專利名稱：篩選高繁殖力山羊的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選高繁殖力山羊的方法及其專用引物，特別是涉及一種利用山羊抑制素βB亞基基因的單核苷酸多態(tài)性篩選高繁殖力山羊的方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
抑制素(Inhibin，INH)是一種主要由雌性動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞和雄性動(dòng)物睪丸支持細(xì)胞分泌的糖蛋白激素，對(duì)垂體FSH的合成和分泌進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)(Mason A J，Hayflick J S，Ling N，Esch F，Ueno N，Ying S Y，Guillemin R，Niall H，SeeburgP H.Complementary DNA sequences of ovarian follicular fluid inhibin showprecursor structure and homology with transforming growthfactor-beta.Nature，1985，318(6047)659～663.)。抑制素是一種由不同亞基(包括α、βA、βB)組成的二聚體，把α亞基和βA亞基構(gòu)成的抑制素稱為抑制素A(inhibinA，INHBA)；α亞基和βB亞基構(gòu)成的抑制素稱為抑制素B(inhibin B，INHBB)。研究表明，對(duì)于成年男性，INHBB是唯一能被檢測(cè)到的抑制素，血液中INHBB的水平反映了睪丸支持細(xì)胞的數(shù)量和功能。血清INHBB水平能較靈敏地反映睪丸疾病或精子發(fā)生障礙(王國洪.抑制素測(cè)定的臨床意義.標(biāo)記免疫分析與臨床.2004，11(4)238～239.)；對(duì)于女性，INHBB與卵巢儲(chǔ)備有關(guān)，它可反映與年齡有關(guān)的卵子質(zhì)量下降，且與受精后胚胎評(píng)分顯著相關(guān)(Chang C L，Wang T H，Horng S G.The concentrationof inhibin B in follicular fluidrelation to oocyte maturation and embryodevelopment.Human Reproduction，2002，17(17)1724～1728.)。此外，抑制素免疫能顯著提高山羊的受精率和產(chǎn)羔數(shù)。山羊抑制素B基因已被定位到染色體2q31→q33(Hiendleder S，Dodds K G，Wassmuth R.Linkage mapping of the ovine α-inhibin(INHA)，βA-inhibin/activin(INHBA)and βB-inhibin/activin(INHBB)genes.J Hered，2000，91(4)343～345.)。目前，已發(fā)現(xiàn)綿羊INHBB基因具有遺傳多態(tài)性(Hiendleder S，Dodds K G，Wassmuth R.Linkage mapping of the ovineα-inhibin(INHA)，βA-inhibin/activin(INHBA)and βB-inhibin/activin(INHBB)genes.J Hered，2000，91(4)343～345.)，但有關(guān)山羊INHBB基因的多態(tài)性研究國內(nèi)外還未見報(bào)道。
據(jù)《中國羊品種志》記載，濟(jì)寧青山羊是我國繁殖力最高的山羊品種，平均產(chǎn)活羔數(shù)為2.94，內(nèi)蒙古絨山羊平均產(chǎn)活羔數(shù)為1.04，安哥拉山羊基本產(chǎn)單羔(《中國羊品種志》編寫組.中國羊品種志.上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1988，88～90，98～100.)。
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP檢測(cè)方法常采用一些已有的成熟技術(shù)，如DNA測(cè)序、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)及等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等。具體采用哪一種方法，需要結(jié)合靶序列的特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)條件來確定。
日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同，因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。將SSCP用于檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因突變而建立的PCR-SSCP技術(shù)，進(jìn)一步提高了基因突變檢測(cè)方法的便捷性和靈敏性。
PCR-SSCP技術(shù)(Orita M，Iwahana H，Kanazawa H.Detection of polymorphismsof human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformationalpolymorphisms.Proc Natl Acad Sci USA.1989，862766-2770.；Orita M，SuzukiY，Sekiya T，et al.A rapid and sensitive detetion of point mutation and geneticpolymorphism using polymerase chain reaction.Genomics.1989，5874-879.)是檢測(cè)DNA突變最為直觀而精確的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段之一，該方法對(duì)長度在100-300bp之間的DNA片段突變檢測(cè)的靈敏度可達(dá)100％，結(jié)合序列分析，可做到對(duì)大批量樣品的目的DNA片段的“全掃描”分析，不僅成本低，而且自動(dòng)化程度較高，因此，在進(jìn)行基因診斷和多態(tài)性分析，包括單核苷酸多態(tài)(SNP)的檢測(cè)中，PCR-SSCP技術(shù)不失為一種準(zhǔn)確、快速、簡便、經(jīng)濟(jì)的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用山羊抑制素βB亞基基因的單核苷酸多態(tài)性篩選高繁殖力山羊的方法及其專用引物。
