專利名稱：鼠抗人酯多糖受體抗體重鏈可變區(qū)基因及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術，主要涉及鼠免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因，尤其涉及到
鼠抗人酯多糖受體(國際命名CD14，抗體克隆名ZCH-7-2F9)單克隆抗體重
鏈可變區(qū)基因及用途。
背景技術：
血液系統(tǒng)腫瘤如白血病、淋巴瘤是嚴重危害人類健康的頑癥，化學治療(化 療)仍然是當前治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的主要方法，但常規(guī)化療對腫瘤細胞與 正常細胞之間的選擇性較差，因而毒副作用較大，且反復非根治性劑量的化療， 又容易誘生腫瘤細胞的耐藥，最終，許多患者因耐藥腫瘤復發(fā)或大劑量化療致 嚴重毒副作用如嚴重感染、出血、重要臟器功能衰竭等而告治療失敗。
與化療比較，單克隆抗體靶向治療具有良好的選擇性和特異性，它們只殺 傷表達靶分子的細胞，而不損傷無靶分子表達的血細胞成分和組織器官細胞， 從而可大大提高耙向治療的特異性，降低藥物的全身毒副作用。有效的耙向治
療取決于良好的先導分子，系列特異性表面分化抗原單抗作為先導分子，將藥 物或毒素特異地帶到腫瘤細胞膜上或細胞內，或通過完整抗體激活補體(CDC)
或通過抗體介導細胞毒(ADCC)作用以達到殺滅白血病細胞的目的，有著無可 替代的優(yōu)勢。目前，大多數(shù)高親和力的單抗屬于鼠源性的，用鼠源性單抗進行 臨床靶向治療可以發(fā)生嚴重的血清病或因產生人抗鼠免疫球蛋白(Ig)抗體 (HAMA)而消除藥物的抗腫瘤作用等問題，限制了它們在臨床上的有效應用。為 了在臨床上能大量重復使用鼠源性單抗治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤，就必須最大限 度地降低鼠源性單抗對人體的免疫原性?，F(xiàn)知，抗體的免疫原性主要位于抗體 恒定區(qū)(Fc)段，而識別抗原的部分(抗體的可變區(qū))則抗原性較弱。通過適 當?shù)姆椒ㄈコ驣g的Fc段而保留可變區(qū)Fv段，可以大大降低鼠單抗的免疫 原性而保留其識別抗原的特異性。人鼠嵌合型鼠抗人B淋巴細胞表面抗原CD20 單抗是該技術的典型代表，其研制方法是采用人B淋巴細胞來免疫Balb/C純 種小白鼠，然后通過鼠-鼠雜交瘤技術研制出抗人CD20單抗雜交瘤細胞株。通 過對該雜交瘤細胞株編碼抗人CD20免疫球蛋白可變區(qū)肽鏈的信使核糖核苷酸 (m腦A)的擴增、克隆以及測序，并將編碼該抗體可變區(qū)基因與人免疫球蛋白
恒定區(qū)基因進行重組表達，制成嵌合型人鼠CD20抗體(可變區(qū)為鼠源性，恒定 區(qū)為人源性的基因工程抗體)，使該抗體保留識別CD20抗原的特性，從而特異 性地識別人B系淋巴細胞包括表達該抗原的所有淋巴瘤細胞、白血病細胞以及 正常細胞，而消除了由鼠源性恒定區(qū)對人體產生免疫反應的缺點，從而起到有 效的治療作用。該抗體的臨床應用已經使B細胞系腫瘤的治療進入了一個嶄新 的時代。要使一個鼠源性單抗能在臨床病人體內反復使用的關鍵是鼠源性抗體 的人源化基因改造，而人源化基因抗體研制的關鍵是該鼠源性抗體可變區(qū)基因 的序列，因為抗體靶向作用的關鍵是該抗體的可變區(qū)，而編碼可變區(qū)基因序列 是決定每一個單抗各自靶向作用的關鍵。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供ZCH-7-2F9 (CD14)鼠免疫球蛋白(單抗)重鏈 可變區(qū)基因，具有SEQ IDN0 1的核苷酸序列，和以該核苷酸序列為模板，翻 譯成抗體重鏈可變區(qū)蛋白或氨基酸序列SEQ ID NO 2。本發(fā)明提供的是鼠抗人 酯多糖受體(國際命名CD14，抗體克隆名ZCH-7-2F9)單克隆抗體重鏈可變 區(qū)基因。
本發(fā)明的另一個目的是提供ZCH-7-2F9 (CD14)鼠免疫球蛋白重鏈可變區(qū) 基因在制備治療急性單核細胞性白血病藥物中的應用。
采用單抗靶向治療某種特定血液腫瘤的基本條件是抗體必須能識別某種 血液腫瘤細胞膜抗原。ZCH-7-2F9單抗具有良好的識別急性單核細胞白血病細 胞膜CD14抗原而不識別其他組織、細胞成分的特性，體外實驗表明，2F9免疫 毒素對2F9陽性的急性單核細胞白血病細胞具有良好的選擇性殺傷作用，而對 2F9陰性的細胞卻無作用，因此，該抗體具有潛在治療急性單核細胞性白血病 的應用前景。
