專利名稱：一種檸檬酸合成基因的植物表達載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種檸檬酸合成基因的植物 表達載體，該載體能提高植物耐鋁毒能力。背景^:鋁是地殼中最常見的元素之一，蘊藏豐富，約占地殼重量的7%， 僅次于氧和硅，居第三位，鋁同時也是地殼中含量最豐富的金屬元素(趙和濤.1996. 鋁元素與茶樹生育和品種的關(guān)系.韻帝斧欽矜茲(3):33-35)。在中性或弱酸性 環(huán)境中，鋁主要是以固定態(tài)的硅酸鹽及氧化物的形態(tài)存在于土壤中。在酸性環(huán)境 中，不溶性的鋁化物就轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙鉅顟B(tài)的鋁，SA土壤中則對植物產(chǎn)生毒性 (Hideaki M. 2000. Cell biology of aluminum toxicity and tolerance in higher plants. 200:1-46)。同時酸性土壤中的鋁離子還與磷酸根離子形成低溶解性的磷酸鋁化合物，從而導(dǎo)致土壤中有效磷含量大大降低。可溶性的 鋁可以分為以下幾類自由鋁、Al(H20)63+、聚合鋁Alu以及及低分子量鋁化合物 (Kochian LV. 1995. Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plants. Z/7/7i/ 尸7朋t州ysj'o #o7歷o/ 46:479-487)。隨著土壤pH值 的上升，Al (H20) 63+轉(zhuǎn)變?yōu)锳l (OH) 2+、 Al (OH) 2+;在中性土壤中，主要以難溶的Al (OH) 3 形式存在;在堿性條件下則主要是以鋁酸鹽陰離子Al (OH) 4—的形式存在(Hideaki M. 2000. Cell biology of aluminum toxicity and "tolerance in higher plants. //7力他r(^to7. 200:1-46)。不同形態(tài)的鋁其毒性又有明顯的差異。目前一般認 為在pH衝氐于4. 5的酸性土壤中，鋁主要是以Al (H20) 63+形態(tài)存在的，即通常所說 的Al3+，而這一形態(tài)的鋁被認為皿植物毒性最強的形態(tài)。酸性土是典型的低產(chǎn)土壤，其中鋁(Al)毒被認為是影響作物生長的主要限制因子。微摩爾水平的鋁離子即可對植物產(chǎn)生毒害，而酸性土壤溶液中Ar的濃度約為10 100 nmolL—1 (Ma JF. 2000. Role of organic acid in detoxification of aluminum in higher plants, /^/a^ 6W7尸/y^io7. 41:383-390)。鋁毒害的最初反應(yīng)是抑制鋁敏感基因型植物的根系生長，并因此抑制植物對水分、養(yǎng)分的 吸收，影響植物的正常生長發(fā)育(DelhaizeE， Ryan PR. 1995. Aluminum toxicity and tolerance in plants, 尸7朋f 107:315-332; Foy CD. 1983. Thepysiology of plant adaptation to mineal stress, ib呢6Yate / Ttes. 57:355-392)。鋁毒害最容易識別的癥狀就是根生長的抑制，并且根尖是鋁毒害發(fā) 生的最初位點。Ryan發(fā)現(xiàn)，只有直接對玉米的根鄉(xiāng)行鋁毒脅迫處理，根的生長 才能被抑制；如果對伸長區(qū)或除去根尖的整根處理，對根的生長沒有影響(Ryan P民Ditomaso JM, Kochian LV. 1993. Aluminum toxicity in roots: an investigation of special sensitivity and to role of the cap. / ￡^ ^oZ. 44:437-446)。在酸性土壤中鋁離子對植物危害的分子機制是多種多樣的。 一方面，過多的 游離鋁和交換性鋁離子可以通過抑制根尖生長發(fā)育，造成植株對其它離子及水分 的吸收障礙，從而影響植物的生長發(fā)育。另一方面，鋁也可以與細胞質(zhì)中以及膜 上蛋白的磷酸基、羥基等極性基團結(jié)合，進而影響膜的結(jié)構(gòu)和功能。植物細胞膜 在植物吸收水分和養(yǎng)分的過程中起重要作用，而鋁可以作用于脂質(zhì)和蛋白通道， 使得這些過程受到抑制。此外，鋁還可以啟動膜上第二信使擾亂植物的代謝，如 鋁和鈣的相互作用會影響植物的正常生理功能。鋁還可以跟很多生物大分子發(fā)生 絡(luò)合作用，影響它們的活性。鋁可以與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，改變其結(jié)構(gòu)并對其功能產(chǎn) 生影響；鋁可以和DNA結(jié)合，增加雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，阻止DNA復(fù)制，影響 細胞分裂；鋁可以和ATP形成A1-ATP復(fù)合物，使植物細胞能量代謝過程受到限 制。植物根際溶液中如果存在與Al絡(luò)合能力很強的配位體，即可以減少溶液中 自由Al離子，從而減少其與根細胞結(jié)合的機會，緩解A1的毒害。 一些有機酸如 檸檬酸、草酸、平果酸、酒石酸、水楊酸、丙二酸等可與Al絡(luò)合形成穩(wěn)定的復(fù) 合物，這些復(fù)合物對植物的毒性較低，甚至是無毒的。有機酸與Al結(jié)合形成對 植物毒性低的Al-有機酸絡(luò)合物，從而降低了細胞內(nèi)Al離子的濃度，減少了 Al 與細胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)結(jié)合的機會，因而保護細胞免受破壞；而經(jīng)根系分泌進入土壤的 有機酸與根際中的A1絡(luò)合，降低根際中Al離子的濃度，從而可以緩解鋁毒對植 物的危害。有機酸緩解鋁毒的能力依賴于有機酸與Al形成的Al-有機酸復(fù)合物的 穩(wěn)定系數(shù)(Hue NV, Craddock G民Adams F. 1986. Effect of organic acids on aluminum toxicty in subsoils. &// 爿w J. 50:28-34)。研究表明，外加與Al等摩 爾量的檸檬酸可以解除Al毒(Ma JF, Hiradae S， Nomotto K, Iwashita T， Mataumoto H. 1997a. Internal detoxification mechanism of Al in hydrangea. Identification of Al from in the leace. iVa"http:// /z;awo/. 113:1033-1039; Li XF, Ma JF, Matsumoto H. 2002. Aluminum-induced secretion of both citrate and malate in rye.尸/a"/ So//. 242:235-243)。但是草酸和蘋果酸解除鋁毒所需要的量分別是Al的3倍和5~8倍 (Ma JF, Zheng SJ, Hiradate S, Matsumoto H. 1997b. Detoxifying aluminum with buckwheat. Atowe. 390:569-570; Li XF, Ma JF, Matsumoto H. 2002. Aluminum-induced secretion of both citrate and malate in rye. 尸/a"/ So//. 