專利名稱：：環(huán)狀芽孢桿菌wz-12及其在微生物分解處理二氯甲烷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一抹可降解二氯甲烷的新菌抹一一環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12,及其在微生物分解處理二氯曱烷和制備二氯曱烷脫卣素酶中的應(yīng)用。(二)背景才支術(shù)二氯甲烷(CH2C12)是一類使用非常廣泛的化學(xué)試劑，主要在金屬材料去油污、紡織、印染、油漆行業(yè)和制藥工業(yè)等領(lǐng)域作溶劑使用。二氯曱烷屬異生物合成物(Xenobiotics)，為難降解有機(jī)污染物的典型，當(dāng)前被認(rèn)為是大氣污染中毒性較大的卣代烴類物質(zhì)，其廣泛使用帶來一系列環(huán)境污染問題，嚴(yán)重危及人類健康，并且破壞臭氧層，被美國EPA列為優(yōu)先污染物。Methylobacterium和Hyphomicrobium屬的某些菌4朱能利用二氯曱烷作為唯一碳源進(jìn)行生長，這些細(xì)菌含有參與反應(yīng)的關(guān)鍵酶_一二氯曱烷脫卣素酶，此酶屬于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶類，是誘導(dǎo)酶，能催化二氯甲烷礦化生成曱醛和無機(jī)氯。反應(yīng)途徑如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>難降解的有機(jī)污染物的生物法降解既是目前國際上環(huán)境污染控制
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的研究熱點(diǎn)，也是當(dāng)前和今后我國經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中需要解決的重要而迫切的科技問題，并具有廣闊的應(yīng)用前景。但由于以二氯曱烷為代表的卣代有機(jī)物水溶性不高，多不能直接被微生物酶系統(tǒng)所識(shí)別，甚至對(duì)微生物有代謝抑制作用。以現(xiàn)有微生物菌種的生物處理工藝難以奏效。其關(guān)鍵問題是高效降解途徑的缺乏和現(xiàn)有已知途徑的缺陷。發(fā)現(xiàn)微生物新品種和創(chuàng)建的新代謝途徑，一則可以進(jìn)行高效降解途徑的設(shè)計(jì)、組裝，以擴(kuò)展降解菌利用底物的范圍、避免有毒中間產(chǎn)物的形成，二則可以增加生物酶催化活性和穩(wěn)定性,提高底物通量及其生物可利用性等，是解決當(dāng)前這些問題的關(guān)鍵。自從1980年Rittmann等首次從工業(yè)廢水中分離出能以二氯甲烷作為唯一碳源和能源的曱基桿菌(Methylobacterium),到1990年ScholtzR發(fā)現(xiàn)二氯曱烷高效降解菌林假單胞菌DM11,迄今有報(bào)道相繼分離到包括生絲微菌(Hyphomicrobium)在內(nèi)的10多抹分解二氯甲烷的細(xì)菌，并對(duì)這些菌中的脫卣素酶進(jìn)行了研究，根據(jù)這些酶的性質(zhì)，把它們分成兩組，一組是活力較低的A組二氯曱烷脫囟素酶，另一組是活力較高的B組二氯曱烷脫卣素酶。迄今尚沒有環(huán)狀芽孢桿菌能以二氯曱烷作為碳源與能源的生物降解的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是為了提供一抹可降解二氯曱烷的新菌株一一環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12，及其在微生物分解處理二氯曱烷和制備二氯曱烷脫卣素酶中的應(yīng)用。為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12(5ac說wcz>cw/awWZ-12),保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2007年1月19日，保藏編號(hào)CCTCCNo:M207006。