專(zhuān)利名稱(chēng)：固定化酶催化合成egcg脂肪酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，特別是在非水相體系中用固定化微生物脂肪酶催化反應(yīng)合成EGCG脂肪酸酯的方法，屬于酶催化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
綠茶中的茶多酚因具有極強(qiáng)的自由基清除能力和抗氧化活性，在食品、化妝品等工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，是一種不可多得的天然抗氧化劑。同時(shí)，茶多酚具有防癌抗癌、抗衰老、抗輻射、降血糖、血脂等重要的生理藥理功能。茶多酚及其衍生物的開(kāi)發(fā)利用在國(guó)內(nèi)外引起了極大關(guān)注，多篇文獻(xiàn)和發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了其作為抗氧化劑、抗癌、抗病毒藥物的應(yīng)用。茶多酚中大部分為兒茶素，其中以表沒(méi)食子兒茶素-3-6-沒(méi)食子酸酯(EGCG)的含量為最高。然而，茶多酚較差的脂溶性使其應(yīng)用的范圍受到限制。通過(guò)改性的方式改變其溶解性、增強(qiáng)穩(wěn)定性可以有效提高其應(yīng)用面。改性方式可歸類(lèi)為溶劑法、乳化法和分子修飾法。大量的研究和應(yīng)用實(shí)踐表明溶劑法和乳化法存在很多的缺陷，如溶劑揮發(fā)、溶劑安全、穩(wěn)定性差的等。最直接有效的辦法是分子修飾法，就是在這些化合物中增加如脂肪酸或甘油酯等的親油部分，這樣可以顯著調(diào)節(jié)這些水溶性天然化合物的脂相溶解度，而且其產(chǎn)品也可以直接水解做進(jìn)一步代謝，其生物生理活性不受影響，而且可以引入有效的營(yíng)養(yǎng)成分(如多不飽和脂肪酸)。
國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有化學(xué)法改性茶多酚兒茶素的研究。如《精細(xì)化工》，19(2)，2002，通過(guò)茶多酚與脂肪酰氯反應(yīng)，制備了一系列含不同直鏈脂肪基團(tuán)的脂溶性茶多酚。表明當(dāng)脂肪鏈的碳原于數(shù)＞10時(shí)，脂溶性茶多酚在色拉油中的溶解度是茶多酚的2000倍以上。專(zhuān)利CN1197786A和CN1263083A報(bào)道的將水溶性茶多酚改性成脂溶性茶多酚，但由于反應(yīng)過(guò)程中的強(qiáng)酸性環(huán)境，無(wú)法控制諸如“紅粉”的縮合物生成，因而影響產(chǎn)品的抗氧化效果。專(zhuān)利CN1448395A報(bào)道采用碳酸氫鈉、碳酸氫鉀以及金屬催化劑，降低反應(yīng)溫度等方式解決以上的問(wèn)題。但化學(xué)合成普遍采用高溫、強(qiáng)氧化劑、強(qiáng)活性化學(xué)催化劑和化學(xué)試劑，例如以上的方法使用的脂肪酸酰氯性質(zhì)不穩(wěn)定，制備條件嚴(yán)苛復(fù)雜。特別是對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量不利，得率低，產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，反應(yīng)的選擇性不高，產(chǎn)物單體分離困難，生物生理活性可能喪失，甚至有毒害產(chǎn)品形成。
近20年來(lái)，非水相酶促合成有了長(zhǎng)足的發(fā)展，酶不僅可以應(yīng)用于水解，在非水相中也可以用于合成。酶法合成比化學(xué)法的專(zhuān)一性強(qiáng)，產(chǎn)物定向。而且酶的價(jià)格也隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展而顯著下降，使工業(yè)應(yīng)用不僅從量產(chǎn)而且從經(jīng)濟(jì)方面都成為可能。
脂肪酶，是一類(lèi)特殊的?；饷?，能在油-水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交換、內(nèi)酯合成、多肽合成、高聚物合成及立體異構(gòu)拆分等有機(jī)合成反應(yīng)。根據(jù)脂肪酶的催化機(jī)理第一步中，脂肪酶和?；孜镄纬梢粋€(gè)中間復(fù)合物；第二步，親核試劑(醇、水、胺類(lèi)等)進(jìn)攻中間復(fù)合物的?；?，形成產(chǎn)物，同時(shí)作為催化劑的酶重新釋放出來(lái)。
脂肪酶催化酯合成的研究多集中在直鏈醇和直鏈酸之間的反應(yīng)，反應(yīng)較易發(fā)生。而對(duì)于本專(zhuān)利的目標(biāo)物EGCG來(lái)說(shuō)，由于其獨(dú)特的酚羥基結(jié)構(gòu)和三個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，在攻擊中間復(fù)合物的過(guò)程中，很難形成?；?。酰基底物的選擇是一個(gè)難點(diǎn)，要保證中間復(fù)合物有較強(qiáng)的反應(yīng)活性。
另外EGCG具有極強(qiáng)的水溶性，在與脂溶性較強(qiáng)的油脂反應(yīng)時(shí)，溶劑的選擇也是一個(gè)難以平衡的矛盾。脂肪酶非水相催化選擇的溶劑常用依據(jù)，即常選擇的弱極性類(lèi)溶劑不適合這一特定目標(biāo)的反應(yīng)。不同極性溶劑的選擇影響著底物的傳質(zhì)。
酶的存在形式也影響著反應(yīng)的發(fā)生和催化特性。由于游離酶對(duì)環(huán)境十分敏感，目前酶催化反應(yīng)常使用固定化形式酶。但不同形式的固定化商業(yè)脂肪酶不僅影響著酶活力和底物的傳質(zhì)，最終影響著反應(yīng)的發(fā)生和轉(zhuǎn)化率的高低。