本發(fā)明所提供的用于篩選高繁殖力山羊的引物，是由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)。
序列表中的序列3由20個(gè)堿基組成，序列表中的序列4由18個(gè)堿基組成。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種篩選高繁殖力山羊的方法。
本發(fā)明所提供的篩選高繁殖力山羊的方法，是以待測(cè)山羊的基因組DNA為模板，在由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增片段自5’端第259位堿基(即INHBB基因自外顯子2(exon 2)第259位堿基，INHBB基因組基因自5’端第840位堿基)為A、G還是N，N為A和G的雜合體；所述擴(kuò)增片段自5’端第259位堿基為A時(shí)，其純合體的基因型為AA；所述擴(kuò)增片段自5’端第259位堿基為G時(shí)，其純合體的基因型為BB；它們的雜合體基因型為AB；所述AA基因型山羊的繁殖能力高于AB和BB基因型山羊，AB基因型山羊的繁殖能力又高于BB基因型山羊。
所述待測(cè)山羊的基因組DNA的來源是廣泛的，可以從血液(新鮮或冷凍)、精液(新鮮或冷凍)、組織樣品(如耳組織等)或含有毛囊的羊毛樣品中提取。
其中，以25μl總體積為例，PCR反應(yīng)體系包括50ng/μl模板DNA 3.0μL，TaqDNA聚合酶1.0U，10pmol/L上、下游引物各2.0μl，dNTPs終濃度為200μmol/L，10×PCR緩沖液2.5μl，20mmol/L Mg2+1.5μL，用超純水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25μl。10×PCR緩沖液的組成是Tris·HCl(pH8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM。PCR反應(yīng)條件為先95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，59.5℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行31個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8min。
所述檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法可為對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀染顯色。具體方法可為取2μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入7μl上樣緩沖液(98％甲酰胺，0.025％溴酚藍(lán)，0.025％二甲苯氰，10mmol/L EDTA(pH8.0))，98℃變性10min后，冰浴8min，點(diǎn)樣，用10％非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染顯色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在3種不同基因型AA型、AB型和BB型，基因分型結(jié)果如圖2所示。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，AA基因型山羊的INHBB基因第2外顯子(exon 2)第259位堿基為A，BB基因型山羊的INHBB基因第2外顯子第259位堿基為G，AB基因型山羊的INHBB基因第2外顯子第259位堿基為N，所述AA基因型山羊的繁殖能力高于AB和BB基因型山羊，AB基因型山羊的繁殖能力又高于BB基因型山羊。
上述篩選方法的適用范圍是廣闊的，包括濟(jì)寧青山羊、內(nèi)蒙古絨山羊、安哥拉山羊、波爾山羊和文登奶山羊等任意山羊品種。
本發(fā)明提供了一種篩選高繁殖力山羊的方法及其專用引物。通過PCR-SSCP技術(shù)發(fā)現(xiàn)在生殖中起重要作用的抑制素βB亞基基因(inhibin βB，INHBB)的編碼區(qū)在高繁殖力山羊品種(濟(jì)寧青山羊)和低繁殖力山羊品種(內(nèi)蒙古絨山羊、安哥拉山羊)中存在單核苷酸多態(tài)性，同時(shí)以濟(jì)寧青山羊?yàn)槔迷摶虻亩鄳B(tài)性研究了其對(duì)濟(jì)寧青山羊高繁殖力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物對(duì)P2的擴(kuò)增片段具有多態(tài)性，P2擴(kuò)增片段在濟(jì)寧青山羊中檢測(cè)到AA、AB和BB 3種基因型，在內(nèi)蒙古絨山羊和安哥拉山羊中檢測(cè)到AB和BB兩種基因型(原因可能是樣本數(shù)量較少)，進(jìn)一步的測(cè)序分析結(jié)果表明BB基因型與AA基因型擴(kuò)增片段相比，在自5’端第840位堿基(即INHBB基因自外顯子2(exon 2)第259位堿基)處由堿基A突變G，并使得編碼的氨基酸殘基由組氨酸變?yōu)榫彼?。其中，?jì)寧青山羊AA、AB和BB基因型頻率分別為0.0685、0.500和0.4315。AA基因型濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值比AB基因型的多0.73只(P＜0.05)，比BB基因型的多0.84只(P＜0.05)；AB基因型濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值比BB基因型的多0.11只(P＞0.05)。