專利名稱：2型豬鏈球菌毒力基因pcr擴增檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種2型豬鏈球菌毒力基因PCR擴增檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌病是一種重要的人畜共患病，感染人的主要是豬鏈球菌2型(Streptococcus suis Serotype 2，SS2)。人感染后可引起肺炎、腦膜炎、菌血癥、敗血癥等，重者出現(xiàn)中毒性休克綜合癥(Toxic Shock Syndrome，TSS)，且以后者最為嚴重，起病急病勢兇險，不及時治療可導(dǎo)致很快死亡。研究表明，致病力強弱與其相關(guān)毒力因子密切相關(guān)。自從1968年丹麥學(xué)者首次報道了人體感染豬鏈球菌導(dǎo)致腦膜炎的病例，陸續(xù)在全世界的許多國家和地區(qū)都有了人感染豬鏈球菌病例的報道。在我國，1998年江蘇省報告了人感染豬鏈球菌病，發(fā)病25例，死亡14例；2005年6至8月，四川省發(fā)生人感染豬鏈球菌病爆發(fā)疫情，發(fā)病204例，死亡38例，死亡病例中絕大多數(shù)發(fā)生中毒性休克，為國內(nèi)外迄今為止見諸報道的最大規(guī)模人感染豬鏈球菌疫情，已引起社會各界的廣泛關(guān)注。及時準確的病原學(xué)診斷及致病力鑒定是人感染豬鏈球菌應(yīng)急檢測、指導(dǎo)臨床用藥、預(yù)測預(yù)后及影響疾病預(yù)警系統(tǒng)靈敏度的關(guān)鍵。
SS2不同菌株間致病性的差異大，目前已知的較為肯定的SS2重要毒力因子有溶血素sly、溶菌酶釋放蛋白mrp、莢膜多糖cps2J和細胞外蛋白因子ef。sly在豬鏈球菌侵入和裂解細胞的過程中發(fā)揮著重要作用；mrp又稱類M蛋白，由1208個氡基酸組成.分子量為136kd，為細菌的胞壁蛋白。M蛋白陽性的菌株能抵抗巨噬細胞的吞噬作用并能粘附上皮細胞。據(jù)報道只有mrp+ef+的毒株才能在小鼠巨噬細胞中存活。但這兩種蛋白對2型菌株的致病性并非必不可少。試驗表明2型菌株的mrp基因突變株對仔豬的致病性與其原始菌株完全一致。除mrp和ef外，還有其他毒力因子存在。莢膜多糖cps是已經(jīng)確證的SS2重要毒力因子，缺乏cps等位基因的突變株進入實驗動物豬和大鼠體內(nèi)很快會被循環(huán)清除，對實驗動物無毒性。其可能的作用途徑是影響菌體粘附到上皮細胞與巨噬細胞上的活性。39kDa的甘油醛-3-磷酸脫氫酶gapdh是SS2表面蛋白，在SS2首先黏附于宿主細胞的過程中起著重要的作用。
對其編碼基因進行簡易、快速、敏感、特異的核酸診斷是本發(fā)明目的。目前已有運用PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)檢測SS2毒力相關(guān)基因的研究報道，但所用的PCR反應(yīng)及循環(huán)條件不盡相同，需進行多次擴增；雖也有多重PCR檢測的報道，但仍未能在1次擴增中同時檢測所有SS2 7個重要基因，難于滿足應(yīng)急檢測的需要。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明則是為了提供一種可在一次擴增中同時檢測所有SS2 7個重要基因、簡易、快速、準確的2型豬鏈球菌毒力基因PCR擴增檢測試劑盒及檢測方法。
為達到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種2型豬鏈球菌(Streptococcus suis Serotype 2，SS2)毒力基因PCR擴增檢測試劑盒，包括SS2 DNA對照模板(DNA≥100ng/μl，由2型豬鏈球菌菌株抽提得到，含SS2屬(tuf)、種(16S rRNA)、溶血素(sly)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、莢膜多糖(cps2J)、細胞外蛋白因子(ef)、甘油醛3-磷酸脫氫酶(gapdh)等特異性基因)、PCR擴增檢測試劑、瓊脂糖凝膠電泳試劑以及DNA梯度標準品，所述PCR擴增檢測試劑主要包括PCR緩沖液、特異性擴增引物、脫氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶和滅菌純水；所述特異性擴增引物共8對(除7對SS2特異性引物外，還含1對細菌β球蛋白基因引物CI，Intemal Control)16S-195(s)5’-CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGA TAT-3’16S-489(as2)5’-GTA AGA TAC CGT CAA GTG AGA A-3’cps2J-s5’-GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T-3’cps2J-as5’-CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C-3’mrp-Fw5’-GGT ATA CCT TGC TGG TAC CGT TC-3’mrp-Re5’-AGT CTC TAC AGC TGT AGC TGG-3’sly-Fw5’-AGT TCG CAC TTG ATT TTA AG-3’sly-Re5’-AAT ACA TTG CCA GAT TAC TC-3’gapdh-Fw5’-GGC GCC GAA TTC GTC GAC ATT ATT TAG CAA TTTTTG CG-3’gapdh-Re5’-CGC CGC GGA TCC GTA GTT AAA GTT GGT ATTAAC-3’ef-Fw5’-ACA AAG GCG TAG GTT CAA TC-3’ef-Re5’-CGG CAT CAA GAA TGT CTT TG-3’tuf-Fw5’-GTA CAG TTG CTT CAG GAC GTA TC-3’tuf-Re5’-ACG TTC GAT TTC ATC ACG TTG-3’CI 6-s5’-GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT TAC TCA GTG CCG CAGCTA ACG CAT T-3’CI7-as5’-CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC CCG ACT TCA CCC CAATCA TCT ATC C-3’。