242:235-243)。有機酸解除鋁毒的能力主要與它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，即-OH、-COOH官能團在主C鏈上的位置(Hue NV， Craddock GI、 Adams F. 1986. Effect of organic acids on aluminum toxicty in subsoils, So" j/w 50:28-34)。角牟鋁毒能力 最強的有機酸其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征是兩對OH/COOH位于相鄰的兩個C原子上(如檸 檬酸、酒石酸)，或者兩個COOH直接連接(如草酸)，這些有機酸可以與鋁形成 穩(wěn)定的五元環(huán)或六元環(huán)結(jié)構(gòu)。蕎麥在Al脅迫下根系能分泌大量的草酸，草酸與 Al絡(luò)合有效減輕了 Al對根系的毒害作用，同時在蕎麥體內(nèi)積累的大量草酸也能 有效消除體內(nèi)的鋁毒(Ma JF, Hiraaadate S, Matsumoto H. 1998. High aluminum resistance in buckwheat: II. Oxalic acid detoxifies aluminum internally.. 117:753-759; Zheng SJ, Ma JF， Matsumoto H. 1998. High aluminum resistance in buckwheat: I. Al-induced specific secretiori of oxalic acid from root tips.尸/a" 尸—o/. 117:745-751)。全世界有39.5億hn^酸性土壤，其中可耕地土壤面積為1.79億hm2，主姜 分布在熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)，尤其是發(fā)展中國家(Kochian LV. 1995. Celluar Mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plant. X"w" 尸/a"/ p/^s/o/ p/aw wo/歷o/. 46:137)。我國酸性土壤遍及南方15個省區(qū)，總面積達2030萬hm2， 約占全國土地總面積的21%。酸性土壤上鋁對植物的毒害以及植物可吸收的有 效磷含量低已經(jīng)成為限制作物生長的重要因素。 一直以來，人們通常靠大量的施 用石灰，來提高土壤的pH值，使游離鋁沉淀，解除鋁毒害。然而這種方法治標(biāo) 不治本，只能改良表層土壤，對深層土壤的酸化卻沒有實質(zhì)性的改變，而且成本 高，對環(huán)境污染嚴重。所以篩選和培育耐鋁毒品種用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是解決問題的關(guān) 鍵。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，人們通過基因工程手段來改造現(xiàn)有品種使之具有 耐鋁性己成為可能。以往的研究證明通過在植物中過量或異位表達有機酸合成酶 基因，如檸檬酸合成酶與蘋果酸合成酶基因，可以提高植物體內(nèi)的有機酸含量。 這些有機酸通過根系分泌到土壤中，熬合土壤中的鋁離子，就能解除酸性土壤中 高濃度的鋁對植物的毒害。這樣不僅可以提高轉(zhuǎn)基因植物對鋁毒的耐受能力，而 且還有利于植物對磷等其它必需營養(yǎng)元素的吸收和利用。擰檬酸合成酶(CS)是一個參與草酰乙酸(OAA)和乙酰輔酶A縮合產(chǎn)生檸 檬酸的一個關(guān)鍵酶，這個生化反應(yīng)在TCA循環(huán)、脂肪酸的p-氧化作用和光呼吸 的乙醛酸循環(huán)途徑中起重要作用。因為檸檬酸是多種生化反應(yīng)如氨基酸和脂肪 酸合成途徑中重要的中間產(chǎn)物，它的合成和分解受到嚴格的控制。在嘗試對檸檬 酸代謝進行遺傳操作時從整體上考慮檸檬酸上游和下游的酶及代謝產(chǎn)物是很重 要的。增加檸檬酸的產(chǎn)生或減少檸檬酸的分解作用可以增強擰檬酸的積累或流 動，增加與檸檬酸合成有關(guān)的酶如CS、 MDH (蘋果酸脫氫酶)和PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的活性，或減少與檸檬酸分解有關(guān)的酶如烏頭酸酶(ACO)和 異檸檬酸脫氫酶(IDH)的活性能增強檸檬酸的積累，檸檬酸生成量的增加可能會 促進檸檬酸的分泌作用。由于檸檬酸的合成需要碳骨架，植物的葉片是光合作用器官，在葉片中產(chǎn)生的光合作用產(chǎn)物可以為檸檬酸的合成提供大量的碳骨架。已有的"基因的植 物表達載體均采用組成型啟動子(CaMV35S), CaMV35S的作用沒有組織特異. 性。用報告基因的研究結(jié)果表明CaMV35S的表達在根中最強，在莖、葉片、花和 果實中較弱(Jefferson等，1987; EMBO， 6:3901-3907)。 1,5二磷酸核酮糖羧化 酶(Rubisco)是植物中表達量最大的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)的含量占植物細胞中 可溶性蛋白的40-50%。 Rubisco的小亞基(rbcS)由細胞核基因編碼，控制rbeS 基因表達的啟動子為光誘導(dǎo)型啟動子(PrbcS)， PrbcS的作用有很強的組織特異 性，需要光信號的誘導(dǎo)，在莖中有低水平的表達，在葉片中的表達最強。用報告 基因的研究結(jié)果表明在葉片中PrbcS的活性比CaMV35S的高3-4倍，因此PrbcS 是一種很強的光誘導(dǎo)型啟動子(Jefferson等，1987; E鵬0， 6:3901-3907)，常 被用來實現(xiàn)目的基因在葉片中的高水平表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高植物耐鋁毒能力的檸檬酸合成基因的植物 表達載體，該載體是含有檸檬酸合成酶基因"的植物表達載體；同時提供該載 體的構(gòu)建方法，以及該載體在制備耐受鋁毒的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案-一種重組植物表達載體，在該植物表達載體中含有煙草w基因。所述植物表達載體的起始載體為pPZP211;所述《基因上游添加有Rubisco小亞基的啟動子PrbcS。本發(fā)明的重組載體為pPZP211-PrbcS-cs，它含有啟動子PrbcS，其后緊接C5 基因。所謂的"基因，其GenBank登錄號為X84226。 本發(fā)明的上述重組載體pPZP211-PrbcS-cs由下述方法構(gòu)建而成 (1)從GenBank中查找煙草"的全長基因序列，并設(shè)計序列如下的一 對引物cAl: 5 ,-CACe^e2TGTTCTATCGCGGCGTTTC-3' cA2: 5，-ICl^QATCArGCTTTCTTGCAAArGGTTC-3'5'端引物cAl，末端加CACC特征序列，并由此形成M;oI酶切位點；3'端 引物cA2，末端加^al酶切位點；以煙草第一鏈cDNA為模板擴增，得到《的 全長cDNA;(2)回收并純化《全長基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質(zhì)粒pMD-cs;(3 )構(gòu)建中間載體pUC 118-PrbcS-*T,用Sphl把pUC 118-PrbcS-T-rbcS-3C (由 Sugita等構(gòu)建并提供，Sugitaetal.