上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明AA基因型山羊的繁殖能力顯著高于AB和BB基因型山羊，AB基因型山羊的繁殖能力又高于BB基因型山羊，故可初步認(rèn)為A等位基因可能具有增加山羊產(chǎn)羔數(shù)的作用，可利用山羊INHBB基因進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇來提高山羊的產(chǎn)羔數(shù)。本發(fā)明的方法及其專用引物將在高繁殖能力山羊的篩選中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為分別在引物對(duì)P1和P2引導(dǎo)下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖2為引物對(duì)P2對(duì)不同山羊品種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析結(jié)果圖3為AA和BB純合基因型山羊個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列比對(duì)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物合成及測(cè)序工作均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。
實(shí)施例1、用于篩選高繁殖力山羊的引物設(shè)計(jì)及PCR-SSCP分析一、引物設(shè)計(jì)根據(jù)Thompson等(Thompson D A，Cronin C N，Martin F.Genomic cloning andsequence analyses of the bovine alpha-，beta A- and beta B-inhibin/activingenes.Identification of transcription factor AP-2-binding sites in the5’-flanking regions by DNase I footprinting.Eur J Biochem，1994，226(3)751～764.)發(fā)表的牛抑制素βB亞基(INHBB)基因的外顯子2序列(GenBank登錄號(hào)為U16241)設(shè)計(jì)2對(duì)引物P1和P2，以擴(kuò)增INHBB基因外顯子2部分序列，這2對(duì)引物擴(kuò)增片段的預(yù)期大小分別為244bp、296bp，引物序列如下引物對(duì)P1F1(上游引物)5’-CGGGTCCGCCTGTACTTCTT-3’(序列表中序列1)；R1(下游引物)5’-CCTGGATGGGTTCGGTGAG-3’(序列表中序列2)。
引物對(duì)P2F2(上游引物)5’-CACCGGCTACTATGGGAACT-3’(序列表中序列3)；R2(下游引物)5’-ACTTGCCACACCCTGGTC-3’(序列表中序列4)。
二、PCR擴(kuò)增選擇具有頭3胎產(chǎn)羔數(shù)記錄的濟(jì)寧青山羊母羊，頸靜脈采血，所采血樣均為10mL/只，用檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃凍存。用酚氯仿抽提法提取血樣的基因組DNA，溶于TE緩沖液(10mmol/L Tris·HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0))，4℃保存。然后以所提取的不同血樣的基因組DNA為模板，分別在上述2對(duì)引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25μl PCR反應(yīng)體系為50ng/μl模板DNA 3.0μL，Taq DNA聚合酶(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)1.0U，10pmol/L上、下游引物各2.0μl，dNTPs(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)終濃度為200μmol/L，10×PCR緩沖液(Tris·HCl(pH8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM)2.5μl，20mmol/L Mg2+1.5μL，用超純水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25μl。PCR反應(yīng)條件為先95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，退火30s(引物對(duì)P1、P2的退火溫度分別為60.0℃、59.5℃)，72℃延伸30s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)2對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(泳道7-10引物對(duì)P1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道1-6引物對(duì)P2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道MSD002 Marker)，2對(duì)引物用于PCR擴(kuò)增都獲得了較好的效果，引物P1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為244bp，引物P2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為296bp，與預(yù)期結(jié)果一致，而且沒有非特異擴(kuò)增條帶，引物對(duì)P1的擴(kuò)增產(chǎn)物雖有拖尾帶但對(duì)進(jìn)行SSCP分析無影響，表明上述2對(duì)引物可以直接用于SSCP分析。
