aactgaccgt gctgggcagc ggcggctcga NO9 gctgggcagc ggcggctcga ccataacttc gtataatgta tactatacga agttatcgag NO10 tactatacga agttatcgag ctcgggcagc gaagtgcaat tggtggaaag cggtggcggt NO11 tggtggaaag cggtggcggt ctggtgcagc cgggtggcag cctgcgtctg agctgcgcag NO12 cctgcgtctg agctgcgcag cgagcggctt cacctttagc agctacgcga tgagctgggt NO13 agctacgcga tgagctgggt gcgccaggca ccgggtaaag gtctggaatg ggtgagcgcg NO14 gtctggaatg ggtgagcgcg attagcggta gcggcggcag cacctactat gcggatagcg NO15 cacctactat gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatc tcgcgtgata actcgaaaaa NO16 tcgcgtgata actcgaaaaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgcg tgcggaagat NO17 acagcctgcg tgcggaagat accgcggtgt attattgcgc acgtcattct atttatcggt NO18 acgtcattct atttatcggt gttttttcgc tgtctggggt cagggcactc tggtgaccgtgtcgagc 設(shè)計了4對引物，其中FW’、P2用于片段F1的擴增，P3、P4用于片段F2的擴增，P5、P6用于片段F3的擴增，P7、RV’用于片段F4的擴增。
FW’5’ACGCGTCGACTAATGGCCAGCTACGAACTG 3’(SEQ ID No.6) 與片段1的5’端序列相同，含有Sal I位點及啟始密碼子。
P25’TAGTCCGCCTCATCCTCCGCC 3’(SEQ ID No.7) 與片段6的3’端序列互補。
P35’AACGCCCGTCTGGCATCCCGG 3’(SEQ ID No.8) 與片段5的5’端序列相同。
P45’ACCGCCACCGCTTTCCACCAA 3’(SEQ ID No.9) 與片段10的3’端序列互補。
P55’GCTGGGCAGCGGCGGCTCGAC 3’(SEQ ID No.10) 與片段9的5’端序列相同 P65’CGCTATCCGCATAGTAGGTGC 3’(SEQ ID No.11) 與片段14的3’端序列互補。
P75’AGCTACGCGATGAGCTGGGTG 3’(SEQ ID No.12) 與片段13的5’端序列相同 RV’5’TTGCGGCCGCACGCGGTTCCAGAGGATCAGGATACGGCACCGGCGCACCAAGCTTGCTCGACACGGTCACCAG 3’(SEQ ID No.13) 與片段18的3’端序列互補，含有Not I位點及E.tag標簽，無終止密碼子。
①片段F1、F2、F3、F4的擴增 以片段NO1……NO6為模板，F(xiàn)W’、P2為引物擴增片段F1；NO5……NO10為模板，P3、P4為引物擴增片段F2；NO9……NO14為模板，P5、P6為引物擴增片段F3；片段NO13……NO18為模板，P7、RV’為引物擴增片段F4。反應(yīng)條件每個模板濃度0.02mol/L，引物濃度50pmol/L。94℃30s，58℃30s，72℃30s，10個循環(huán)，94℃30s，68℃30s，72℃30s，20個循環(huán)。
②片段F1-2和F3-4的擴增 F1、F2、F3、F4純化后各取1ul稀釋20倍。以F1、F2的稀釋產(chǎn)物各2ul為模板，F(xiàn)W’、P4為引物，擴增片段F1-2；F3、F4的稀釋產(chǎn)物各2ul為模板，P5、RV’為引物，擴增片段F3-4。反應(yīng)條件94℃30s，72℃40s，7個循環(huán)。添加引物各1ul，94℃30s，65℃30s，72℃40s，28個循環(huán)。
③scFv全長基因的獲得 PCR產(chǎn)物F1-2和F3-4純化后各取1ul稀釋20倍為模板，F(xiàn)W’、RV’為首尾引物，擴增scFv全長基因。反應(yīng)條件94℃ 30s，72℃ 40s，7個循環(huán)。添加引物各1ul，94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 40s，28個循環(huán)。
二.表達載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達 用Sal I及Not I雙酶切PCR產(chǎn)物和pET-22b(+)載體(Novagen公司)，電泳純化、回收抗體基因和線性化的載體，T4DNA連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)16小時后，挑取單克隆進行酶切鑒定并測序。測序正確后，將重組質(zhì)粒pET-22b-H67轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于含Amp+的LB培養(yǎng)基中生長過夜，然后以2％的接種量轉(zhuǎn)接于500mL含有Amp+的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，20℃誘導16小時。離心收集菌體進行SDS-PAGE分析，可見33kd的目的蛋白條帶。圖4是pET-22b-H67重組質(zhì)粒在大腸桿菌中可溶表達的SDS-PAGE圖。