所述PCR擴增檢測試劑主要成分如下
PCR緩沖液 終濃度為1×特異性擴增引物 各10～80μM脫氧三磷酸核苷混合物200～1000μMDNA聚合酶 0.5～5酶活力單位/反應(yīng)余量為滅菌純水。
PCR緩沖液終濃度為1×，意思是緩沖液中各組分終濃度與1×PCR buffer相同，即所述PCR緩沖液以各組分在PCR擴增試劑中終濃度計，組成如下氯化鉀 500mMTris-Cl 100mM氯化鎂 25mM聚乙二醇6000 0.1％1，4-二巰基蘇糖醇0.1％牛血清白蛋白 1％ 。
上述百分比濃度為質(zhì)量體積百分比，某物質(zhì)濃度為1％表示100mL溶液中含有該物質(zhì)1g。
PCR緩沖液可以根據(jù)需要有不同的組合，也可以有其它的組配代替，但上述組合是較理想的選擇。
所述瓊脂糖凝膠電泳試劑主要成分如下TBE緩沖液 終濃度為5×瓊脂糖 體積百分比為1‰溴化乙錠體積百分比為1‰溴酚蘭 體積百分比為16.67％。
所述PCR擴增檢測試劑盒中還可含有DNA抽提試劑，所述DNA抽提試劑為下列之一①Q(mào)iagen DNA抽提試劑、②Promega DNA抽提試劑、③TaKaRaDNA抽提試劑。本發(fā)明優(yōu)選Qiagen DNA抽提試劑。
所述DNA梯度標準品通常選用100bp梯度的DNA標準品，可以是是下式之一(1)TaKaRa 100bp DNA Ladder Marker，(2)Promega 100bp DNALadder，(3)BioLabs 100bp DNA Ladder；本發(fā)明優(yōu)選TaKaRa 100bp DNALadder Marker。
所述DNA聚合酶為下列之一①Ampli Taq DNA聚合酶、②rTaq DNA聚合酶、③Platinum Tag DNA聚合酶。使用濃度為0.5～5酶活力單位/反應(yīng)(U)，U的定義為用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，在74℃、30分鐘內(nèi)，攝入10nmol的全核苷酸為酸性不溶物的活性定義為1個活力單位(U)；DNA聚合酶使用濃度及產(chǎn)家可有不同，本發(fā)明優(yōu)選rTaq DNA聚合酶。
所述脫氧三磷酸核苷混合物(dNTP)選用dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP組合，優(yōu)選為下列之一①dATP，dCTP，dGTP，dTTP物質(zhì)的量之比1∶1∶1∶1的混合物，②dATP，dGTP，dCTP，dUTP物質(zhì)的量之比1∶1∶1∶1的混合物，③dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP物質(zhì)的量之比 4∶4∶4∶4∶1的混合物；最優(yōu)選為③dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP物質(zhì)的量之比4∶4∶4∶4∶1的組合。
所述PCR擴增檢測試劑中各組份終濃度如下PCR緩沖液氯化鉀 500mMTris-Cl 100mM氯化鎂 25mM聚乙二醇60000.1％
1，4-二巰基蘇糖醇0.1％牛血清白蛋白 1％特異性擴增引物8對各50μM脫氧三磷酸核苷混合物dATP 200μM，dCTP 200μM，dGTP 200μM，dTTP 200μM，dUTP 50μMrTaq DNA聚合酶 0.5酶活力單位/反應(yīng)余量為滅菌純水。
本發(fā)明還涉及一種2型豬鏈球菌毒力基因PCR擴增檢測方法，所述的檢測方法以SS2 DNA對照模板為陽性對照，采用待測樣本的DNA為分析樣本，所述方法步驟如下(1)樣本DNA提??；所述樣本DNA來自待測病人的血液，腹水，腦脊液或者是尸檢標本；病、死豬的肝臟、脾臟、腹水、心血；新鮮或陳舊細菌培養(yǎng)物等；采取待測樣本一定量的標本經(jīng)前處理，按常規(guī)方法提取DNA樣本為血液，腹水，腦脊液或液體培養(yǎng)物取蛋白酶40μl于1.5ml管，加入0.4ml樣本，混勻，再加入裂解液，漩渦混勻15秒，56℃水浴10分鐘，瞬時離心，加入400μl無水乙醇，漩渦混勻15秒，瞬時離心，將此混合液小心移入2ml的過濾柱，6000g離心1分鐘，倒棄濾液，小心加入500μl洗液1于過濾柱內(nèi)，6000g離心1分鐘，倒棄濾液，再小心加入500μl洗液2于過濾柱內(nèi)，20 000g離心3分鐘，倒棄濾液，將過濾柱移入新的1.5ml管，加入100μl溶解液或無菌無DNA酶純水，室溫靜置5分鐘，6000g離心1分鐘，取液體直接進行PCR操作或置于-80℃保存。
樣本為實質(zhì)性臟器或組織塊取PBS 80μl于1.5ml管，加入組織塊樣本25mg(脾臟10mg)，勻漿，加入100μl組織裂解液，加入20μl蛋白酶K，漩渦混勻3次，56℃水浴至組織完全溶解(一般為1～3小時或過夜)期間取出混勻2～3次/小時，或置振蕩水浴。瞬時離心，加入200μl裂解液，漩渦混勻15秒，70℃水浴10分鐘，瞬時離心，加入200μl無水乙醇，漩渦混勻15秒，瞬時離心，將此混合液小心移入2ml的過濾柱，6000g離心1分鐘，倒棄濾液，小心加入500μl洗液1于過濾柱內(nèi)，6000g離心1分鐘，倒棄濾液，再小心加入500μl洗液2于過濾柱內(nèi)，20000g離心3分鐘，倒棄濾液，將過濾柱移入新的1.5ml管，加入100μl溶解液或無菌無DNA酶純水，室溫靜置5分鐘，6000g離心1分鐘，取液體直接進行PCR操作或置于-80℃保存。
樣本為培養(yǎng)皿菌落挑取適量疑似菌落于內(nèi)置生理鹽水500μl的1.5ml管，漩渦徹底混勻，8000rpm離心3分鐘，棄上清，生理鹽水1000μl同前再洗滌2次，加入無菌純水500μl，100℃水浴10分鐘，8000rpm離心3分鐘，小心吸取上清直接進行PCR操作或置于-80℃保存。