本發(fā)明提供的ZCH (Zhejiang Children' s Hospital) -7-2F9 (以下簡稱 2F9)是以末端脫氧核糖核苷酸轉移酶(TdT)陽性小兒急性髓系-淋巴細胞系 雙克隆白血病復發(fā)時的白血病細胞作為免疫原，致敏Balb/C純種小白鼠，通 過鼠一鼠雜交瘤單抗技術研制成功的鼠抗人白細胞分化抗原酯多糖受體[國際 分化簇(CD)命名為CD14]的單抗w，該抗體已在第6屆國際人類白細胞分化抗 原協(xié)作組會議(HLDA6)上進行了全面鑒定并獲得了分化簇(CD)命名[2]。由于 同一 CD號的單抗，其鼠免疫球蛋白亞類、與細胞的反應譜及某些生物學特性 有所不同，某個抗體有它的特殊性，如2F9抗體屬鼠免疫球蛋白G1k (IgGlK 亞類)，而我國國內中國醫(yī)學科學院血液學研究所僅有的另一個CD14克隆(HI222)，屬IgM亞類w。 2F9的反應特性除與國際上其他CD14克隆類似外， 尚有識別未分化型急性單核細胞白血病細胞(AML—M5a)的能力["，后者大多 數(shù)CD14抗體無此功能，為2F9單抗用于M5a白血病的診斷和導向治療提供分
子基礎。
由于鼠抗人CD14抗體ZCH-7-2F9并非天然存在，而是需要刻意應用特定 的抗原進行免疫致敏動物，然后通過細胞融合、篩選、鑒定等一系列繁瑣而復 雜的技術過程研制而成，且到目前為止，國際上尚無其他克隆的鼠抗人CD14 單抗免疫球蛋白重鏈有測序的文獻報道，而本發(fā)明完成了對該抗人CD14抗體 (ZCH-7-2F9)重鏈可變區(qū)基因的克隆和測序?；谠摶蛐蛄兴兄频娜嗽?化基因工程抗體將可能對臨床急性單核細胞性白血病靶向治療具有十分重要 的應用價值。


圖1為高純度的2F9單克隆細胞株的篩選實線為CD14 — PE，影印為 2F9+GAM Ig-FITC。
圖2為PCR擴增VH2F9基因及重組質粒pGEM -T Easy/VH的瓊脂糖電泳鑒定。
圖3為抗人CD14抗原單抗ZCH-7-2F9的可變區(qū)重鏈基因(VH鵬)序列(兩個 紅色箭頭之間的序列)。
圖4為完整2F9抗體與Genistein偶合制成的免疫毒素(2F9-Gen)對 2F9(CD14)陽性白血病細胞(急性單核細胞白血病，AML-M5)耙向殺傷作用觀 察，并以2F9陰性的急性粒細胞白血病部分分化型(AML-M2)細胞作為陰性對 照。PBS為磷酸鹽緩沖液，Gen為游離三羥基異黃酮，純化2F9為純化的2F9 鼠免疫球蛋白IgGl。
具體實施例方式
本發(fā)明結合實施例，作進一步的說明。
實施例一本發(fā)明1個基因的核苷酸序列及氨基酸序列
1、抗人CD14單抗ZCH-7-2F9鼠免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因(VH2F9)的核苷 酸(SEQ ID NO 1)及氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。 實施例二 本發(fā)明通過下列步驟獲得
1、 ZCH-7-2F9單抗的研制基本按Koller&Milstein報告的鼠-鼠雜交瘤 經典方法進行，以髓/淋混合型(雙克隆)急性白血病(HAL)復發(fā)時的白血病細 胞[已轉變?yōu)槟┒嗣撗鹾颂呛塑账徂D移酶(TdT)陽性的急性髓細胞性白血病 (AML)，其免疫表型為HLA-DR+， CD13+， CD33+， TdT+， CD19-， CD7-， CD41a-]
作為免疫原，將l(T白血病細胞給8周齡雌性Balb/C小鼠作腹腔注射，每周一 次，共4次，于第4次注射后第3天，脫臼殺死小鼠，無菌取脾細胞與處于對 數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞株NS-1細胞按6:1混合，以5(^聚乙二醇(PEG，美 國Sigma公司，分子量3350道爾頓)溶液作為融合媒介進行細胞融合，于96 孔板(美國Falcon公司)中進行選擇性培養(yǎng)。于融合后第9 20天，隔日用免 疫原細胞對培養(yǎng)上清進行間接免疫熒光法(I I F)篩選。陽性孔細胞經3次克 隆化并連續(xù)2次100%孔達到陽性，即建立了能持續(xù)分泌2F9單抗的雜交瘤細 胞株。經8個多月的連續(xù)傳代培養(yǎng)和反復凍融，其分泌2F9單抗的能力穩(wěn)定。 以其腹水(熒光法效價l:3200)或培養(yǎng)上清(熒光法效價1:16)作為2F9單抗的 來源。