三、PCR-SSCP分析1、基因型檢測(cè)取具有頭3胎產(chǎn)羔數(shù)記錄的146只濟(jì)寧青山羊母羊血樣(采自農(nóng)業(yè)部濟(jì)寧青山羊保種基地(山東省嘉祥縣))，40只內(nèi)蒙古絨山羊母羊血樣(采自內(nèi)蒙古白絨山羊種羊場(chǎng)(內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克旗))和38只安哥拉山羊母羊血樣(采自山西省晉城市沁水示范牧場(chǎng)(山西省沁水縣鄭莊鎮(zhèn)))，然后提取血樣的基因組DNA，采血及DNA提取方法與步驟二相同，再分別在引物對(duì)P1和P2的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與步驟二相同。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，具體方法為取2μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入7μl上樣緩沖液(98％甲酰胺，0.025％溴酚藍(lán)，0.025％二甲苯氰，10mmol/L EDTA(pH8.0))，98℃變性10min后，冰浴8min，點(diǎn)樣，用非變性聚丙烯酰胺凝膠中4℃電泳分離，檢測(cè)這2對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度分別為8％(P1)、10％(P2)，聚丙烯酰胺凝膠交聯(lián)度為29∶1，電壓均為140V，電泳結(jié)束后銀染顯色，最后用AlphaImagerTM2200 and 1220Documentation and Analysis Systems(Alpha Innotech Corporation，San Leandro，CA，USA)拍照并對(duì)圖像進(jìn)行分析。
SSCP分析結(jié)果表明2對(duì)引物中只有引物對(duì)P2的PCR擴(kuò)增片段具有多態(tài)性，P1引物對(duì)的PCR擴(kuò)增片段不存在多態(tài)性，其中引物對(duì)P2對(duì)不同山羊品種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)存在3種不同基因型純合基因型AA(見圖2中的泳道9)，純合基因型BB(見圖2中的泳道2，3，4，6，7)和雜合基因型AB(見圖2中的泳道1，5，8，10)。
2、克隆測(cè)序?qū)Σ襟E1經(jīng)SSCP分析后的AA、BB 2種純合基因型個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA片段快速純化回收試劑盒(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)回收并純化，然后將回收后的DNA片段連接入載體pGEM-T Easy(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，用質(zhì)粒提取純化試劑盒(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后在3730(ABI)測(cè)序儀上測(cè)序。BB基因型擴(kuò)增片段具有序列表中序列5的核苷酸序列，AA基因型擴(kuò)增片段具有序列表中序列6的核苷酸序列，如圖3所示(箭頭指示突變堿基)，BB基因型擴(kuò)增片段與AA基因型擴(kuò)增片段相比，自外顯子2第259位堿基(即INHBB基因組基因自5’端第840位堿基)由堿基A突變?yōu)镚，并導(dǎo)致所編碼的氨基酸殘基由組氨酸殘基變?yōu)榫彼釟埢?，即AA基因型山羊的INHBB基因第2外顯子(exon 2)第259位堿基為A，BB基因型山羊的INHBB基因第2外顯子第259位堿基為G，AB基因型山羊的INHBB基因第2外顯子第259位堿基為N(N為A和G的雜合體)。
3、統(tǒng)計(jì)分析1、3個(gè)山羊品種中INHBB基因的等位基因頻率和基因型頻率統(tǒng)計(jì)根據(jù)步驟1和步驟2的檢測(cè)結(jié)果對(duì)INHBB基因第2外顯子在上述3個(gè)山羊品種(濟(jì)寧青山羊、內(nèi)蒙古絨山羊、安哥拉山羊)中的等位基因頻率和基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表1所示，表明山羊INHBB基因第2外顯子具有遺傳多態(tài)性，上述PCR-SSCP分析結(jié)果表明在濟(jì)寧青山羊中檢測(cè)到AA、AB、BB三種基因型，而在內(nèi)蒙古絨山羊和安哥拉山羊中沒有檢測(cè)到AA基因型，產(chǎn)生這些結(jié)果的原因可能是所檢測(cè)的樣本數(shù)較少。B等位基因頻率在濟(jì)寧青山羊、安哥拉山羊和內(nèi)蒙古絨山羊中較高，分別為0.6815、0.9500、0.7632。A等位基因頻率在內(nèi)蒙古絨山羊中較低，只有0.050。且經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)，引物對(duì)P2在三個(gè)不同品種山羊中的基因型χ2值都未達(dá)到顯著水平，即這三個(gè)不同品種山羊在基因座INHBB上都達(dá)到了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＞0.05)，說明INHBB基因的P2這對(duì)引物的擴(kuò)增片段不受選育措施的影響，在選育過程中它們的遺傳仍然是隨機(jī)的。
表1 3個(gè)山羊品種中INHBB基因的等位基因頻率和基因型頻率(括號(hào)內(nèi)的數(shù)字是個(gè)體數(shù))

2、濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)在INHBB各基因型之間的差異分析配合下列模型對(duì)步驟1和步驟2的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行最小二乘方差分析，比較濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)在INHBB各基因型之間的差異yijklm＝μ+Si+HYSj+Pk+Gl+eijklm其中yijklm為產(chǎn)羔數(shù)的記錄值；μ為群體平均值；Si為第i頭公畜的固定效應(yīng)；HYSj為第j個(gè)場(chǎng)年季的固定效應(yīng)；Pk為第k個(gè)胎次的固定效應(yīng)；Gl為INHBB基因第l種基因型的固定效應(yīng)；eijklm為隨機(jī)殘差效應(yīng)。統(tǒng)計(jì)分析用SAS(V8.12)軟件的GLM(General Linear Model)過程完成。