本發(fā)明所提供的二氯曱烷降解菌為自行分離篩選獲得，代號(hào)WZ-12,鑒定為環(huán)狀芽孑包桿菌(5ad〃wscz>cw/<ms),其16SrDNA全序歹'JGenBankaccessionno.EF100968。就目前所知，迄今尚沒有環(huán)狀芽孢桿菌能以二氯曱烷作為碳源與能源的生物降解的報(bào)道。本發(fā)明菌抹的獲得從浙江各地有記錄長期被二氯甲烷污染的土壤、廢水中，如杭州華東制藥廠暴氣池、新昌制藥廠暴氣池和杭州農(nóng)藥廠廢水污泥中采集樣品36份，通過樣品馴化，初篩，復(fù)篩，獲得具有二氯甲烷降解能力的純培養(yǎng)物。對(duì)該純培養(yǎng)物進(jìn)行了形態(tài)和生理生化鑒定，并對(duì)其16SrDNA全序列同源性作了分析，將其鑒定為環(huán)狀芽孢桿菌(S""7/船c/ww/"w)。另外通過分子歸層析和離子交換層析等手段，分離純化了該二氯曱烷降解菌WZ-12發(fā)酵液中的二氯甲烷脫卣酶組分。通過SDS-PAGE電泳測(cè)得分子量為30.8kD。菌林的鑒定1)菌林的細(xì)胞形態(tài)該菌呈桿狀，大小為(0.40.6jum)x(o.91.5jum)，端生單根鞭毛(見圖1)，革蘭氏染色為陰性。在無碳查氏固體培養(yǎng)基30。C培養(yǎng)23d后，菌落呈乳白潤澤，較小，圓形，邊緣整齊，表面光滑，不易挑起。2)菌株的生理生化特性接觸酶、過氧化氫酶陰性，可以葡萄糖、木糖、棉子糖、鼠李糖、蔗糖和麥芽糖發(fā)酵產(chǎn)酸，但不能利用肌糖、山梨醇和甘露糖。甲基紅反應(yīng)、V.P反應(yīng)陰性，吲哚反應(yīng)、淀粉水解和明膠液化陽性。DNA中的G+Cmol。/。為35.6。結(jié)果表明，菌林WZ-12的生理特征與芽孢桿菌屬(Bacz'〃wgem/s)的細(xì)菌種極為相似。3)菌林16SrDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育樹分析16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物見圖4，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果得到長度為1490bp的16SrDNA全長序列，并基于相關(guān)屬菌抹的16SrDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)。16SrDNAPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果得到長度為1490bp的全長序列(GenBankaccessionno.EF100968》如下151101151201GCTGTCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA2513019511001105111501201125113011351140114511490AGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTTCGT。菌林的生長特性培養(yǎng)條件在搖床上250ml三角燒瓶，以二氯曱烷為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基，即在微量元素培養(yǎng)基(MSM)中添加二氯甲烷，二氯曱烷終濃度為32mM,分4次加入。溫度30。C，起始pH7.5，檢測(cè)生物量、pH和比酶活的變化，每12小時(shí)檢測(cè)1次。結(jié)果如圖3。MSM配法KH2P04,6.8mg/ml;(NH4)2S04,0.2mg/ml;MgS04,O.lmg/ml;glycerol,5g在121。C下滅菌18分鐘后，補(bǔ)加0.25%Ca(NO3)4溶液1ml/L和痕量元素溶液1ml/L。痕量元素溶液MnCl2*4H20,0.2g/l;CoCl2'6H20,0.34g/l;ZnCl2,0.2g/l;CaCl2*2H20，0.4g/l;H3B03,0.038g/l;MC12*6H20,0.1g/l;Na2M0O4*4H2O,0.04g/l;NH4V03,0.04g/l;KI,0.8g/l。菌種的保存獲得的菌種分別采用斜面菌種在4。C冰箱it份、沙土管保存l份和制成凍干粉保存l份。