三.表達產(chǎn)物的純化 收集的菌體重懸于50mL PBS中，置于冰上超聲破碎。12000r/min離心30分鐘，取上清加入咪唑至終濃度為50mmol/L。用Ni-NTA agarose親和柱對上清進行純化。純化的抗體超濾去除咪唑后，測定蛋白濃度。
四.抗體親和力的測定 具體操作按照《抗體工程》(董志偉，王琰主編)一書中第280頁進行，測得抗體H67的親和力常數(shù)為Ka＝4.8×10-7moL/L。
實施例5抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體雙鏈抗體的表達 一.Diabody基因的獲取 以單鏈抗體基因為模板，利用PCR的方法獲得diabody基因。合成的兩個中間引物分別為RV-linker5’-GCT TTC CAC CAA TTG CAC TTC CGA GCC GCC GCT GCCCAG CAC-3’(SEQ ID No.14)以及FW-linker5’-GAA GTG CAA TTG GTG GAA AGC-3’(SEQ ID No.15)。VL和VH之間的linker可以為4-10個氨基酸，其核苷酸序列可以是AGCGGCGGCTCG。
擴增兩小片段基因的反應(yīng)體系為pET-22b-H67質(zhì)粒1μL、FW’(實施例4)和RV-linker，F(xiàn)W-linker和RV’(實施例4)引物各4.0μL(均為10mmol/L)、dNTP(2mmol/L)2.0μL、Pfu DNA聚合酶10×buffer 2.0μL、Pfu DNA聚合酶(5U/mL)0.2μL及H2O 6.8μL，總體積為20μL。
反應(yīng)條件為95℃ 5min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min；共30個循環(huán)；于72℃再延伸10min。分別回收PCR產(chǎn)物，以兩個片段基因為模板，以FW’和RV’為引物擴增全長基因。全長區(qū)基因的反應(yīng)體系同前，反應(yīng)條件為95℃ 5min，94℃30s，65℃30s，72℃2min，30個循環(huán)，再于72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳分析可見800bp大小條帶。
二.表達載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達 用Sal I及Not I雙酶切PCR產(chǎn)物和pET-22b(+)載體，電泳純化、回收抗體基因和線性化的載體，T4DNA連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)16小時后，挑取單克隆進行酶切鑒定并測序。測序正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于含Amp+的LB培養(yǎng)基中生長過夜，然后以2％的接種量轉(zhuǎn)接于500mL含有Amp+的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，20℃誘導16小時。離心收集菌體進行SDS-PAGE分析，可見33kd的目的蛋白條帶。
三.表達產(chǎn)物的純化 收集的菌體重懸于50mL PBS中，置于冰上超聲破碎。12000r/min離心30分鐘，取上清并加入咪唑至終濃度為50mmol/L。用Ni-NTA agarose親和柱進行純化。
實施例6單鏈抗體(scFv)的活性鑒定 一.ELISA試驗檢測表達抗體與腫瘤細胞的結(jié)合活性 將人宮頸癌Hela細胞、人肝細胞癌HepG2細胞(中國科學院上海細胞庫)分別稀釋到5×104細胞/ml，每孔接種100μL至96孔細胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)24h；棄去上清，PBS洗3min×3次，加入4℃預(yù)冷的甲醇∶丙酮固定10min；棄去固定液，PBS洗3min×3次，每孔加入100uL阻斷液(10mL PBS，100uL 30％H2O2)，室溫30min，去除內(nèi)源性過氧化氫酶活性；棄去阻斷液，PBS洗3min×3次，滴加2％BSA 37℃封閉2h；甩去封閉液，加入純化后的H67，37℃溫育2h；PBS漂洗，由于抗體表達時在C端插入了E.tag標簽，檢測時加入抗E.tag抗體(Amershampharmacia公司)(1∶5000稀釋)，37℃溫育1h；PBS漂洗，滴加HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(中山生物公司)(1∶5000稀釋)，37℃溫育1h；PBS漂洗，底物OPD顯色，待充分顯色后用1mol/L H2SO4終止顯色，測定OD492。ELISA試驗顯示H67可與Hela細胞和HepG2細胞特異結(jié)合。
二.抗體對腦的靶向作用研究 scFv H67以2.0ug/g小鼠的劑量尾靜脈注射小鼠。1小時后，尾靜脈注入0.9％生理鹽水配制的戊巴比妥納(35ug/g小鼠)，使其麻醉。將主動脈阻斷，頸靜脈剪斷，從左心室注入冰預(yù)冷的PBS 20mL。取腦組織(2mL PBS/0.5g腦組織)，用玻璃勻漿器勻漿，取出一部分用于電泳分析，其余加入終濃度為26％的葡聚糖。充分混勻后，4℃ 5400g，離心15分鐘。沉淀為腦毛細血管，上清為腦組織。用裂解緩沖液(PBS，1％TritonX-100，0.1％SDS)裂解。取樣50uL，加入50uL 2×上樣緩沖液，開水中煮15分鐘。13000r/min離心1min，取上清用于蛋白電泳。轉(zhuǎn)膜(恒流，1mA/cm2PVDF膜)并用5％的脫脂奶粉封閉后，用抗E.tag的抗體(1∶1000稀釋)為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(1∶3000稀釋)為二抗，Western blot檢測目的蛋白，ECL顯色。圖5是Western Blot檢測腦組織中的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體的圖。結(jié)果顯示尾靜脈注射H67后，抗E.tag抗體在腦血管和腦實質(zhì)中分別檢測到了H67的存在，未注射抗體組抗E.tag抗體檢測陰性。