不同INHBB基因型的146只濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示，AA基因型濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值比AB基因型的多0.73只(P＜0.05)，比BB基因型的多0.84只(P＜0.05)；AB基因型濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值比BB基因型的多0.11只(P＞0.05)，即AA基因型山羊的繁殖能力高于AB和BB基因型山羊，AB基因型山羊的繁殖能力又高于BB基因型山羊。由上述結(jié)果可初步認(rèn)為A等位基因可能具有增加山羊產(chǎn)羔數(shù)的作用，可利用山羊INHBB基因進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇來提高山羊的產(chǎn)羔數(shù)。
上述分析結(jié)果表明，本發(fā)明的方法及其專用引物可用于篩選繁殖能力高的山羊。
表2 INHBB基因不同基因型濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤(具有不同字母肩標(biāo)的平均值之間差異顯著(P＜0.05))

序列表<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>1cgggtccgcc tgtacttctt 20<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>2cctggatggg ttcggtgag 19<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<230>
<400>3caccggctac tatgggaact 20<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>4acttgccaca ccctggtc18<210>5<211>296<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
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1.用于篩選高繁殖力山羊的引物，是由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)。
2.一種篩選高繁殖力山羊的方法，是以待測(cè)山羊的基因組DNA為模板，在由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增片段自5’端第259位堿基為A、G還是N，N為A和G的雜合體；所述擴(kuò)增片段自5’端第259位堿基為A時(shí)，其純合體的基因型為AA；所述擴(kuò)增片段自5’端第259位堿基為G時(shí)，其純合體的基因型為BB；它們的雜合體基因型為AB；所述AA基因型山羊的繁殖能力高于AB和BB基因型山羊，AB基因型山羊的繁殖能力又高于BB基因型山羊。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系包括50ng/μl模板DNA 3.0μl，Taq DNA聚合酶1.0U，10pmol/L上、下游引物各2.0μl，dNTPs終濃度為200μmol/L，10×PCR緩沖液2.5μl，20mmol/L Mg2+1.5μl，用超純水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25μl。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)條件為先95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，59.5℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行31個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的篩選方法，其特征在于所述山羊品種包括濟(jì)寧青山羊、內(nèi)蒙古絨山羊、安哥拉山羊、波爾山羊和文登奶山羊。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選高繁殖力山羊的方法及其專用引物。該引物是由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)。該方法是以待測(cè)山羊的基因組DNA為模板，在由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增片段自5’端第259位堿基為A、G還是N，N為A和G的雜合體；所述擴(kuò)增片段自5’端第259位堿基為A時(shí)，其純合體的基因型為AA；所述擴(kuò)增片段自5’端第259位堿基為G時(shí)，其純合體的基因型為BB；它們的雜合體基因型為AB；所述AA基因型山羊的繁殖能力高于AB和BB基因型山羊，AB基因型山羊的繁殖能力又高于BB基因型山羊。本發(fā)明的方法及其專用引物將在高繁殖能力山羊的篩選中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101029341SQ20071006535
公開日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2007年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月11日
發(fā)明者儲(chǔ)明星, 彭志蘭, 陳宏權(quán) 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所