， 1987， MGG， 209: 247-256)中的rbcS-3C 切除，并使載體自連接形成pUC118-PrbcS-T，通過點突變技術(shù)在葉綠體定位序 列的起始密碼子附近引入Ncol位點產(chǎn)生中間載體pUC118-PrbcS-*T;(4)將PrbcS啟動子連接到w基因的5'端，用Wcol鄰力al雙酶切pMD-" 和pUC118-PrbcS-*T，回收"基因片段以及載體大片段pUC118-PrbcS，然后連 接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進行PCR檢測和酶切檢測，獲得重組質(zhì)粒pUC118-PrbcS-";(5 )用歷"din和^YZwrl雙酶切pUC 118-PrbcS- 和pPZP211 (由Hajdukiewicz 等構(gòu)建并提供，Hajdukiewicz et al. ， Plant Mol. Biol. 25， 989 (1994))，回收純 化小片段PrbcS-cs和大片段pPZP211，然后連接轉(zhuǎn)化，挑選單克隆并抽提質(zhì)粒， 然后用兩組引物進行PCR檢測和酶切檢測，獲得重組載體pPZP211-PrbcS-w,它 含有啟動子PrbcS，其后緊接"基因。本發(fā)明同時提供了本發(fā)明的重組植物表達載體的構(gòu)建方法(1) 從GenBank中查找煙草"的全長基因序列，并設(shè)計序列如下的一 對引物cAl: 5，陽CACCATGGTGTTCTATCGCGGCGTTTC-3'cA2: 5，-TCTAGATCATGCTTTCTTGCAAATGGTTC-3，5'端引物cAl，末端加CACC特征序列，并由此形成ATcoI酶切位點；3'端 引物cA2，末端加A7^I酶切位點；以煙草第一鏈cDNA為模板擴增，得到《的 全長cDNA;(2) 回收并純化w全長基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質(zhì)粒pMD-";(3 )構(gòu)建中間載體pUC 118-PrbcS-*T，用Sphl把pUC 118-PrbcS-T-rbcS-3C (由 Sugita等構(gòu)建并提供，Sugita etal., 1987, MGG, 209: 247—256)中的rbcS-3C 切除，并使載體自連接形成pUC118-PrbcS-T,通過點突變技術(shù)在葉綠體定位序 列的起始密賣子附近引入Ncol位點產(chǎn)生中間載體pUC118-PrbcS^T;(4)將PrbcS啟動子連接到"基因的5'端，用Afcol和雙酶切pMD-w 和pUC118-PrbcS"T，并回收純化"基因片段以及載體大片段pUC118-PrbcS， 然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進行PCR檢測，獲得重組質(zhì)粒pUC118-PrbcS-cA(5)用州"din和A >al雙酶切pUC118-PrbcS-"和pPZP211 (由Hajdukiewicz 等構(gòu)建并提供，Hajdukiewicz et al. , Plant Mol. Biol. 25, 989 (1994)),回收純化小 片段PrbcS-"和大片段pPZP211，然后連接轉(zhuǎn)化，挑選單克隆搖菌并抽提質(zhì)粒， 然后用兩組引物進行PCR檢測獲得重組載體pPZP211-PrbcS-cs，它含有啟動子 PrbcS，其后緊接w基因。另外，還提供了本發(fā)明的重組載體在制備耐受鋁毒的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用，尤其是在制備耐受鋁毒的轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。本發(fā)明利用光誘導(dǎo)型啟動子PrbcS構(gòu)建"基因的植物表達載體，以便在轉(zhuǎn) 基因植物葉片的紳胞質(zhì)中過量表達CS基因，直接利用光合作用產(chǎn)物產(chǎn)生的碳骨. 架合成檸檬酸，使之分泌到細胞外，最后通過根系進入到土壤中，熬合土壤中的 鋁離子，解除酸性土壤中高濃度的鋁對植物的毒害，提高轉(zhuǎn)基因植物耐鋁毒的能 力。本發(fā)明使用的光誘導(dǎo)型啟動子(PrbcS)是從番茄的基因組中分離出來的 rbcS-3C的啟動子，是一個由i//wdin切割產(chǎn)生的1.7 kb的DNA片斷，己經(jīng)亞克 隆于pUC118中(Sugita et al., 1987, MGQ 209: 247-256)，該亞克隆的質(zhì)粒載體名 稱為pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C。為了使w基因表達后的產(chǎn)物能定位在葉片細胞 質(zhì)中，本發(fā)明用限制性內(nèi)切酶^ / I將pUC 118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切 割出來，然后用連接酶重新連接不含rbcS-3C的載體DNA片斷，產(chǎn)生一個中間 載體pUC118-PrbcS-T，再利用一對互補引物(圖l)，通過點突變技術(shù)在 pUC118-PrbcS-T的葉綠體定位序列起始密碼處引入iVcoI位點產(chǎn)生中間載體 pUC118-PrbcS-*T,本發(fā)明中植物表達載體為pPZP211 (由Hajdukiewicz等構(gòu)建并提供， Hajdukiewicz et al, 1994, PMB, 25:984-)，也可選用其它農(nóng)桿菌雙元載體，如 CAMBIA公司的pCAMBIA載體系列及其衍生載體。將上述載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)或其它物理、化學(xué)方法導(dǎo)入植物組織并整合到植 物基因組中，得到對鋁毒耐受能力提高的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的專用載體旨在用 于提高植物對鋁毒的耐受能力，對單子葉和雙子葉植物都適用，如煙草、水稻、 大豆、小麥等。本發(fā)明的實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)《基因的煙草植株檸檬酸合成酶活性是野生型煙 草的1 5.5倍。在鋁毒的脅迫下，轉(zhuǎn)w基因的煙草能分泌較多有機酸，根系生 長良好，能提高植物對鋁毒的抗性。本發(fā)明的專用載體能在提高植物(如煙草)對 鋁毒的耐受性方面發(fā)揮很大作用，特別是在中國南方酸性紅壤中，可顯著促進植物對鋁毒的耐受能力并提高植物對磷素的吸收利用效率，因而也為植物品種改良 提供了一條新途徑。


圖1:中間載體pUC118-PrbcS-fT的構(gòu)建。用Sphl把pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C 中的rbcS-3C切除，并使載體自連接形成pUC118-PrbcS-T，通過點突變技術(shù)在 葉綠體定位序列的起始密碼子附近引入Ncol位點；圖2 : pPZP211-PrbcS-"植物表達載體構(gòu)建策略示意圖；圖3:通過RT-PCR擴增得到"基因cDNA。 (A)煙草總RNA; (B)煙草RNA 的RT-PCR。 M， XDNA/歷"din digest Marker。 1 4, os基因的RT-PCR產(chǎn)物；圖4: 重組質(zhì)粒pMD-cs的酶切檢測。1-2，用力al和雙酶重組質(zhì)粒 pMD-os; M， DNA/歷"犯I digest Marker;圖5:重組質(zhì)粒pUC118-PrbcS-c;s的檢測。(A)PCR檢測。M， XDNA/Hind111 digest Marker; 1 4，以pUC118-PrbcS-"為模板擴增的PCR產(chǎn)物；(B)酶切檢測。 