實施例7單鏈抗體H67與芋螺毒素SO3融合蛋白的表達及其對小鼠中樞鎮(zhèn)痛活性的研究 芋螺毒素(conotoxins，CTX)是來源于海洋芋螺(Conus)毒液的一類活性多肽，可用于某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。SO3是我們從南海線紋芋螺(Conus striatus)中發(fā)現(xiàn)的一種新的CTX(Lu Baisong，Yu Fang，Zhao Dong，Huang Peitang，HuangCuifen.Conopeptides from Conus Striatus and Conus Textile by cDNA cloning.peptides，1999，20(1)1139；-芋螺毒素SO3對大鼠慢性神經(jīng)痛鎮(zhèn)痛作用及對血清L6濃度影響。解放軍藥學學報。馮澤國，王紅，周曉巍，顏光濤，劉鳳云，周宏，黃培堂。2006，22(4)261)，含25個氨基酸殘基，與MVIIA同屬ω-CTX，兩者有7個氨基酸殘基的差異。SO3作為一種無成癮性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)陣痛劑有很好的應(yīng)用前景，但由于SO3是一種小肽，其自身無法通過血腦屏障，限制了SO3的用藥范圍。
一.重組質(zhì)粒pET-22b-H67-SO3的構(gòu)建 重組質(zhì)粒pET-22b-H67和pTIG-Trx-scFv(鼠源)-SO3(本實驗室制備。蔣世衛(wèi)，周曉巍，顏冰等。大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體和芋螺毒素SO3的融合蛋白在大腸桿菌中的表達。生物技術(shù)通訊，2005，16(1)16-18)用限制性內(nèi)切酶Hind III、Not I雙酶切，分別回收純化pET-22b-H67和SO3，將兩者4℃連接過夜后構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b-H67-SO3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。將菌落PCR鑒定為陽性的菌落進行測序。
二.融合蛋白在大腸桿菌中的表達及純化 將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于含Amp+的LB培養(yǎng)基中生長過夜，然后以2％的接種量轉(zhuǎn)接于500mL含Amp+的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，20℃誘導16小時。圖6是pET-22b-H67-SO3重組質(zhì)粒在大腸桿菌中可溶表達的SDS-PAGE圖。離心收集菌體重懸于50mL PBS中，置于冰上超聲破碎。12000r/min離心30分鐘，取上清，加入咪唑至終濃度為50mmol/L。用Ni-NTA agarose親和柱進行純化。純化的抗體超濾去除咪唑后，測定蛋白濃度。
三.融合蛋白對小鼠中樞鎮(zhèn)痛活性的研究 H67抗體具有腦靶向性，SO3具有中樞鎮(zhèn)痛作用，且只能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)才能發(fā)揮作用。因此當融合蛋白發(fā)揮了鎮(zhèn)痛作用時，可說明SO3在抗體的轉(zhuǎn)運下通過了血腦屏障。將純化、定量后的H67-SO3、H67、SO3、生理鹽水以尾靜脈及腦室兩種注射方法給藥。1小時后，用熱板法檢測SO3的鎮(zhèn)痛作用，記錄小鼠初次舔舐后足的時間。熱板法的方法是雌性小鼠，體重20g左右，隨機分組，每組10只。用大燒杯做熱板，置于55.0±0.5℃水浴中。以小鼠后足接觸熱板到舔后足為止的時間定為痛域。選擇反應(yīng)敏感而穩(wěn)定的小鼠用于實驗，比較給藥前后痛域的變化，痛域超過60秒的按60秒計。表1為H67-SO3、H67、SO3、生理鹽水以尾靜脈及腦室給藥時的劑量。圖7是熱板法檢測H67-SO3、H67、SO3、生理鹽水以尾靜脈及腦室給藥時對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)鎮(zhèn)痛作用的圖。
表1 H67-SO3、H67、SO3、生理鹽水尾靜脈、腦室給藥劑量

序列表
<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所
<120>抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體及其應(yīng)用
<130>
<160>14
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>249
<212>PRT
<213>人工合成
<220>
<221>linker
<222>(110)..(130)
<400>1
Met Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro
1 5 10 15
Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asn Lys