2、最佳克隆的篩選將凍存于液氮(-196。C)中的2F9細胞復蘇后進行亞 克隆培養(yǎng)，獲得5孔單克隆細胞群，通過異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠免疫球 蛋白(GAM Ig-FITC)間接標記法比較各單克隆細胞群培養(yǎng)上清與進口藻紅蛋 白標記的CD14單抗(CD14-PE，克隆名LeuM3)在正常單核細胞上的平均熒 光強度，參見圖l和表l。根據(jù)兩者平均熒光強度的對比，從中篩選出2個最 佳亞單克隆細胞株93A10和94D6，選用93A10作進一步的實驗。
表l. 2F9最佳亞克隆細胞株的篩選(單位平均熒光強度指數(shù))
亞克隆CD14-PE2F9+GAM Ig-FITC
518. 48—
94D6145. 8175. 16
93A10148. 16199. 54
93G7143.3182. 26
94H12141.01127. 89
93H11138. 79115.09
"—"陰性對照。
3. 2F9重(VtW)的擴增 3. 1 總RNA的抽提和處理
收集最佳克隆(93A10)的2F9雜交瘤細胞及鼠骨髓瘤細胞株NS—l細胞分別
約8X 106，以核糖核酸(RNA)抽提試劑盒(TRIZOL液)按說明書步驟抽提總RNA。 最后溶于25iU DEPC (diethyl-pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水中，并加

入RNasin (核糖核苷酸酶抑制劑)至終濃度為l U/p1 (單位/微升)。紫外 分光光度計測定A260、 A280及其比值，1X瓊脂糖電泳觀察總RNA。進行逆轉錄 -多聚酶鏈反應(RT—PCR)前，各取2" 1 2F9及NS — 1總RNA，按照RQ1 (無RNA 酶的DNA酶試劑盒)說明的方法，消化總RNA中污染的基因組DNA。 3. 2總RNA的抽提
(1) 計數(shù)細胞，共8xl()6個活細胞；
(2) 常溫下1000轉/分鐘(rpm)離心15分鐘，棄上清；
(3) 沉淀中加入無菌生理鹽水后在1000rpm條件下離心15分鐘，重復洗滌2
次；
(4) 向沉淀中加入8ml TRIZOL (1^1/106細胞)，立即用5ml無菌針筒反復抽 打剪切數(shù)分鐘；
(5) 將上述TRIZOL溶液按lml/管轉入1. 5ml印pendorf管中，室溫下靜置5 分鐘；
(6) 每管加入0. 2ml氯仿，劇烈搖動15秒，室溫下靜置10分鐘；
(7) 4° C下12000g離心15分鐘，將水相轉入新的1. 5ml的印pendorf管 中，每管加入0.5ffll異丙醇，立即搖勻，室溫下靜置10分鐘；
(8) 4° C下，12000g離心10分鐘；
(9) 棄上清，每管加入1.5ml 75%乙醇，混勻，4。 C下，7500g離心5分鐘， 棄上清-,
(10) 真空干燥機中晾干，每管加入25 " 1無RNA酶的DEPC水溶解沉淀，-80° C 冰箱保存。
3. 3總RNA濃度的測定
取出2p1新抽提的總RNA,加入98 ul DEPC水混勻，紫外分光光度計 (GeneQuant II)測定260吸光值(A260)及280吸光值(A280), RNA實際 濃度用如下公式計算
A268
喊度(ug,ul)--嚇倍數(shù)
2wn
7
3. 4總RNA凝膠電泳
取新抽提的總RNA 3 u 1加入電泳上樣緩沖液5 u 1， 1%瓊脂糖凝膠內含 溴乙啶(EB)濃度0.5ng/ml，經100V直流電壓下電泳5分鐘，凝膠成像系統(tǒng)觀 測結果并攝像保存。
3.5總RNA的處理取總RNA 1 無RNA酶的DNA酶(脂ase-free Dnase)
(1 U/ul) 10 RNasin (40 U/ul) 1 n 1 +氯化鎂(25mM) 1 ul
，總量達13ul，經37° Ol小時，90° C x 5分鐘孵浴后立即置冰上待用。 3. 6 RT—PCR
按照說明書，將RQ1無RNA酶的DNA酶處理過的總RNA進行逆轉錄(25pl體 系)，并用DNA純化試劑盒(QIAquick)純化mRNA/cDNA雜交雙鏈。取純化的cDNA 2. 5ul進行PCR。
3.6.1 RT反應體系取RQ1處理過的總RNA 13ul+寡聚脫氧胸苷
1.5 ul，總量達14,5"L，經65° C預變性5分鐘，立即置冰上，
加入以下試劑DEPC水2.5 ul+ 5倍緩沖液5 "1+ 25mM dNTP (脫氧核 苷混合物)0. 5 ii 1+ RNA酶抑制劑1. 5 u 1+逆轉錄酶(200 U/pL) 1 u 1 至總體積25 nl，經37° C， 30分鐘孵浴以合成互補脫氧核糖核苷酸(cDNA)， 置95°C 5分鐘，然后移至4°C冰浴備用。
3.6.2 PCR體系