(2)PCR擴增取PCR擴增檢測試劑，加入SS2 DNA對照模板與分析樣本的DNA分別進行擴增反應(yīng)；(3)擴增產(chǎn)物測定取擴增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠后，于凝膠成像儀下讀取數(shù)據(jù)、成像并保存結(jié)果；(4)結(jié)果分析參照梯度DNA梯度標準品圖像，在目的片段大小位置出現(xiàn)條帶的判斷為陽性；所述2型豬鏈球菌(Streptococcus suis Serotype 2，SS2)毒力基因PCR擴增檢測試劑盒，包括SS2 DNA對照模板、PCR擴增檢測試劑、瓊脂糖凝膠電泳試劑以及100bp梯度DNA標準品，所述PCR擴增檢測試劑主要包括PCR緩沖液、特異性擴增引物、脫氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶、滅菌純水；
所述特異性擴增引物及目的片段大小為16S-195(s)5’-CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGA TAT-3’328bp16S-489(as2)5’-GTA AGA TAC CGT CAA GTG AGA A-3’cps2J-s5’-GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T-3’ 459bpcps2J-as5’-CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C-3’mrp-Fw5’-GGT ATA CCT TGC TGG TAC CGT TC-3’ 532bpmrp-Re5’-AGT CTC TAC AGC TGT AGC TGG-3’sly-Fw5’-AGT TCG CAC TTG ATT TTA AG-3’ 1500bpsly-Re5’-AAT ACA TTG CCA GAT TAC TC-3’gapdh-Fw5’-GGC GCC GAA TTC GTC GAC ATT ATT TAG CAA TTTTTG CG-3’1100bpgapdh-Re5’-CGC CGC GGA TCC GTA GTT AAA GTT GGT ATTAAC-3’ef-Fw5’-ACA AAG GCG TAG GTT CAA TC-3’ 269bpef-Re5’-CGG CAT CAA GAA TGT CTT TG-3’tuf-Fw5’-GTA CAG TTG CTT CAG GAC GTA TC-3’ 205bptuf-Re5’-ACG TTC GAT TTC ATC ACG TTG-3’CI6-s5’-GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT TAC TCA GTG CCG CAGCTA ACG CAT T-3’ 620bpCI7-as5’-CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC CCG ACT TCA CCC CAATCA TCT ATC C-3’。
所述步驟(2)PCR循環(huán)條件設(shè)置為94℃×5min；再按94℃×60sec、58℃×60sec、72℃×90sec，循環(huán)30次；最后72℃×5min，完成擴增。
所述的檢測方法步驟(2)多重PCR擴增具體步驟為每一反應(yīng)管取10×PCR緩沖液2.5μL，脫氧三磷酸核苷(dNTP)混合物2μL，rTaq DNA聚合酶0.25μL及分組特異性擴增引物(同一組別的引物可加在同一反應(yīng)管中16S、cps2J、mrp一組，sly、gapdh一組，ef、tuf、CI7一組)各0.25μL，加無DNA酶滅菌純水至23μl混合而成，同時各自預(yù)備3份裝有上述混合液的PCR薄壁反應(yīng)管，一份加入步驟(1)制備的DNA溶液2μl，1份加入無DNA酶滅菌純水2μl作為陰性對照，另1份加入SS2 DNA模板作為陽性對照，混勻，瞬時離心，反應(yīng)管及對照管置于PCR儀立即進行PCR擴增。EppendorfH-116或iCycler EN-61010儀器推薦循環(huán)條件設(shè)置94℃×5min；再按94℃×60sec、58℃×60sec、72℃×90sec，循環(huán)30次；最后72℃×5min完成擴增反應(yīng)。
所述的檢測方法步驟(3)擴增產(chǎn)物測定具體步驟為分別取PCR擴增產(chǎn)物5μL，與1μL溴酚蘭溶液混勻，加入預(yù)先制備好的2％瓊脂糖凝膠(內(nèi)含溴化乙錠)加樣孔中；另取4μL100bp梯度的DNA標準品為參比DNA片斷大小(bp)，同前加入瓊脂糖凝膠加樣孔。瓊脂糖凝膠置于內(nèi)含0.5×TBE緩沖液的水平電泳槽中，加樣孔端朝負極，通上電源，電泳至染料前沿約距瓊脂糖凝膠邊沿1cm時，斷開電源，取出凝膠，于凝膠成像儀下讀取數(shù)據(jù)、成像并保存結(jié)果。MiniRun GE-100型凝膠電泳儀推薦循環(huán)條件設(shè)置電壓100V，電泳30～40min。FR-200A全自動紫外與可見分析裝置設(shè)置選取紫外分析光源，圖片保存模式為12×。
本發(fā)明首次建立了直接從臨床標本或培養(yǎng)物中用同一PCR循環(huán)及反應(yīng)條件同時測定SS2 7個重要基因的多重PCR方法，最低只需78個細菌即能檢出。采用能引起與SS2感染類似的腦膜炎癥狀、肺炎或菌血癥的腦膜炎奈瑟氏菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌等做對照，都未擴增到SS2種特異性基因及5個重要的毒力基因；其中與SS2同個菌屬的肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌則可擴增到鏈球菌屬特異性基因tuf。
PCR技術(shù)原理基于DNA的復(fù)制，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成①模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