M， XDNA/Hindlll digest Marker; 1-2,用￡coRI酶切pUC118-PrbcS- 重組質(zhì)粒；圖6:重組質(zhì)粒pPZP211-PrbcS-cs的檢測；(A)PCR檢測。M, cpX174DNA Marker; 1 3，以pUC118-PrbcS-"重組質(zhì)粒為模板擴增as基因全長的PCR產(chǎn) 物；4 6，以pPZP211-PrbcS-as重組質(zhì)粒為模板，用一個位于PrbcS啟動子內(nèi)部 的一個引物(rbcS5)及cs基因的下游引物cA2擴增的PCR產(chǎn)物；(B) M， cpX174 DNAMarker; 1 3，用五coRI酶切pPZP21 l-PrbcS-cs重組質(zhì)粒；圖7:"基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況以及轉(zhuǎn)錄水平的檢測。(A)"基因 插入情況的檢測。M， DNAmarker; P，陽性對照(以pPZP211-PrbcS-os重組質(zhì)粒 為模板擴增的PCR產(chǎn)物)；CS1、 CS8、 CSll，以轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模 板擴增的PCR產(chǎn)物；CK，負對照(未轉(zhuǎn)基因的野生型煙草)；(B)"基因轉(zhuǎn)錄 水平的檢測；M， DNA marker; P，陽性對照，CS1、 CS8、 CSll，轉(zhuǎn)基因煙草 株系的RT-PCR產(chǎn)物；圖8:轉(zhuǎn)基因煙草葉片中檸檬酸合成酶的活性測定。CS1、 CS8、 CSll，轉(zhuǎn) 基因煙草株系；CK，負對照(未轉(zhuǎn)基因的野生型煙草)；圖9:轉(zhuǎn)基因煙草對鋁毒的耐受性檢測。(A)轉(zhuǎn)基因煙草經(jīng)100tjMAlCl3處 理3小時后根尖用鉻天青S染色；(B)轉(zhuǎn)基因煙草經(jīng)300 MM A1C13處理3小時后 根尖用鉻天青S染色。CS1、 CS8、 CSll，轉(zhuǎn)基因煙草株系；CK，負對照；圖10:轉(zhuǎn)基因煙草T2代植株在鋁毒脅迫下根伸長速率的測定。CS8、 CSIO、CS19、 CS19，轉(zhuǎn)基因煙草株系；CK;負對照；圖11:轉(zhuǎn)基因煙草在鋁脅迫下的生長狀況。(A)轉(zhuǎn)基因煙草在100pMAlCl3 基質(zhì)中的生長狀況；(B)轉(zhuǎn)基因煙草在300pMA!Cl3基質(zhì)中的生長狀況。CS8、CS11分別，轉(zhuǎn)基因煙草株系；CK，負對照。下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實施例來進一步闡明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但不 以此來限定本發(fā)明。
具體實施例方式下述實施例中所涉及的試劑與儀器為試劑主要分為分子生物學(xué)實驗試劑、植物遺傳轉(zhuǎn)化所需的培養(yǎng)基以及轉(zhuǎn)基因 植物鑒定和檢測所需的各種試劑。各種限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄 酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取 試劑盒購自博大泰克生物技術(shù)有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑購自 invitrogen公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實驗室常用儀器。所有引物序列均在大連寶生物公司合成。本發(fā)明實施例中所用方法如無特別 說明均為常規(guī)方法。實施例1 、中間載體pUCl 18-PrbcS-T的構(gòu)建用質(zhì)粒抽提試劑盒(博大泰克)純化(按試劑盒說明書操作)pUC118-PrbcS-T-.rbcS-3C(由Sugita等構(gòu)建并提供，Sugitaetal., 1987， MGG,209: 247-256)，用限制性內(nèi)切酶&M (Fermentas)將pUCl 18-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切割出來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體pUC118-PrbcS-T和rbcS-3C片段，回收4. 6 kb的載體pUC118-PrbcS-T，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接(按試劑盒說明書操作)不含rbcS-3C的載體DNA片斷，產(chǎn)生一個中間載體pUC118-PrbcS-T (圖l)，用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5a，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有氨芐青霉素(Amp， 100pg/nil)的平板上，于37。C過夜培養(yǎng)，篩選Amp抗性重組子菌落，從Amp抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，用&M進行酶切檢測，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上只產(chǎn)生一條4. 6kb條帶，選出連接成功的質(zhì)粒載體pUCl 18-PrbcS-T，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci ,挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。實施例2、利用點突變技術(shù)在中間載體pUC118-T-PrbcS中引入Afcol位點 以純化質(zhì)粒pUC118-Prbcs-T為模板，根據(jù)葉綠體定位序列設(shè)計一對用于點 突變的互補引物(Nco15和Nco13，圖l)，委托TaKaRa合成。在點突變反應(yīng)混 合液中加入25ng的純化質(zhì)粒pUC118-PrbcS-T作為模板，同時加入125ng的點突變引物NcoI5和Nco13、 lpldNTP (2.5mM) ， 5^1的10XKOD反應(yīng)Buffer和1^1 的KOD聚合酶(日本東洋紡)，加雙蒸水使反應(yīng)終體積為50nl 。在PCR儀上于95°C 加熱30秒，然后按照95。C、 30秒，55°C、 1分鐘，68°C、 10分鐘的程序進行15 個循環(huán)的反應(yīng)，最后在68。C延長反應(yīng)10分鐘，合成含突變位點的子鏈。反應(yīng)完 成后把反應(yīng)混合液置于冰上冷卻2分鐘，向反應(yīng)混合液加入lpd的限制性內(nèi)切酶 Dpn I (10UAU)和5nl的Dpn I反應(yīng)緩沖液，于37 。C保溫1小時，降解不含 突變位點的母鏈。用反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5 a，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有氨芐青霉素(Amp， 100|ag/ml) 的平板上，篩選Amp抗性重組子菌落，從Amp抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，用 Afcol (Fermentas)進行酶切檢測，突變成功的質(zhì)粒可被Afcol切開并在瓊脂糖凝 膠電泳圖上產(chǎn)生一條4. 