20 25 30
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Gly Asp Ser Pro Cys
85 90 95
Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Ser Thr Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys Leu Ser Ser Ser
115 120 125
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
180 185 190
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
195 200 205
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Arg His Ser Ile Tyr Arg Cys Phe Phe Ala Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210>2
<211>747
<212>DNA
<213>人工合成，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體的單鏈抗體(scFv)
<400>2
atggccagct acgaactgac ccagccgccg agcgtgtcgg tggcgccggg tcagaccgcg 60
cgtatcacct gctcgggcga tgcgctgggc aataaatacg cgagctggta tcagcagaaa 120
ccgggtcagg caccggtgct ggtgatttac gaagattcta aacgcccgtc tggcatcccg 180
gaacgcttta gcggctcgaa ttcgggcaac accgcgaccc tgaccattag cggcacccag 240
gcggaggatg aggcggacta ttactgctcg tcgggtgata gtccgtgtcg ggcgtttggc 300
ggtggcacca aactgaccgt gctgggcagc ggcggctcga ccataacttc gtataatgta 360
tactatacga agttatcgag ctcgggcagc gaagtgcaat tggtggaaag cggtggcggt 420
ctggtgcagc cgggtggcag cctgcgtctg agctgcgcag cgagcggctt cacctttagc 480
agctacgcga tgagctgggt gcgccaggca ccgggtaaag gtctggaatg ggtgagcgcg540
attagcggta gcggcggcag cacctactat gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatc600
tcgcgtgata actcgaaaaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgcg tgcggaagat660
accgcggtgt attattgcgc acgtcattct atttatcggt gttttttcgc tgtctggggt720
cagggcactc tggtgaccgt gtcgagc747
<210>3
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成的E.tag標簽
<400>3
acgcggttcc agaggatcag gatacggcac cggcgcacc 39
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<212>DNA
<213>人工合成
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gaattcatgt tatattggga tgacctg27
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<212>DNA
<213>人工合成
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ccgctcgatt tagtgatggt gatggtgatg aaactcattg tcaatgtc 48
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<212>DNA
<213>人工合成
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acgcgtcgac taatggccag ctacgaactg 30
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<212>DNA
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tagtccgcct catcctccgc c 21
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<212>DNA
<213>人工合成
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aacgcccgtc tggcatcccg g21
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accgccaccg ctttccacca a21