多重PCR技術(shù)原理在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，在同1反應(yīng)體系中加入2種及2種以上與多個靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，同時擴增出不同的目的基因片斷，以同時檢測樣本中是否含有多個目的基因。
本發(fā)明根據(jù)上述原理，設(shè)計合成鏈球菌屬(tuf)、SS2種(16S rRNA)、溶血素(sly)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、莢膜多糖(cps2J)、細胞外蛋白因子(ef)和甘油醛3-磷酸脫氫酶(gapdh)等基因的特異性引物，發(fā)明目的在于提供一種能快速準確檢測2型豬鏈球菌及相關(guān)毒力因子的基因檢測試劑盒及基因檢測方法，從而快速診斷病人是否攜帶2型豬鏈球菌并可同時鑒定所攜帶的細菌含有幾種相關(guān)毒力因子基因，并據(jù)此初步判斷其致病力。
本發(fā)明的優(yōu)點體現(xiàn)在1.填補了相關(guān)領(lǐng)域空白目前國內(nèi)尚無SS2實驗室診斷試劑上市，給SS2的實驗室診斷和研究帶來極大不便，本發(fā)明填補了這一空白，更利于SS2實驗室診斷和研究的進行。
2.早期診斷，與免疫學(xué)法比時間大大縮短免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測存在較長的“窗口期”，不利于對疾病的早期診斷。此外尚需雙份血清抗體升高4倍以上方能排除既往感染而提示近期感染，而這往往需感染1個月后方能采集第2份血清，不利于早期診斷，而且目前尚無市售SS2免疫學(xué)檢測試劑。PCR方法直接檢測病原體的DNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測顯然也有利于疾病的早期診斷。為及早確診和治療提供方便。
3.樣本多樣性，與傳統(tǒng)的細菌鑒定法比兼容性更大、更快速可對多種樣本直接進行檢測，樣本兼容性大。即使是陳舊樣本仍能檢測。而傳統(tǒng)的細菌鑒定需用新鮮標本進行細菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化鑒定等，整個過程需2～3天時間，不利于對疾病的早期診斷，而且無法對陳舊或保存不當?shù)臉颖具M行檢測。
4.快速簡便，與目前其它SS2 PCR檢測法比，更便捷、快速多基因擴增，特別是3種以上目的基因的多重PCR檢測，往往存在不同引物體系間因所要求的循環(huán)條件不同而需分次的問題，因此延長實驗時間或需2臺以上PCR反應(yīng)儀或反應(yīng)系統(tǒng)。雖然目前已有運用多重PCR檢測SS2毒力相關(guān)基因的研究報道，但最多只能同時1次性測定SS2 2～3個目的基因，所用的PCR反應(yīng)及循環(huán)條件不盡相同，需進行多次擴增，難于滿足應(yīng)急檢測的需要。
本發(fā)明首次建立了直接從各種臨床標本或培養(yǎng)物中同時1次性測定SS2 7個重要基因的多重PCR檢測方法。與目前其它SS2 PCR檢測法相比，本發(fā)明提供的檢測方法省時、簡便，對SS2 DNA樣本只要2小時即可檢測到，并可根據(jù)所含毒力基因初步判定致病力情況。
5.靈敏度高，樣本中只要有78個菌即能撿出本發(fā)明經(jīng)過優(yōu)化PCR條件及反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)化，并經(jīng)引物對排列組合，選取最佳引物對配對，以最大限度提高實驗的敏感性，采用活細胞計數(shù)法對SS2陽性參考株進行菌落計數(shù)以檢驗方法的敏感性。實驗表明只要樣本中含有78個SS2菌即能撿出，與其它方法相比敏感性更高。
6.特異性強相關(guān)及無關(guān)菌株對照結(jié)果滿意本發(fā)明對能引起與SS2感染類似的腦膜炎癥狀、肺炎或菌血癥的腦膜炎奈瑟氏菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌等設(shè)立相關(guān)菌株對照實驗，結(jié)果都未擴增到SS2種特異性基因及SS2的5個重要毒力基因；而對肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌等鏈球菌則可擴增到鏈球菌屬特異性基因tuf；檢測體系中對所有細菌DNA均能擴增出650bp目的條帶的菌體β-球蛋白編碼基因，而對加入純水或其它非鏈球菌的細菌DNA則均未擴增出任何DNA片斷，表明該檢測方法敏感性高，特異性強。
7.快速鑒別致病菌，并進行致病力鑒定，預(yù)測預(yù)后及疾病預(yù)警本發(fā)明1次性測定SS2 7個重要基因，根據(jù)是否擴增出鏈球菌屬特異性基因、SS2種特異性基因及5個重要的SS2毒力相關(guān)基因，可對是否為鏈球?qū)俑腥?、有否SS2感染作出鑒別診斷，且對SS2感染菌的毒力、侵襲力傾向及疾病的預(yù)后作出快速、早期預(yù)測，有利于臨床疑似病例的早期診斷和鑒別診斷，并有助于疾病流行及危害程度的早期預(yù)警，有望用于人感染SS2應(yīng)急檢測、疾病監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查和臨床早期快速實驗室診斷。
(四)