(1) 50u 1的PCR反應體系:2. 5ul純化的2F9或NS — l cDNA， 10pmol的重 鏈可變區(qū)上下游引物各lixl， 0.5pl 25fflM的dNTP， 5^1 10X高保真PCR緩沖液， 2pl 50mMXMgS04 (硫酸鎂)溶液，0. 2pl高保真Taq聚合酶(Platinum Taq High Fidelity);引物序列如下
重鏈可變區(qū)5'引物序列CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT
重鏈可變區(qū)3'引物序列CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT
(2) 反應條件94。C預變性2分鐘，94。C變性30秒，57。C退火30秒，72°C 延伸30秒，共30個循環(huán)；
(3) 最后一個循環(huán)完成后，加入lial Taq ■ Polymerase (Taq DNA聚合 酶)72。C延伸7分鐘；
(4) 取5^1 PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，同時加標準分子量標志 物DL2000，鑒定PCR產物片斷大小，命名為VH2P9基因。結果可觀察到400bp 左右的VH2F9條帶，而以NS-1細胞cDNA擴增無陽性條帶出現(xiàn)。將前述陽性條帶 切膠回收純化得到VH2F9基因，濃度分別為13.52 ug/ml和17.84 ug/ml。以作
為該雜交瘤融合對象的NS—1細胞cDNA為模板的PCR產物電泳結果未見擴增 條帶(圖2)。
4. VH卿基因的擴增產物的克隆和鑒定將VH鵬基因片段通過連接酶分別 與克隆載體pGEM敷-TEasy連接，獲得的連接產物pGEM ~T Easy/VH，通過轉化 DH5a感受態(tài)細菌，得到數(shù)十個白色菌落和數(shù)個藍色菌落，分別挑取4個白色菌 落進行質粒擴增，抽提后進行核酸限制性內切酶EcoRI酶切處理，1%瓊脂糖 電泳結果均可見400bp左右的目的片段，參見圖2，其中M:低核糖核苷酸(DNA) 標準分子量標志物；1:VH，基因；2: NS-l重鏈可變區(qū)基因(VHNS—》；9 12: 重組質粒pGEM -T Easy/VH的EcoRI酶切。
5. VH，基因序列測定和分析
對陽性重組質粒純化后進行測序(圖3) ， VH2F9基因符合小鼠Ig可變區(qū)框
架結構。VH，基因全長360bp (見SEQIDNOl)，編碼120個氨基酸(見SEQ ID N0 2)，在美國國家生物技術信息中心(NCBI)上進行檢索，發(fā)現(xiàn)此重鏈可變區(qū)基因 與小鼠免疫球蛋白重鏈的同源性達98% ，氨基酸序列與小鼠Ig重鏈的同源性達 87%，歸屬于小鼠Ig的VH基因。氨基酸序列分析結果顯示，重鏈可變區(qū)含有明 確的4個框架區(qū)和3個抗原決定簇互補區(qū)，在第22位和第96位為特征性Cys。 VH 基因序列結構框架
.2P9
1~25
26 33
34 50
51~58
59 96
97~108
109 120
FR1 CDR1
FR2 CDR2
FR3 C腦
FR4
實施例三為證實2F9抗體的潛在臨床治療應用前景，我們將純化的2F9 鼠源性完整抗體與三羥基異黃酮(Genistein，簡稱Gen)偶合制成2F9抗體的免 疫毒素(2F9-Gen)，觀察其對2F9陽性(急性單核細胞性白血病，AML-M5) 和陰性(急性部分分化型粒細胞白血病AML-M2)細胞進行靶向殺傷研究，結果發(fā) 現(xiàn)，2F9-Gen對AML-M5細胞具有很強的選擇性殺傷作用，經37。C 48小時孵浴 培養(yǎng)后，2F9-Gen組的細胞存活率僅5X，明顯高于對照組，且2F9-Gen對2F9 陰性的AML-M2卻無殺傷作用，說明2F9-Gen具有良好的導向殺傷ML-M5的作用(圖4)，其中PBS為磷酸鹽緩沖液，Gen為游離三羥基異黃酮，純化2F9為 純化的2F9鼠免疫球蛋白IgGl。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最 大限度地應用本發(fā)明。因此，前面的實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以 任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明涉及的序列-
〈110〉浙江大學
<120>鼠抗人酯多糖受體抗體重鏈可變區(qū)基因及用途 〈160〉 4
〈170〉 Patent In Version 2. 1 〈210〉 1 〈211〉 360 〈213〉人工序列
〈223〉 89 a96 cM g81 t
<400〉 1