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<212>DNA
<213>人工合成
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gctgggcagc ggcggctcga c21
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cgctatccgc atagtaggtg c21
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agctacgcga tgagctgggt g 21
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<212>DNA
<213>人工合成
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ttgcggccgc acgcggttcc agaggatcag gatacggcac cggcgcacca agcttgctcg60
acacggtcac cag 73
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<212>DNA
<213>人工合成
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gctttccacc aattgcactt ccgagccgcc gctgcccagc ac 42
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<212>DNA
<213>人工合成
<400>15
gaagtgcaat tggtggaaag c2權(quán)利要求
1. 抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體，具有序列表SEQ ID No.1所示的單鏈抗體(scFv)氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體，其特征在于所述抗體還可以是Fab抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體或全抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體，其特征在于所述Fab抗體是由Fd和完整輕鏈組成的抗體片段，兩者通過一個鏈間二硫鍵連接，形成異二聚體，約為完整抗體分子的三分之一，有一個抗原結(jié)合位點。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體，其特征在于所述雙鏈抗體由兩個單鏈抗體組成，每條鏈含有一個與VL結(jié)構(gòu)域連接的VH結(jié)構(gòu)域。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體，其特征在于所述三鏈抗體是指由三個單鏈抗體組成的三價三聚體，通過VL或VH結(jié)構(gòu)域的氨基端直接與VH或VL羧基端融合而構(gòu)建，無任何接頭序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體，其特征在于所述全抗體是指用基因工程方法構(gòu)建的包括兩個輕鏈和兩個重鏈的完整IgG抗體分子。
7. 編碼抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.2所示的堿基序列。
8. 含有編碼抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體的核苷酸序列的載體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的含有編碼抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體的核苷酸序列的載體，其特征在于所述載體為原核表達載體，含有該載體的菌株保藏號為CGMCCNo.1941。
10. 抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體具有靶向轉(zhuǎn)運治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或腫瘤藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體及其應(yīng)用，屬于分子生物學領(lǐng)域?？谷宿D(zhuǎn)鐵蛋白受體人源抗體，具有序列表SEQ ID No.1所示的單鏈抗體(scFv)氨基酸序列。本發(fā)明的優(yōu)點是人源抗體解決了靶向抗體的免疫原性問題，使其能夠在人體長期反復(fù)給藥；本發(fā)明采用的從大容量抗體庫中篩選基因工程抗體的方法相對于單克隆抗體制備容易，易于大規(guī)模生產(chǎn)，抗體分子小，能夠深入組織內(nèi)部，具有明顯的優(yōu)勢。本發(fā)明采用的pET-22b(+)載體，含有較強的T7啟動子，可保證靶向抗體有較高的表達水平。優(yōu)化后的誘導表達條件，使抗體以可溶形式被表達，蛋白活性較高。pET-22b(+)載體3’端帶有6個His(組氨酸)的標簽，可方便的使用Ni-NTAagarose進行親合層析純化。
文檔編號C12N15/63GK101245107SQ20071006390
公開日2008年8月20日 申請日期2007年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月14日
發(fā)明者冰 顏, 黃培堂, 趙莉霞 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所