圖1為SS2基因檢測方法中敏感性試驗的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖；泳道1DNA模板空白對照；泳道2～4SS2參考株(A組引物分開)；泳道5～10每反應(yīng)體系中SS2參考株的CFU，依次為780，78，7.8，0.78，0.078；泳道M100bp DNA Ladder(100～1000bp)；泳道10～12實驗株SS205001，SS205002，SS205003；泳道13～16陰性對照菌株S.pne、S.vi、S.β-hemo、N.m；泳道1，5～16A組3對引物均合并為1管；圖2為SS2基因檢測方法特異性試驗中不同菌株C組基因(tuf，ef+CI)擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖(擴增引物采用C組引物tuf，ef和CI)；泳道1，2，3鏈球菌屬對照菌株S.pne，S.vi和S.β-hemo；泳道4～6陰性對照菌株S.epi，N.m和V.cho；泳道7空白對照；泳道8～10實驗株SS205004；泳道10純培養(yǎng)菌；泳道11為腦脊液標本，泳道12為血液標本；泳道M100bp DNALadder(100～1500bp)；圖3為相同反應(yīng)條件下1次性擴增不同基因組的凝膠電泳圖；泳道1、3、5SS2陽性參考株；泳道2、4、6雙向培養(yǎng)液(實驗株SS205004)；泳道7腦膜炎奈瑟氏菌(N.m)；泳道8DNA空白對照；泳道M100bp DNA Ladder(100～1500bp)；泳道1、2B組引物擴增片斷(sly，gapdh)；泳道3、4A組引物片斷(16SrRNA，cps2J，mrp)；泳道5、6C組引物片斷(ef、tuf)。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1SS2相關(guān)毒力基因檢測試劑盒，包括以下組份(1)Qiagen DNA抽提試劑
(2)多重PCR擴增檢測試劑由10×PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷(dNTP)混合物、DNA聚合酶及特異擴增引物等，以蒸餾水為溶劑混合而成。
所述的特異性擴增引物共8對，其引物名稱、序列擴增產(chǎn)物大小及分管見表1。
表1引物序列及分組

所述的多重PCR擴增檢測試劑由下列組分以蒸餾水為溶劑混合而成10×PCR緩沖液 含量體積百分比10％脫氧三磷酸核苷dATP 200μM，dCTP 200μM，dGTP 200μM，dTTP 200μM，dUTP 50μM特異性引物管1(100×) 含量每條引物各50μM特異性引物管2(100×) 含量每條引物各50μM特異性引物管3(100×) 含量每條引物各50μM余量為無DNA酶的滅菌純水。
(3)瓊脂糖凝膠電泳試劑主要由5×TBE緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠(1000×，含量體積百分比為1‰)及溴酚蘭(6×，含量體積百分比為16.67％)等組成。
(4)100bp梯度的DNA標準品TaKaRa 100bp DNA Ladder Marker將上述PCR檢測試劑中各成分按配比混合配制成足夠數(shù)量，用于下列多重PCR擴增時用的PCR擴增檢測試劑。
使用上述試劑盒，檢測步驟如下(1)樣本DNA提取采取待測病人一定量的標本經(jīng)前處理，按常規(guī)方法提取DNA樣本為血液，腦脊液或咽拭(咽部分泌物)取蛋白酶40μl于1.5ml管，加入0.4ml樣本，混勻，再加入裂解液，漩渦混勻15秒，56℃水浴10分鐘，瞬時離心，加入400μl無水乙醇，漩渦混勻15秒，瞬時離心，將此混合液小心移入2ml的過濾柱，6000g離心1分鐘，倒棄濾液，小心加入500μl洗液1于過濾柱內(nèi)，6000g離心1分鐘，倒棄濾液，再小心加入500μl洗液2于過濾柱內(nèi)，20 000g離心3分鐘，倒棄濾液，將過濾柱移入新的1.5ml管，加入100μl溶解液或無菌無DNA酶純水，室溫靜置5分鐘，6000g離心1分鐘，取液體直接進行PCR操作或置于-80℃保存。
樣本為培養(yǎng)皿菌落挑取適量疑似菌落菌體或菌液于內(nèi)置生理鹽水500μl的1.5ml管，漩渦徹底混勻，8000rpm離心3分鐘，棄上清，生理鹽水1000μl同前再洗滌2次，加入無菌純水500μl，100℃水浴10分鐘，8000rpm離心3分鐘，小心吸取上清直接進行PCR操作或置于-80℃保存。
(2)多重PCR擴增取10×PCR緩沖液2.5μl，脫氧三磷酸核苷(dNTP)混合物(各200mM)2μl，rTaq DNA聚合酶0.25μl及分組特異性擴增引物(同一組別的引物可加在同一反應(yīng)管中)各0.25μl，加無DNA酶滅菌純水至23μl混合而成，同時預(yù)備3份裝有上述混合液的PCR薄壁反應(yīng)管，一份加入步驟(1)制備的DNA溶液2μl，1份加入無DNA酶滅菌純水2μl作為陰性對照，另1份加入SS2DNA模板作為陽性對照，混勻，瞬時離心，反應(yīng)管及對照管置于EppendorfH-116型梯度PCR儀立即進行PCR擴增。循環(huán)條件設(shè)置94℃×5min；再按94℃×60sec、58℃×60sec、72℃×90sec，循環(huán)30次；最后72℃×5min完成擴增反應(yīng)。
(3)擴增產(chǎn)物測定分別取PCR擴增產(chǎn)物5μl，與1μl溴酚蘭溶液混勻，加入預(yù)先制備好的2％瓊脂糖凝膠(內(nèi)含溴化乙錠)加樣孔中；另取4μl 100bp梯度的DNA標準品為參比DNA片斷大小(bp)，同前加入瓊脂糖凝膠加樣孔。瓊脂糖凝膠置于內(nèi)含0.5×TBE緩沖液的MiniRun GE-100型凝膠電泳儀的水平電泳槽中，加樣孔端朝負極，電壓100V，電泳30～40min，至染料前沿約距瓊脂糖凝膠邊沿1cm時，斷開電源，取出凝膠，于FR-200A全自動紫外與可見分析儀下讀取數(shù)據(jù)、成像并保存結(jié)果。于凝膠成像儀下讀取數(shù)據(jù)、成像并保存結(jié)果。
(4)結(jié)果分析根據(jù)電泳結(jié)果，參照100bp梯度的DNA標準品位置，在目的片斷大小(bp，參見表1)位置出現(xiàn)條帶的判為擴增陽性。
臨床應(yīng)用采用雙盲法(采樣人員與實驗人員分開，實驗人員未知樣本臨床背景)，應(yīng)用上述試劑盒，運用上述方法分別對9例臨床疑似SS2腦膜炎病例的腦脊液(FCS)或血液或培養(yǎng)物(菌體或增菌液)，4例一般接觸者(同桌吃飯)的咽拭進行SS2及相關(guān)毒力基因檢測，結(jié)果在臨床疑似病例中有5例檢測出SS2種異性基因(16S rRNA)，實驗室診斷為SS2感染。其中4例5個毒力基因(cps2J、mrp、sly、gapdh、ef)全部陽性，1例莢膜蛋白基因(cps)陰性。在一般接觸者中均未檢出SS2特異性基因(參見表2)。