6kb的條帶，選出突變成功的質(zhì)粒載體PUC118-PrbcS-*T， 重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。在 pUC118-PrbcS-T的葉綠體定位序列起始密碼處引入Afcot位點后，為構(gòu)建由啟動 子PrbcS控制，表達的目的蛋白定位在葉片細胞質(zhì)中的目的基因的植物表達載體 奠定基礎(chǔ)。實施例3、植物表達載體pPZP211-PrbcS- 的構(gòu)建植物表達載體pPZP211-PrbcS-"的構(gòu)建策略如圖2所示，首選從 GenBank中查找煙草"的全長基因序列，并設(shè)計一對特異引物，以煙草第一 鏈cDNA為模板擴增，得到"的全長cDNA，回收并純化《全長基因片段， 將其連接到pMD18-T載體上獲得pMD-cs。用iVcoi和j^wi雙酶切pMD-" 和pUC118-PrbcS-*T，回收純化《基因片段以及載體大片段pUC118-PrbcS， 然后連接、獲得重組質(zhì)粒pUC118-PrbcS-cs。用///wdin和A^I雙酶切 pUC118-PrbcS-"和pPZP211 ，回收純化小片段PrbcS-w和大片段pPZP211， 然后連接，獲得重組載體pPZP211-PrbcS-"，它含有啟動子PrbcS，其后緊 接"基因。具體構(gòu)建過程如下一、煙草檸檬酸合成酶基因"的cDNA擴增及TA克隆 從GenBank中査找煙草《的全長基因序列，并設(shè)計一對引物，序列如下cAl: 5 ，-CA￡￡^eQTGTTCTArCQCGGCGTTTC-3，cA2: 5，-l￡I^ATCArGCTTTCTTGCAAArGGTTC-3，5'端引物cAL末端加CACC特征序列，并由此形成JVcoI酶切位點；3'端 引物cA2，末端加J^al酶切位點。用TRIzoL Reagent (Invitrogen)從煙草(^/1^0//< 20 to6acw/w cv. Xanth)幼苗中提取總RNA，取植物嫩葉約0. lg，加入lml的TRIzoL提取液在研缽中研磨， 室溫靜置5min后移入離心管，再加入0.2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min(12000rpm)，轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入0.5ml異丙醇，混勻室溫放置10min， 4 。C離心10min (12000rpm)，棄上清，沉淀用75%乙醇lml清洗，4。C離心5min(7500rpm)，棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20lU焦碳酸二乙酯(DEPC) 處理水溶解RNA。使用M-MuLV Reverse Transcriptase Kit (TaKaRa)進行cDNA 的合成，取植物總RNA約0. l^ig-5|ng， oligo(dT) 50ng， 10mM dNTP mix lpl,用 DEPC處理水補足至10nl,混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65t:加熱5min， 冰浴10min，加入反應(yīng)混合物9pi1 (5Xreaction buffer 4pl， 25mM MgCl2 4(xl，. 0. 1MDTT 2pl,RNA酶抑制劑1^1)，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管 底，25。C保溫2min，加入1^1 M-MuLV Reverse Transcriptase,將上述混合物 混勻，短暫離心將之收集于管底，25t:保溫20min，然后42'C保溫70min，合成 cDNA。以cDNA為模板，用cs基因上下游特異性引物cAl和cA2作PCR,擴增得 到《的全長cDNA 1.4kb (圖3)?；厥詹⒓兓?全長基因片段，并將其連接到 pMD18-T (大連寶生物公司)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a(天根生化科技)， 采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符 的重組質(zhì)粒做進一步的雙酶切檢測。根據(jù)陽性重組質(zhì)粒pMD-as載體兩端的多克 隆位點，用Wcol和J^al雙酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物， 連接成功的重組質(zhì)粒pMD-"含有1.4kb左右的DNA插入片段(圖4)，經(jīng)序列分 析證明是煙草"全長基因的cDNA。二、重組質(zhì)粒pUC118-PrbcS-"的構(gòu)建為了將PrbcS啟動子連接到《基因的5'端，用Wcol和^&al雙酶切pMD-as 和pUC118-PrbcS^T (該載體為PrbcS啟動子的供體)，回收純化1.4kb的cs基因 cDNA片段以及載體大片段pUC118-PrbcS(約4.2kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的 連接酶試劑盒連接"基因cDNA片段以及載體大片段pUC118-PrbcS、用連接反 應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5a，天根生化科技)，把 轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有氨芐青霉素(Amp， 100ng/ml)的平板上，篩選Amp抗 性重組子菌落，從Amp抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒進行PCR和酶切鑒定。以重 組質(zhì)粒為模板，用一個位于PrbcS啟動內(nèi)部的引物及"基因的下游引物cA2進 行PCR擴增，PCR產(chǎn)物的理論長度為1.6kb。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1X瓊脂糖凝膠電泳， 結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物的分子量為1.6kb，實際大小與理論值相符合，表明已經(jīng)將" 基因正確插入到含有光誘導(dǎo)啟動子PrbcS的載體上(圖5A)。接著對PCR分析為 陽性的重組質(zhì)粒進行酶切檢測，連接正確的重組質(zhì)粒經(jīng)五coRI酶切應(yīng)該得到一條 1.0kb左右的小片段和一條4.6kb的大片段，酶切產(chǎn)物經(jīng)l^瓊脂糖凝膠電泳檢領(lǐng)lJ，結(jié)果和理論相符(圖5B)，由此獲得正確連接的重組質(zhì)粒pUC118-PrbcS-cs。 三、pPZP211-PrbcS-"的構(gòu)建用///"dill和Ji wl雙酶切pUC118-PrbcS-"和pPZP211(由Hajdukiewicz等 構(gòu)建并提供，Hajdukiewicz et al, 1994, PMB， 25:984-)，回收純化目的片段PrbcS-" (約2.9kb)和pPZP211載體大片段(長度約為9.3kb),然后用寶生物(TaKaRa) 的連接酶試劑盒連接連接目的片段PrbcS-cs和pPZP211載體大片段，用連接反 應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5a，天根生化科技)，把 轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有壯觀霉素(Spe, 50lig/ml)的平板上，于37 。