天然酚型或酸型生物活性化合物的酶促合成報(bào)道不多，對(duì)EGCG的酶促改性還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了化學(xué)催化劑合成EGCG酯方法的缺點(diǎn)，提供了一種在非水相體系中用固定化微生物脂肪酶催化反應(yīng)合成EGCG脂肪酸酯的方法。
本發(fā)明采用反應(yīng)活性較高的脂肪酸乙烯酯作為?；w，解決了脂肪酶催化EGCG酚羥基反應(yīng)困難的問(wèn)題。本發(fā)明選擇極性較強(qiáng)的溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，增大了底物的溶解度，利于反應(yīng)物之間的傳質(zhì)，加快了反應(yīng)的歷程，且反應(yīng)溶劑無(wú)毒性。本發(fā)明采用了新型的固定化脂肪酶，較之于多數(shù)的商業(yè)化脂肪酶更利于反應(yīng)的轉(zhuǎn)化，提高了反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。該方法的選擇性好，反應(yīng)溫和，產(chǎn)品基本上為單取代產(chǎn)物，產(chǎn)品質(zhì)量好，分離純化簡(jiǎn)單。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案是一種固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于，由以下步驟依次進(jìn)行以天然兒茶素EGCG單體和含2-18個(gè)碳原子的脂肪酸或脂肪酸乙烯酯為原料，EGCG與脂肪酸或脂肪酸乙烯酯按摩爾比為1∶1~10，與有機(jī)溶劑和固定化脂肪酶混合，固定化脂肪酶的用量是EGCG質(zhì)量的0.5-5倍，在30-50℃的條件下，反應(yīng)36-200小時(shí)，取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到EGCG脂肪酸酯；所述的固定化脂肪酶以硅藻土、樹(shù)脂或紡織品膜為載體，載體上有酵母類(lèi)脂肪酶。所得的EGCG脂肪酸酯產(chǎn)物為白色或棕黃色粉狀的固體。
所述的脂肪酸和脂肪酸乙烯酯為乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕?cái)R酸、硬脂酸、油酸、乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、肉豆蔻酸乙烯酯、棕?cái)R酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯或油酸乙烯酯。
所述的酵母類(lèi)脂肪酶為解酯假絲酵母脂肪酶或南極甲絲酵母脂肪酶。
所述的紡織品膜為綿、尼龍、絲綢、聚酯或纖維素的紡織布。
所述的反應(yīng)媒體有機(jī)溶劑為乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、二甲氧基甲烷、二乙氧基甲烷、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、甲基乙基酮、甲基異丙基酮、甲基異丁基酮中的一種或其組合。
所述的反應(yīng)介質(zhì)有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、四氫呋喃、丙酮等極性較強(qiáng)溶劑中的任一種。有機(jī)溶劑的加入量保證溶解EGCG單體即可，沒(méi)有嚴(yán)格的要求。
本發(fā)明的EGCG脂肪酸酯組成為表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-4’-O-脂肪酸酯、表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-3’(5’)-O-脂肪酸酯、表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-5-O-脂肪酸酯、表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-7-O-脂肪酸酯、表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-4’，7-O-二脂肪酸酯、表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-4’，5-O-二脂肪酸酯、表沒(méi)食于兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-3’(5’)，7-O-二脂肪酸酯、表沒(méi)食于兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-3’(5’)，5 O-二脂肪酸酯、表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-5，7-O-二脂肪酸酯、表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-3’(5’)，4’-O-二脂肪酸酯等化合物中的任一種或任意種以任意比例組合。主要組成成分為表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-4’-O-脂肪酸酯、表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-3’(5’)-O-脂肪酸酯、表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-5-O-脂肪酸酯、表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸-7-O-脂肪酸酯等幾種單取代產(chǎn)物。