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGACGCCTGGGGCTTCAGTGMGTTG60
TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGMGCTGAGG120
CCTGGACTAGGCTTTGAGTGGATTGGAGAGATTMTCCTAGCMTGGTGGTACTAACTAC180
AATGAGAAGTTCAAGAGAMGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTAC240
ATGCAACTCAGCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAATTGACACC300
TCGGACTACGTGGACTTTGACTACTGGGGCCMGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCC360
<210> 2 〈211〉 120 〈212>
〈213>人工序列
<223>按照大腸桿菌偏愛的密碼子，設計了酶切位點和接頭肽的編碼hPTH(1-34)的合 成基因
<400> 2
QVQLQQPGAE LVTPGASVKL SCKASGYTFT SYWMHWVKLR PGLGFEWIGE INPSNGGTNY 60 NEKFKRKATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCTIDT SDYVDFDYWG QGTTLTVSSA 120
<210〉 3 〈211〉 21 〈212〉
<213〉人工序列
<223>重鏈可變區(qū)5'引物序列
〈400〉 3
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT
〈210〉 4 〈211〉 38 <212〉
〈213>人工序列
<223〉重鏈可變區(qū)3'引物序列
<■> 4
CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT
本發(fā)明涉及的部分參考文獻
1.湯永民，郭淑芬，沈紅強.ZCH-7_2F9: —個抗人CD14新克隆的研制鑒定及初步應用.中 華血液學雜志，2001, 22(8): 439-441.
2- Leucocyte Typing VI. Edited by Tadamitsu Kishimoto, et al. Garland Publishing, Inc. New York & London 1997. pll09~1220.
3. Y.M. Tang, H. Q. Shen and S. R Guo. ZCH-7-2F9: A酒clone of CD14 capable of recognizing M5a leukemia cells. Tissue Antigens (Abstracts of the 7th Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (HLM7)) 2000; 55(1) supplement: 42.
權利要求
1.鼠抗人酯多糖受體抗體重鏈可變區(qū)基因，國際命名CD14，抗體克隆名ZCH-7-2F9，具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列，及以該核苷酸序列為模板，翻譯成抗體重鏈可變區(qū)蛋白或氨基酸序列SEQ ID NO 2。
2、 根據(jù)權利要求1所述的鼠抗人酯多糖受體抗體重鏈可變區(qū)基因在制備 治療急性單核細胞性白血病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供鼠抗人酯多糖受體抗體重鏈可變區(qū)基因，國際命名CD14，抗體克隆名ZCH-7-2F9，具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列和SEQ ID NO 2的氨基酸序列。本發(fā)明提供了抗人CD14抗體(ZCH-7-2F9)重鏈可變區(qū)基因的克隆和測序?；谠摶蛐蛄兴兄频娜嗽椿蚬こ炭贵w將可能對臨床急性單核細胞性白血病靶向治療具有十分重要的應用價值，可在制備治療急性單核細胞性白血病藥物中的應用。
文檔編號C12N15/13GK101173283SQ20071006665
公開日2008年5月7日 申請日期2007年1月9日 優(yōu)先權日2007年1月9日
發(fā)明者寧鉑濤, 江 曹, 湯永民 申請人:浙江大學