C過夜培 養(yǎng)，篩選Spe抗性重組子菌落，從Spe抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，然后進行 PCR和酶切檢測。PCR檢測采用兩組引物進行，第一組用一個位于PrbcS啟動 子內(nèi)部的一個引物(rbcS5)及"基因的下游引物cA2作PCR， PCR產(chǎn)物的理論長 度為1.6kb;第二組的上下游引物分別是擴增"全長基因的引物cAl、 cA2， PCR 產(chǎn)物的理論長度則為1.4kb。兩組PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示其片' 段大小分別與理論預(yù)測值相符(圖6A)。這表明PrbcS-"片斷己經(jīng)正確插入到植 物表達載體pPZP211中。cs基因內(nèi)部以及NOS終止子之后均包含一個五coRI位 點，所以采用EcoRI進行酶切檢測，如果插入方向是正確的，酶切產(chǎn)物會出現(xiàn)長 度約為1.4kb的小片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物小片段的大小與 理論推測相吻合(圖6B)，由此獲得基因的植物表達載體pPZP211-PrbcS-", 該載體帶有啟動子PrbcS，其后緊接"基因。實施例4、用植物表達載體pPZP21 l-PrbcS-cs轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 制備農(nóng)桿菌的感受態(tài)細胞，用電脈沖法將構(gòu)建好的植物表達載體農(nóng)桿菌 pPZP211-PrbcS-w轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(C58Cl(pPMP90))中，在加有壯觀霉素的平板上 篩選轉(zhuǎn)化子。取少量質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，輕輕混勻；將混合物加入到 預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀 (BIO-RAD)滑槽中，用lmra的電擊杯和200歐姆，2. 5kV/0. 2cm的參數(shù)進行電擊， 電擊后立即取出電轉(zhuǎn)化杯，迅速加入0. 5mlS0C培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到1. 5ml的離 心管中；28°C, 200rpm搖床培養(yǎng)3—5h;室溫下，7500rpm離心lmin，棄大部分 上清，保留lO(Hil將細胞懸?。话艳r(nóng)桿菌涂布于有壯觀霉素(Spe， 50pg/ml)的 LB固體培養(yǎng)基上，28'C培養(yǎng)2天獲得單菌落；首先用牙簽挑取農(nóng)桿菌菌落放入 20|_UddH2O中，98T:處理15分鐘后取出1(^1農(nóng)桿菌裂解液作為PCR反應(yīng)的模板。 用"基因上下游特異性引物作PCR檢測，轉(zhuǎn)化成功的菌落均能擴增出1.4kb的 "基因條帶，經(jīng)菌落PCR確認的轉(zhuǎn)化子菌落用于轉(zhuǎn)化植物。實施例5、用植物表達載體pPZP211-PrbcS-os轉(zhuǎn)化煙草挑取攜帶有pPZP211-PrbcS-"質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于50ml的LB培養(yǎng)基中(含Spe， 100ng/ml), 180rpm， 28。C培養(yǎng)24h，待菌液OD咖至1.0左右，離心10min(3000rpm)，沉淀菌體。再用10ml左右的MS液體培養(yǎng)基懸浮，離心10min(3000rpm)，沉淀菌體。重復(fù)以上操作2~3次。最后加入一定體積的MS液體培 養(yǎng)基重懸浮，使菌體的ODe。。值為0. 5。制備煙草(Mco,!'owa to6acww cv. Xanth)的 無菌苗，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，然后通過組織培養(yǎng)獲得小苗，進 一步篩選獲得所需的轉(zhuǎn)基因植物。把無菌煙草的葉片切成小片葉盤，在制備好的 農(nóng)桿菌菌液中浸染15 —20min,用無菌吸水紙吸干后，平鋪于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 基MS1 (MS+NM02. lpg/ml+BAP0.02iag/ml)上黑暗共培養(yǎng)2天，將外植體轉(zhuǎn)移至 含卡那霉素(50ng/ml)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS4 (MS+NMO. 53ng/ml+BAPO. 5pg/ml)上 進行芽的誘導(dǎo)，約15天繼代一次。待有芽生成后，轉(zhuǎn)入含卡那霉素(50ng/ml) 的MS培養(yǎng)基上進行根的誘導(dǎo)。通過卡那霉素篩選一共獲得18個獨立的轉(zhuǎn)基因株 系，接著對^在這些轉(zhuǎn)基因植株中的轉(zhuǎn)錄水平進行分析。實施例6、 cs基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況及轉(zhuǎn)錄水平檢測 為了確認通過卡那霉素篩選的轉(zhuǎn)基因煙草株系確實含有本發(fā)明導(dǎo)入的目的 基因的cDNA片段，用PCR方法對篩選到的轉(zhuǎn)基因煙草作進一步的鑒定。首先采 用CTAB法提取植物基因組稱取植物葉片100mg左右置于1. 5ml離心管中，加 液氮用特制研棒研磨至粉末狀；加入900pl預(yù)熱到65'C的2XCTAB緩沖液(Tris-HC1 pH 7.5 100 raM， EDTA 20 mM， NaCl 1.4 M， CTAB 2%)， 65。C度水浴加 熱20分鐘后取出冷卻；加入500wl氯仿一異戊醇混合液(24: l)搖勻，4°0離 心10min (7500rpm)后轉(zhuǎn)移上清至1. 5ml EP管；再次加入500^1氯仿一異戊醇 混合液(24: 1〉搖勻，4。C離心10min (7500rpm);取出上清置于新的EP管中， 加入1/10體禾只3M pH5.2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻后4'C離心20min(12000rpm);棄上清，用75%乙醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩沖 液溶解并降解RNA。以植物基因組DNA為模板，用一個位于PrbcS啟動子內(nèi)轉(zhuǎn)錄 起始位點處的一個引物及cs基因的下游引物cA2作PCR檢測，PCR產(chǎn)物的理論 長度為1.5kb，成功轉(zhuǎn)入目的基因的植株均能擴增出L5kb的條帶(圖7A)，經(jīng) PCR確認的轉(zhuǎn)基因植株用于RT-PCR分析。為了考察目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草株系中的轉(zhuǎn)錄情況，從轉(zhuǎn)基因植物中抽取總RNA，反轉(zhuǎn)綠成cDNA后用于RT-PCR分析，檢測cs基因在轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)錄水 平。采用TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取RNA，取植物嫩葉約0. lg，加入 lml的TRIzoL提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min后移入離心管，再加入0. 