表2SS2及相關(guān)毒力基因檢測臨床應(yīng)用結(jié)果

其中4例分離菌株刮取菌苔制備菌液，用API rapid ID32 STREP V2.0型全自動細菌鑒定儀(Biomérieux，法國)進行鑒定，結(jié)果見表3。
表3全自動生化細菌鑒定結(jié)果

全自動細菌生化鑒定結(jié)果提示符合2型豬鏈球菌。
實施例2相關(guān)毒力基因檢測試劑盒，包括的組分如實施例1，還包括SS2 DNA對照模板(DNA≥100ng/μL)，來源豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype 2)丹麥參考株(浙江大學(xué)方維煥教授惠贈)，常規(guī)方法抽提DNA得到。
PCR特異性試驗陽性參考株采用豬鏈球菌2型(Streptococcus suisserotype 2)丹麥參考株(即本優(yōu)選SS2毒力基因檢測試劑盒所用SS2 DNA對照模板)；陰性參考株采用A)鏈球菌屬肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pne)，乙型溶血性鏈球菌(β-hemolytic streptococcus，S.β-hemo)，草綠色鏈球菌(Streptococcus viridans，S.vi)；B)其它菌屬腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides，N.m)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epi)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae，V.cho)等，前述菌株來源由浙江省疾病預(yù)防控制中心菌種保藏室分離并保存。采用3盲法(提供樣品人員、實驗人員及結(jié)果分析人員分開，實驗人員及結(jié)果分析人員未知樣本編號的實際意義，結(jié)果分析人員未知實驗人員對樣品進行的實際操作)，應(yīng)用上述試劑盒，按本發(fā)明的優(yōu)選方法進行PCR擴增，檢驗PCR特異性。結(jié)果顯示設(shè)立的陰性對照菌株均未見擴增出SS2的特異性條帶；乙型溶血性鏈球菌S.β-hemo、草綠色鏈球菌S.vi和肺炎鏈球菌S.pne在鏈球菌屬特異性基因tuf片斷的200bp位置上出現(xiàn)相應(yīng)條帶而腦膜炎奈瑟氏菌N.m、表皮葡萄球菌S.epi和霍亂弧菌V.cho則未出現(xiàn)任何條帶。說明檢測特異性強；所有實驗菌株及陰性對照菌株均可擴增出內(nèi)對照條帶，說明PCR反應(yīng)體系合理，未出現(xiàn)抑制作用(參見圖1～3)。
實施例3～7實施例3～7是采用活細胞計數(shù)法對SS2陽性參考株進行菌落計數(shù)取0.5個麥氏單位的菌懸液，作一系列的10倍稀釋，然后將定量的稀釋液進行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，計算培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。從1000萬個起連續(xù)10倍稀釋至1個菌，應(yīng)用上述試劑盒，按本發(fā)明的優(yōu)選方法進行PCR擴增，以檢測所用試劑盒對樣品的檢測能力。結(jié)果顯示當8個目的基因片段均出現(xiàn)特異性條帶時，其PCR敏感性為78CFU/反應(yīng)。當DNA模板低于7.8 CFU時，某些條帶不明顯(參見表4，圖1)。
表4PCR敏感性試驗×

×注菌株采用SS2陽性參考株實施例8流行病學(xué)現(xiàn)場監(jiān)測應(yīng)用采用雙盲法(現(xiàn)場采樣人員與實驗人員分開，實驗人員未知樣本的流行病學(xué)背景)，應(yīng)用實施例1所述試劑盒，運用上述方法分別對SS2監(jiān)測點采集的100例特定職業(yè)人群咽拭直接進行SS2及相關(guān)毒力基因檢測，并與分離培養(yǎng)法比較，結(jié)果顯示所有100例特定職業(yè)人群咽拭直接進行SS2及相關(guān)毒力基因檢測均為陰性，而分離培養(yǎng)法檢測亦均未分離出SS2。
序列表.ST25SEQUENCE LISTING<110>浙江省疾病預(yù)防控制中心<120>2型豬鏈球菌毒力基因PCR擴增檢測試劑盒及檢測方法<130>
<160>16<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>24<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>1cagtatttac cgcatggtag atat24<210>2<211>22<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>2gtaagatacc gtcaagtgag aa 22<210>3<211>22<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>3gttgagtcct tatacacctg tt 22<210>4<211>22<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>4cagaaaattc atattgtcca cc 22<210>5<211>23<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>5ggtatacctt gctggtaccg ttc 23<210>6<211>21<212>DNA