本發(fā)明的固定化脂肪酶的制備方法是用酵母類(lèi)脂肪酶的水溶液按1000-30000單位/克活化載體與活化載體浸泡、混合、室溫晾干，制得酶活為6000-8000IU/g的固定化脂肪酶。
本發(fā)明制備的EGCG乙酸酯，油脂過(guò)氧化值試驗(yàn)表明，EGCG乙酸酯應(yīng)用于食用植物油中，其添加量為100-200ppm，抗氧因子高，其抗氧化活性比BHA、BHT更強(qiáng)(參見(jiàn)圖1)。過(guò)氧化值按照GB/5538-2005/ISO 39602001的方法測(cè)定。
本發(fā)明可應(yīng)用在包括醫(yī)藥、化妝品、食品以及飼料等領(lǐng)域，也適用于其他各種作為抗氧化劑添加使用的場(chǎng)合。本發(fā)明采用了新型的固定化脂肪酶，使用無(wú)毒性的反應(yīng)溶劑，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，固定化脂肪酶和反應(yīng)溶劑都容易回收重復(fù)使用，有利于連續(xù)化生產(chǎn)。該反應(yīng)的選擇性好，產(chǎn)品單取代產(chǎn)物比率高(參見(jiàn)圖4)。產(chǎn)品質(zhì)量好，分離純化簡(jiǎn)單。其分子結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果顯示仍維持兒茶素EGCG的結(jié)構(gòu)特性(如圖2，3)，具有較好的穩(wěn)定性。


圖1EGCG乙酸酯抗氧化效果與幾種抗氧化劑的比較圖2EGCG的1H-NMR表征圖3EGCG乙酸酯的1H-NMR表征圖4EGCG乙酸酯的LC-MS聯(lián)用紫外和MS檢測(cè)圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml乙酸乙酯中，加入固定化脂肪酶0.5g，在溫度30℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)120小時(shí)，EGCG轉(zhuǎn)化率為20％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯0.24g。
實(shí)施例2取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml乙酸乙酯中，加入固定化脂肪酶1g，在溫度40℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)約120小時(shí)，EGCG轉(zhuǎn)化率為25％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯0.30g。
實(shí)施例3取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml四氫呋喃中，加入固定化脂肪酶2.0g，在溫度40℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)120小時(shí)，EGCG轉(zhuǎn)化率為30％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯0.35g。
實(shí)施例4取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶2g，在溫度40℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)約120小時(shí)，EGCG轉(zhuǎn)化率為35％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯0.41g。
實(shí)施例5取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶3g，在溫度40℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)約90小時(shí)，EGCG轉(zhuǎn)化率為35％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯0.41g。
實(shí)施例6取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.94g(10.9mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶3g，在溫度40℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)80小時(shí)，EGCG轉(zhuǎn)化率為99％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯1.30g。
實(shí)施例7取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯1.88g(21.8mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶3g，在溫度50℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)36小時(shí)，EGCG轉(zhuǎn)化率為99％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯1.38g。