2ml 氯仿，振蕩混勻，離心l5min (12000rpm)，轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入0.5ml昇 丙醇，混勻室溫放置10min， 4。C離心10min (12000rpm)，棄上清，沉淀用75% 乙醇lml清洗，4.。C離心5min (7500rpm)，棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用 20"1焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA。使用Reverse Transcriptase進 行cDNA的合成，取植物總RNA約O. l^g-5|ag， oligo (dT) 50ng, lOmMdNTPmix 1^1, 用DEPC處理水補足至10pl，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65'C加熱 5min，冰浴10min，加入反應(yīng)混合物9jxl (5Xreaction buffer 4|il， 25mMMgCl2 4|_U， 0. 1M DTT 2^1, RNA酶抑制劑l^il),將上述混合物混勻，短暫離心將之收 集于管底，25。C保溫2min，加入M-MuLV Reverse Transcriptase,將上述 混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25'C保溫20min，然后42'C保溫70min， 合成cDNA。以cDNA為模板，用一個位于PrbcS啟動子內(nèi)部的引物及引cs基因 的下游引物cA2作RT-PCR分析，考察轉(zhuǎn)基因煙草中是否有目的基因的轉(zhuǎn)錄物。 結(jié)果證明大部分轉(zhuǎn)基因煙草植株均有目的基因的轉(zhuǎn)錄物(圖7B)。實施例7、轉(zhuǎn)基因煙草中檸檬酸合成酶(CS)的活性分析選取經(jīng)RT-PCR分析表明有目的基因的轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)基因煙草植株測定檸檬酸 合成酶的活性。從煙草葉片中抽提可溶性蛋白，取1 g煙草葉片，加1 ml蛋白抽 提液[IOO mM Tris-HCl (pH 7.5); 10% (V/V)甘油；10 mM巰基乙醇；1 mM PMSF; 5% (W/V)PVP]研磨，轉(zhuǎn)移至EP管中，13000r/min離心25min(4 °C)。 將上清移到新的EP管中，用Bradford方法測定植物上清中的蛋白質(zhì)濃度。檸檬酸合成酶的活性測定按Anoop等(Plant Physiology, 2003， 132: 2205-2217)的方法進行，原理為L-蘋果酸在蘋果酸脫氫酶的作用下生成草酰乙 酸，而草酰乙酸極不穩(wěn)定，在檸檬酸合成酶和乙酰輔酶A的作用下，能夠生成 檸檬酸。在該反應(yīng)中，通過測定波長為340 nm處NADH的增加量從而獲得CS 的相對酶活性。 .測定CS酶活性的反應(yīng)體系為0.05 M Tris-HCl (PH 7.5)， 10 mM L-Malate， 10U/mLMDH， 0.5mMNAD，在lml的反應(yīng)體系中加入100嗎煙草蛋白樣品。 在紫外分光光度儀上測其340 nm處的吸收值(OD值)，待讀數(shù)穩(wěn)定后，加入10 4mMCoA(乙酰輔酶A)，在lmin之內(nèi)檢測340 nm處的吸收值。計算兩次讀數(shù) 的差值，得到CS酶活性數(shù)據(jù)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草CS酶活性為野生型煙草的 1 5.5倍(圖8)，可見w在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達大大提高了 CS的活性。實施例8、轉(zhuǎn)基因煙草對鋁毒的抗性檢測植物的耐鋁性一般采用根尖染色情況等表型指標(biāo)來衡量。根尖染色的染料有 蘇木精(hematoxylin)和鉻天青(eriochrome cyanine S )，兩者均適于鑒定植物對鋁 的敏感性或忍耐性。其原理是染料能通過死亡的細胞膜進入細胞內(nèi)部，并與殘留 于死亡細胞核中的鋁結(jié)合產(chǎn)生藍色(蘇木精)或紅色(鉻天青S)物質(zhì)，這一反應(yīng)對 鋁具有高度的專一性(Cancado GMA Loguercio LL， Martins PR. 1999. Hematoxylin staining as a phenotypic indes for aluminum tolerance selection in tropical maize (Zeor ， ？ L.). 7T eor柳/ Gew". 99:747-754; Ma JF, Zhen SJ, Li XF. 1997. A rapid hydroponic screening for aluminum tolerance in barley. /Vaw/ so〃 191:133-137)。并且根尖染色程度與鋁對植物的毒害程度呈正相關(guān)。'取大小均勻一致且生根良好的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗，分別置于A1C13濃度分別為 O(對照)、50、 100、 300nmol/L的氯化鈣溶液(pH值《"中處理三小時，再用0.1 X的鉻天青S染色液染色15min。用蒸餾水沖洗后，在顯微鏡下觀察根尖染色情 況。實驗結(jié)果顯示野生型煙草的根系和根尖均被染成紫色，而轉(zhuǎn)"基因的煙草 小苗經(jīng)100 一的AlCl3處理后根系和根尖基本不著色或只有很淺的著色(圖9A)。 在高濃度的A1C13 (300 一處理后，CS表達水平低的植株CS-8其根系有些著色， 但著色程度也比野生型(CK)輕，可見轉(zhuǎn)基因煙草對鋁的耐受程度與CS的活性 水平有明顯的相關(guān)性(圖9B)。這些結(jié)果初步證明在葉片中過量表達"，也能增 強轉(zhuǎn)基因植物對鋁毒的耐受性。實施例9、轉(zhuǎn)基因煙草植株在鋁毒脅迫下根伸長速率的測定根在鋁毒脅迫下的伸長速率是衡量植物對鋁毒耐受能力的另 一種指標(biāo)之一 ， 因此還測定在鋁毒脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株根生長速率。因此選取轉(zhuǎn)基因煙草大小 均勻一致的幼苗，'分別置于A1C13濃度為0、 50、 100、 300 nmol/L的氯化鈣溶 液中。處理24小時之后，測量轉(zhuǎn)基因植株根的伸長量，重復(fù)三次，實驗結(jié)果如 圖10所示。當(dāng)鋁離子濃度為200 ^mol/L和300 ^mol/L時，鋁離子對野生型煙草 (CK)根部伸長的抑制率為100%，然而《轉(zhuǎn)基因植株仍然保持一定的生長活 力，根系維持一定的伸長量。.實施例10、轉(zhuǎn)基因煙草植株分泌的檸檬酸含量測定取大小均勻一致的轉(zhuǎn)基因煙草植株以及野生型煙草幼苗，分別置于A1C13濃 度為100、 300pmol/L的氯化鈣溶液中處理3h，接著收集氯化鈣溶液，濃縮后用 高效液相色譜分析檸檬酸含量。分析結(jié)果表明，在葉片中合成的桿檬酸已大量運 輸?shù)礁?，cs轉(zhuǎn)基因煙草植株根系分泌的檸檬酸含量約為野生型對照植株的 L5 2倍。實施例ll:轉(zhuǎn)基因煙草在在鋁脅迫下的生長情況分析將經(jīng)過A1C13處理的煙草植株小苗移栽到新的珍珠巖基質(zhì)中在溫室內(nèi)進行盆栽試驗，每星期澆灌含有AlP04的營養(yǎng)液(pH4.3，配方同MS培養(yǎng)基的配方，用 A1P04取代其中的KH2P04)兩次， 一次50ml。兩個月后只澆水，觀察煙草植物的 生長狀況。四個月后，"轉(zhuǎn)基因植株己開花結(jié)實，然而野生型煙草(CK)植株 生長明顯受阻，不僅植株矮小，而且還沒有開始生殖生長。通過對煙草株高的測 量發(fā)現(xiàn)經(jīng)過100 [imol/LAlCl3處理的w轉(zhuǎn)基因煙草的株高為野生型煙草的2.09 2.1倍(圖11A);經(jīng)過300 pmol/LAlCl3處理的cs轉(zhuǎn)基因煙草的株高為野生型煙章 株高的1.8 2倍(圖IIB)。可見轉(zhuǎn)基因煙草根部過量分泌的檸檬酸能夠在含有磷 酸鋁的酸性介質(zhì)中螯合鋁離子，可以解除鋁毒的危害，有助于煙草對于磷素的吸 收。所以"轉(zhuǎn)基因煙草植株在鋁毒脅迫下生長良好，能正常開花結(jié)實。