所述的環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12可用于^f鼓生物分解處理二氯曱烷。所述的應(yīng)用為以二氯甲烷為唯一碳源和能源，對(duì)環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以培養(yǎng)獲得的菌液為酶源，使二氯甲烷礦化為氯離子和甲酸鹽。所述應(yīng)用為以二氯曱烷為唯一碳源和能源，對(duì)環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以培養(yǎng)獲得的菌液浸沒生物填料，掛膜后用于二氯曱烷分解處理，所述菌液細(xì)胞濃度為0.52Xl(^個(gè)/mL。所述菌液由如下方法得到將環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得菌懸液，菌懸液以0.52x1()S個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基的接種量接種到種子培養(yǎng)基中，30。C震蕩培養(yǎng)，48h后終止培養(yǎng)，得菌液；種子培養(yǎng)基各組分終濃度為NaN03,0.5~3g/L;K2HP04,0.52g/L;KCl，0.2~1.0g/L;MgS04*7H20,0.31.0g/L;FeS04,0.0050.02g/L;pH7.0~7.2,在121。C下滅菌20分鐘，氣態(tài)碳源CH2Cl2終濃度為32mM，培養(yǎng)時(shí)分4次加入；具體的，所述應(yīng)用按如下順序步驟進(jìn)行(l)斜面培養(yǎng)采用無碳查氏固體培養(yǎng)基，斜面涂布環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12菌種，定時(shí)滴加二氯曱烷，30。C下培養(yǎng)23天，獲得的單菌落轉(zhuǎn)入大試管斜面，在斜面的對(duì)側(cè)試管壁上放置滴有二氯曱烷的棉花，獲得斜面菌種；(2)將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得菌懸液，菌懸液以0.52x105個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基的接種量接種到種子培養(yǎng)基中，30。C震蕩培養(yǎng)，48h后終止培養(yǎng)，得菌液；種子培養(yǎng)基各組分終濃度為NaN03,2g/L;K2HP04,1g/L;KC1,0.5g/L;MgS04'7H20,0.5g/L;FeS04,0.01g/L;pH7.07.2，在121。C下滅菌20分鐘，CH2C12終濃度為32mM,培養(yǎng)時(shí)分4次加入；(3)將菌液轉(zhuǎn)入生物滴濾池，聚丙烯填料表面接種和掛膜，接種量為20%體積比，30天后，二氯曱烷氣體和循環(huán)液(循環(huán)液可為常見適用于環(huán)狀芽孢桿菌的營養(yǎng)液，本發(fā)明中采用循環(huán)液組成如下NaN03,0.5~3g/L;K2HP04,0.52g/L;KC1,0.21.0g/L;MgS04'7H20，0.3~1.0g/L;FeS04,0.005~0.02g/L;pH7.0~7.2)在滴濾池內(nèi)逆流操作，在循環(huán)液pH值7.0士0.5、溫度28.5士2。C、氣體空床停留時(shí)間15.0~16.0s、二氯甲烷進(jìn)口濃度為0.7~3.12g/m3W條件下進(jìn)行二氯曱烷廢氣處理。所述的環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12也可直接用于制備二氯曱烷脫卣素酶。所述二氯甲烷脫卣素酶由如下方法制備得到(1)環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得菌懸液，菌懸液以1x1(^個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，pH7.5、3(TC震蕩培養(yǎng)48h,得產(chǎn)酶培養(yǎng)物；種子培養(yǎng)基各組分終濃度為NaN03，2g/L;K2HP04,1g/L;KC1,0.5g/L;MgS04*7H20,0.5g/L;FeS04，0.01g/L;pH7.0~7.2,在121°C下滅菌20分鐘，CH2Cl2終濃度為32mM，培養(yǎng)時(shí)分4次加入；產(chǎn)酶培養(yǎng)基各組分終濃度為KH2P04,6.8g/L;(NH4)2S04，0.2g/L;MgS04,O.lg/L;甘油，5g/L;在121。