<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>6agtctctaca gctgtagctg g 21<210>7<211>20<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>7agttcgcact tgattttaag 20<210>8<211>20<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>8aatacattgc cagattactc20<210>9<211>38<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>9ggcgccgaat tcgtcgacat tatttagcaa tttttgcg38<210>10<211>33<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>10cgccgcggat ccgtagttaa agttggtatt aac 33<210>11<211>20<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>11acaaaggcgt aggttcaatc20<210>12<211>20<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>12cggcatcaag aatgtcttt g 20<210>13<211>23<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>13gtacagttgc ttcaggacgt atc 23<210>14<211>21<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>14acgttcgatt tcatcacgtt g 21<210>15<211>46<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>15gttgagtcct tatacacctg ttactcagtg ccgcagctaa cgcatt 46<210>16<211>46<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列<400>16cagaaaattc atattgtcca cccgacttca ccccaatcat ctatcc4權(quán)利要求
1.一種2型豬鏈球菌(Streptococcus suis Serotype 2，SS2)毒力基因PCR擴增檢測試劑盒，包括SS2 DNA對照模板、PCR擴增檢測試劑、瓊脂糖凝膠電泳試劑以及DNA梯度標準品，所述PCR擴增檢測試劑主要包括PCR緩沖液、特異性擴增引物、脫氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶和滅菌純水；其特征在于所述特異性擴增引物為16S-195(s)5’-CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGA TAT-3’16S-489(as2)5’-GTA AGA TAC CGT CAA GTG AGA A-3’cps2J-s5’-GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T-3’cps2J-as5’-CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C-3’mrp-Fw5’-GGT ATA CCT TGC TGG TAC CGT TC-3’mrp-Re5’-AGT CTC TAC AGC TGT AGC TGG-3’sly-Fw5’-AGT TCG CAC TTG ATT TTA AG-3’sly-Re5’-AAT ACA TTG CCA GAT TAC TC-3’gapdh-Fw5’-GGC GCC GAA TTC GTC GAC ATT ATT TAG CAA TTTTTG CG-3’gapdh-Re5’-CGC CGC GGA TCC GTA GTT AAA GTT GGT ATTAAC-3’ef-Fw5’-ACA AAG GCG TAG GTT CAA TC-3’ef-Re5’-CGG CAT CAA GAA TGT CTT TG-3’tuf-Fw5’-GTA CAG TTG CTT CAG GAC GTA TC-3’tuf-Re5’-ACG TTC GAT TTC ATC ACG TTG-3’CI6-s5’-GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT TAC TCA GTG CCGCAG CTA ACG CAT T-3’CI7-as5’-CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC CCG ACT TCA CCCCAA TCA TCT ATC C-3’。
2.如權(quán)利要求1所述的2型豬鏈球菌毒力基因PCR擴增檢測試劑盒，其特征在于所述PCR擴增檢測試劑主要成分如下PCR緩沖液 終濃度為1×特異性擴增引物各10～80μM脫氧三磷酸核苷混合物 200～1000μMDNA聚合酶 0.5～5酶活力單位/反應(yīng)余量為滅菌純水。
3.如權(quán)利要求1所述的2型豬鏈球菌毒力基因PCR擴增檢測試劑盒，其特征在于所述PCR緩沖液以各組分在PCR擴增試劑中終濃度計，組成如下氯化鉀 500mMTris-Cl100mM氯化鎂 25mM聚乙二醇6000 0.1％1，4-二巰基蘇糖醇 0.1％牛血清白蛋白 1％。
4.如權(quán)利要求1所述的2型豬鏈球菌毒力基因PCR擴增檢測試劑盒，其特征在于所述瓊脂糖凝膠電泳試劑主要成分如下TBE緩沖液 終濃度為5×瓊脂糖 體積百分比為1‰溴化乙錠 體積百分比為1‰溴酚蘭 體積百分比為16.67％。
5.如權(quán)利要求1所述的2型豬鏈球菌毒力基因PCR擴增檢測試劑盒，其特征在于所述PCR擴增檢測試劑盒中還含有DNA抽提試劑，所述DNA抽提試劑為下列之一①Q(mào)iagen DNA抽提試劑、②Promega DNA抽提試劑、③TaKaRa DNA抽提試劑。
6.如權(quán)利要求1所述的2型豬鏈球菌毒力基因PCR擴增檢測試劑盒，其特征在于所述DNA聚合酶為下列之一①Ampli Taq DNA聚合酶、②rTaqDNA聚合酶、③Platinum Tag DNA聚合酶。