權(quán)利要求
1、一種重組植物表達載體，其中在植物表達載體中含有煙草cs基因。
2、 權(quán)利要求l的重組載體，其中所述植物,載體的起始載體為pPZP211。
3、 權(quán)利要求l的重組載體，其中所述cs基因上游添加有Rubisco小亞基的啟動子PrbcS。
4、 權(quán)利要求l的重組載體，為pPZP211-PrbcS-cs，在起始載體pPZP211上帶有啟動子PrbcS， 其后緊接cs基因。
5、權(quán)利要求l的重組載體，由下述方法構(gòu)建而成(1)從GenBank中查找煙草cs的全長基因序列，并設(shè)計序列如下的一對引物 cAl: 5， -CACCATGGTGTTCTATCGCGGCGTTTC-3 ， cA2: 5， -TCTAGATCATGCTTTCTTGCAAATGGTTC-3, 5'端引物cAl，末端加CACC特征序列，并由此形成AtoI酶切位點；3'端引物cA2，末端加 lfel酶切位點；以煙草第一鏈cDNA為模板擴增，得到"的全長cDNA;(2) 回收并純化cs全長基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用鵬解法提取質(zhì)粒 DNA， ffi31 PCR檢測和酶切檢測獲得重組載體pMD-cs;(3) 構(gòu)建中間載體pUC118-PrbcS-*T，用Sphl把pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等構(gòu) 建并提供，Sugitaetal.， 1987， MGG， 209: 247-256)中的rbcS-3C切除，并使載體自連接形成 pUC118-PrbcS-T，通過點突變技術(shù)在葉綠體定位序列的起始密碼子附近引入NcoI位點產(chǎn)生中間載 體pUC118-PrbcS-*T;(4) 將PrbcS啟動子連接到os基因的5'端，用Afcol和J6al雙酶切pMEHcs和 pUC118-PrbcS-*T，回收cs基因片段以及載體大片段pUQ18-PrbcS，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒 進行PCR檢測和酶切檢測，獲得重,粒pUCl 18-PrbcS-cs;(5) 用歷/xiin和屈al雙酶切pUC118-PrbcS-cs和pPZP211 (由Hajdukiewicz等構(gòu)建并提 供，Hajdukiewicz et al. ， Plant Mol. Biol. 25， 989 (1994))，回收純化小片段PrbcS-cs和 大片段pPZP211，然后連接轉(zhuǎn)化，衫隨單克隆^ttJIM粒，用兩組引物進行PCR檢測和酶切檢測， 獲得重組載體pPZP211-PrbcS-cs,它含有啟動子PrbcS，其后緊接"基因。
6、 一種c連因，其GenBank登錄號為X84226。
7、 權(quán)利要求1的重組植物表達載^^的構(gòu)建方法，其特征在于(1) 從GenBank中査找煙草w的全長基因序列，并設(shè)計序列如下的一 對引物cAI: 5，-CACCATGGTGTTCTATCGCGGCGTTTC-3'cA2: 5 '-TCTAGATCATGCTTTCTTGCAAATGGTTC-3'5，端引物cAl，末端加CACC特征序列，并由此形成AfeoI酶切位點；3'端 引物cA2，末端加力al酶切位點；以煙草第一鏈cDNA為模板擴增，得到《的 全長cDNA;(2) 回收并純化"全長基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組載體pMD-cs;(3〉構(gòu)建中間載體pUC118-PrbcS"T，用Sphl把pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C (由 Sugita等構(gòu)建并提供，Sugitaetal., 1987， MGG, 209: 247-256)中的rbcS國3C 切除，并使載體自連接形成pUC118-PrbcS-T，通過點突變技術(shù)在葉綠體定位序 列的起始密碼子附近引入Ncol位點產(chǎn)生中間載體pUCl8-PrbcS-*T;(4)將PrbcS啟動子連接到m基因的5，端，用iVcoI和力al雙酶切pMD-w 和pUC118-PrbcS"T，并回收純化《基因片段以及載體大片段pUC118-PrbcS， 然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進行PCR擴增，獲得重組質(zhì)粒pUC118-PrbcS-";(5 )用州"dm和雙酶切pUCl 18-PrbcS-cs和pPZP211 (由Hajdukiewicz 等構(gòu)建并提供，Hajdukiewicz et al. ， Plant Mol. Biol. 25, 989 (1994))，回收純 化小片段PrbcS-cs和大片段pPZP211，然后連接轉(zhuǎn)化，挑選單克隆搖菌并抽提質(zhì) 粒，然后進行PCR檢測，獲得重組載體pPZP211-PrbcS-",它含有啟動子PrbcS， 其后緊接"基因。
8、 權(quán)利要求l一5之一的重組載體在制備耐受鋁毒的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。
9、 權(quán)利要求1一5之一的重組載體在制備耐受鋁毒的轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高植物耐鋁毒能力的專用載體pPZP211-PrbcS-cs。該載體是含有煙草檸檬酸合成酶(citrate synthase)基因cs的植物表達載體。本發(fā)明從煙草中克隆出cs基因，用光誘導(dǎo)型啟動子(Rubisco小亞基的啟動子)控制它在煙草中過量表達，合成檸檬酸并分泌到細胞外，通過根系進入到土壤中，熬合土壤中的鋁離子，減輕酸性土壤中高濃度鋁對植物的毒害。實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)cs基因煙草葉片的檸檬酸合成酶活性是野生型煙草的1～5.5倍。在100～300μm的鋁毒脅迫下，轉(zhuǎn)cs基因煙草能分泌較多的有機酸，根系生長較好，對鋁毒的耐受性明顯增強。本發(fā)明的專用載體能提高植物對鋁毒的耐受能力，在植物品種尤其是中國南方酸性土壤中種植的作物品種的遺傳改良中有很大的應(yīng)用潛力。
文檔編號C12N15/82GK101265479SQ200710066419
公開日2008年9月17日 申請日期2007年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者劉迪秋, 李昆志, 玉永雄, 胡清泉, 玥 趙, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學(xué);西南大學(xué)