C下滅菌18分鐘后，補(bǔ)加質(zhì)量濃度0.25%的Ca(N03)2溶液1ml/L和痕量元素溶液1ml/L;所述痕量元素溶液組成為MnCl2*4H20,0.2g/L;CoCl2*6H20,0.34g/L;ZnCl2,0.2g/L;CaCl2*2H20,0.4g/L;H3B03,0.038g/L;NiCl2*6H20,O.lg/L;Na2M0O4*4H2O,0,04g/L;NHtVCb,0.04g/L;KI,0.8g/L;(2)步驟(1)所得產(chǎn)酶培養(yǎng)物4°C,lOOOrpm離心15min，細(xì)胞沉淀用0.05MTris-HCl、pH7.5緩沖液水洗一次，得濕菌體，濕菌體懸浮于0.05MTris-HCl、pH7.5緩沖液中，超聲波破碎2次，4°C、15000rpm離心2次，每次15min,取上清液，即為粗酶液，粗酶液經(jīng)分離純化，即得所述二氯曱烷脫閨素酶。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供一林可降解二氯曱烷的新菌林一一環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12,該菌可在有氧條件下快速降解二氯曱烷，為以二氯甲烷為代表的卣代烴類有機(jī)污染物的生物降解機(jī)理的研究提供了重要的基礎(chǔ)，亦可以直接應(yīng)用在有機(jī)廢氣的生物處理工藝上。此外，該菌株為野生型，遺傳背景非常清晰，適于進(jìn)行遺傳改良，有望大幅度提高對(duì)有才幾廢氣的處理能力。圖1為菌株WZ-12染色特征和JEOL-1230掃描電鏡照片；圖2為基于16SrDNA序列同源性的菌林WZ-12和其他相關(guān)菌抹的系統(tǒng)發(fā)育樹；圖3為菌林WZ-12的生長特性pH(■)，生物量(*)，比酶活(0);圖4為菌抹WZ-12的16srDNA擴(kuò)增產(chǎn)物(M:marker;B:樣品條帶)；圖5為二氯曱烷脫囟素酶分子篩層析圖譜；圖6為二氯曱烷脫卣素酶Q-SepharoseHiprep16/10QXL柱層析圖譜；圖7為二氯甲烷脫卣素酶SepharoseF.F.柱層析圖譜；圖8為二氯曱烷脫卣素酶SDS-PAGE電泳圖譜(M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白；A和B:樣品條帶)；圖9為菌抹WZ-12固體培養(yǎng)圖示；1為培養(yǎng)基，2為含二氯甲烷的無菌棉花。環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12(Ba"7/ws">cw/araWZ-12),保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2007年1月19日，保藏編號(hào)CCTCCNo:M207006。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1:菌抹WZ-12來源二氯曱烷脫卣素酶的制備與分離純化(1)菌林的產(chǎn)酶培養(yǎng)采用無碳查氏液體培養(yǎng)基，在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得菌懸液，10ml菌懸液(1x106)接種到裝有100ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，用橡皮塞蓋緊瓶口，30。C震蕩培養(yǎng)，CH2Cl2的終濃度為32mmol/L,分4次加入，每次8mmol/L，pH7.5，48h終止培養(yǎng)，得產(chǎn)酶培養(yǎng)物。種子培養(yǎng)基各組份終濃度為NaN03,2g;K2HP04,1g;KC1,0.5g;MgS04*7H20,0.5g;FeS04，0.01g;H20,1000ml;pH7.07丄在121°C下滅菌20分鐘。