實(shí)施例8取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，辛酸乙烯酯3.71g(21.8mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶2g，在溫度50℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)150小時(shí)，EGCG轉(zhuǎn)化率為85％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到白色粉狀EGCG辛酸酯1.18g。
實(shí)施例9取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，月桂酸乙烯酯4.93g(21.8mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶2g，在溫度50℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)200小時(shí)，EGCG轉(zhuǎn)化率為80％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到白色粉狀EGCG月桂酸酯1.40g。
以上對(duì)本發(fā)明所提供的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實(shí)施方式
及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說(shuō)明書(shū)內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.一種固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于，由以下步驟組成以?xún)翰杷谽GCG單體和含2-18個(gè)碳原子的脂肪酸或脂肪酸乙烯酯為原料，EGCG與脂肪酸或脂肪酸乙烯酯按摩爾比為1∶1～10，與有機(jī)溶劑和固定化脂肪酶混合，固定化脂肪酶的用量是EGCG質(zhì)量的0.5-5倍，在30-50℃的條件下，反應(yīng)36-200小時(shí)，取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到EGCG脂肪酸酯；所述的固定化脂肪酶以硅藻土、樹(shù)脂或紡織品膜為載體，載體上有酶活為6000-8000IU/g酵母類(lèi)脂肪酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于所述的脂肪酸為乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕?cái)R酸、硬脂酸或油酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于所述的脂肪酸乙烯酯為乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、肉豆蔻酸乙烯酯、棕?cái)R酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯或油酸乙烯酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于所述的酵母類(lèi)脂肪酶為解酯假絲酵母脂肪酶或南極甲絲酵母脂肪酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于所述的紡織品膜為棉、尼龍、絲綢、聚酯或纖維素的紡織布。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、二甲氧基甲烷、二乙氧基甲烷、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、甲基乙基酮、甲基異丙基酮、甲基異丁基酮中的一種或其組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、四氫呋喃、丙酮的任一種。
全文摘要
一種固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法屬于酶催化領(lǐng)域。該方法采用以?xún)翰杷谽GCG單體和含2－18個(gè)碳原子的脂肪酸或脂肪酸乙烯酯為原料，按摩爾比為1∶1－10，與篩選的有機(jī)溶劑和固定化脂肪酶混合，酶的用量是EGCG質(zhì)量的0.5－3倍，在30－50℃的條件下，反應(yīng)36－200小時(shí)。取出催化劑，反應(yīng)液經(jīng)過(guò)濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥等步驟得到EGCG脂肪酸酯。本發(fā)明使用固定化脂肪酶，具有選擇性好，反應(yīng)溫和的特點(diǎn)。反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)溶劑無(wú)毒性。得到的脂溶性EGCG脂肪酸酯組分明確，單取代產(chǎn)物含量高，抗氧化品質(zhì)好，其分子結(jié)構(gòu)維持兒茶素EGCG的結(jié)構(gòu)特征，具有較好的穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)C12R1/72GK101086000SQ20071006541
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2007年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月13日
發(fā)明者王芳, 馬習(xí)東, 譚天偉, 鄧?yán)? 聶開(kāi)立 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)