7.如權(quán)利要求1所述的2型豬鏈球菌毒力基因PCR擴增檢測試劑盒，其特征在于所述脫氧三磷酸核苷混合物為下列之一①dATP，dCTP，dGTP，dTTP物質(zhì)的量之比1∶1∶1∶1的混合物②dATP，dGTP，dCTP，dUTP物質(zhì)的量之比1∶1∶1∶1的混合物③dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP物質(zhì)的量之比4∶4∶4∶4∶1的混合物。
8.如權(quán)利要求1所述的2型豬鏈球菌毒力基因PCR擴增檢測試劑盒，其特征在于所述PCR擴增檢測試劑中各組份終濃度如下PCR緩沖液氯化鉀500mMTris-Cl 100mM氯化鎂25mM聚乙二醇6000 0.1％1，4-二巰基蘇糖醇 0.1％牛血清白蛋白 1％特異性擴增引物8對 各50μM脫氧三磷酸核苷混合物dATP 200μM，dCTP 200μM，dGTP 200μM，dTTP 200μM，dUTP 50μMrTaq DNA聚合酶0.5酶活力單位/反應(yīng)余量為滅菌純水。
9.一種2型豬鏈球菌毒力基因PCR擴增檢測方法，所述的檢測方法以SS2DNA對照模板為陽性對照，采用待測樣本的DNA為分析樣本，所述方法步驟如下(1)樣本DNA提?。?2)PCR擴增取PCR擴增檢測試劑，加入SS2 DNA對照模板與分析樣本的DNA分別進行擴增反應(yīng)；(3)擴增產(chǎn)物測定取擴增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠后，于凝膠成像儀下讀取數(shù)據(jù)、成像并保存結(jié)果；(4)結(jié)果分析參照梯度DNA梯度標準品圖像，在目的片段大小位置出現(xiàn)條帶的判斷為陽性；所述2型豬鏈球菌(Streptococcus suis Serotype 2，SS2)毒力基因PCR擴增檢測試劑盒，包括SS2 DNA對照模板、PCR擴增檢測試劑、瓊脂糖凝膠電泳試劑以及100bp梯度DNA標準品，所述PCR擴增檢測試劑主要包括PCR緩沖液、特異性擴增引物、脫氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶、滅菌純水；所述特異性擴增引物及目的片段大小為16S-195(s)5’-CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGA TAT-3’328bp16S-489(as2)5’-GTA AGA TAC CGT CAA GTG AGA A-3’cps2J-s5’-GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T-3’ 459bpcps2J-as5’-CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C-3’mrp-Fw5’-GGT ATA CCT TGC TGG TAC CGT TC-3’ 532bpmrp-Re5’-AGT CTC TAC AGC TGT AGC TGG-3’sly-Fw5’-AGT TCG CAC TTG ATT TTA AG-3’ 1500bpsly-Re5’-AAT ACA TTG CCA GAT TAC TC-3’gapdh-Fw5’-GGC GCC GAA TTC GTC GAC ATT ATT TAG CAA TTTTTG CG-3’ 1100bpgapdh-Re5’-CGC CGC GGA TCC GTA GTT AAA GTT GGT ATTAAC-3’ef-Fw5’-ACA AAG GCG TAG GTT CAA TC-3’ 269bpef-Re5’-CGG CAT CAA GAA TGT CTT TG-3’tuf-Fw5’-GTA CAG TTG CTT CAG GAC GTA TC-3’ 205bptuf-Re5’-ACG TTC GAT TTC ATC ACG TTG-3’CI6-s5’-GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT TAC TCA GTG CCGCAG CTA ACG CAT T-3’620bpCI7-as5’-CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC CCG ACT TCA CCCCAA TCA TCT ATC C-3’。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述步驟(2)PCR循環(huán)條件設(shè)置為94℃×5min；再按94℃×60sec、58℃×60sec、72℃×90sec，循環(huán)30次；最后72℃×5min，完成擴增。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種2型豬鏈球菌(Streptococcus suis Serotype 2，SS2)毒力基因PCR擴增檢測試劑盒，包括SS2DNA對照模板、PCR擴增檢測試劑、瓊脂糖凝膠電泳試劑以及DNA梯度標準品；本發(fā)明1次性測定SS27個重要基因，根據(jù)是否擴增出鏈球菌屬特異性基因、SS2種特異性基因及5個重要的SS2毒力相關(guān)基因，可對是否為鏈球?qū)俑腥尽⒂蟹馭S2感染作出鑒別診斷，且對SS2感染菌的毒力、侵襲力傾向及疾病的預(yù)后作出快速、早期預(yù)測，有利于臨床疑似病例的早期診斷和鑒別診斷，并有助于疾病流行及危害程度的早期預(yù)警，有望用于人感染SS2應(yīng)急檢測、疾病監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查和臨床早期快速實驗室診斷。
文檔編號C12N15/11GK101020929SQ20071006748
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日
發(fā)明者楊婷婷, 程蘇云, 徐寶祥, 王復(fù)甦, 張政, 朱水榮 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心