氣態(tài)碳源CH2C12終濃度為32mM,培養(yǎng)時(shí)分4次加入。產(chǎn)酶培養(yǎng)基各組分終濃度為KH2P04，6.8g/L;(NH4)2S04,0.2g/L;MgS04,O.lg/L;甘油，5g/L;在121。C下滅菌18分鐘后，補(bǔ)加質(zhì)量濃度0.25%的Ca(NOs)2溶液1ml/L和痕量元素溶液1ml/L;痕量元素溶液組成為MnCl2*4H20，0.2g/L;CoCl2*6H20，0.34g/L;ZnCl2，0.2g/L;CaCl2*2H20,0.4g/L;H3B03,0.038g/L;NiCl2*6H20,O.lg/L;Na2M0O4'4H2O,0.04g/L;NH4V03,0.04g/L;KI，0.8g/L;(2)新鮮濕細(xì)胞的獲得產(chǎn)酶培養(yǎng)物4°C,lOOOOrpm離心15min,細(xì)胞沉淀用0.05MTris-HCl(pH7.5)洗一次，貝i存?zhèn)溆谩?3)二氯甲烷脫卣素酶的分離純化2g新鮮濕細(xì)胞懸浮于0.05MTris-HCl,pH7.5緩沖液中，超聲波破碎兩次，4°C,15000rpm離心兩次，每次15min,上清液即為粗酶液。粗酶液中加入硫酸銨鹽至40%(質(zhì)量含量)飽和度，4。C下過夜。離心，去除雜蛋白，取上清液測(cè)酶活，于上清液中緩慢補(bǔ)加硫酸銨至80%(質(zhì)量含量)飽和度，4。C過夜，收集沉淀，上清液測(cè)酶活，確定上清液中沒有酶活。使用AKTAFPLC層析系統(tǒng)，先將經(jīng)過預(yù)處理的粗酶液上SephadexG-75分子篩，酶蛋白得到初步分離，只有出現(xiàn)的第一個(gè)峰的前半部分具有很高的脫卣酶活(圖5)。然后，收集上述具有酶活性的蛋白峰樣品上樣于以A液(0.05MTris-HCl,pH7.5緩沖液)預(yù)平衡的Q-SepharoseHiprep16/10QXL柱進(jìn)行陰離子交換層析，用B液(含1.0MNaCl的A液)溶液進(jìn)行線性梯度洗脫，得到2個(gè)蛋白峰，酶活力最高部分集中在第2個(gè)蛋白峰內(nèi)(圖6),將這部分蛋白經(jīng)超濾濃縮，調(diào)pH至7.2,然后通過預(yù)先用0.05MTris-HCl,pH7.5緩沖液平衡的SepharoseF.F^i(1.0x5mL)進(jìn)行第二次強(qiáng)陰離子交換層析，用1.0mol/LNaCl(于緩沖液中)線性梯度洗脫(2mL/min),得到一個(gè)酶活力蛋白峰(圖7)。整個(gè)提純過程如表1。經(jīng)過以上分離純化過程，只得到一個(gè)二氯曱烷脫卣素酶組分，對(duì)樣品進(jìn)行電泳分析表明，在SDS-PAGE膠上形成單一條帶，確定其分子量約為30.8kD(圖8)。表明該組分已達(dá)電泳純。在整個(gè)提純過程中，二氯曱烷脫面素酶被提純8.27倍，收率34.83%(見表1)。表l:菌抹WZ-12二氯曱烷脫卣素酶的提純<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例2:菌林WZ-12在生物過濾處理二氯曱烷中的應(yīng)用(1)菌林培養(yǎng)采用無碳查氏固體培養(yǎng)基如圖9方法培養(yǎng)，首先在固體培養(yǎng)基表面涂布菌種，然后在亞蓋上加一大塊無菌棉花，棉花中滴適量的二氯曱烷，置30。C下培養(yǎng)，定時(shí)補(bǔ)加二氯曱烷。對(duì)照平板的棉花中加無菌生理鹽水，培養(yǎng)23天后，獲得的單菌落轉(zhuǎn)入大試管斜面，在斜面的對(duì)側(cè)試管壁上放置滴有二氯曱烷的棉花，便可獲得斜面菌種。(2)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)斜面菌種在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得菌懸液，50ml菌懸液(細(xì)胞濃度lxl()S個(gè)/mL)接種到裝有1000ml種子培養(yǎng)基的5L三角瓶中，用橡皮塞蓋緊瓶口，30。C震蕩培養(yǎng)，48h終止培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基各組分終濃度為NaN03,2g/L;K2HP04,1g/L;KC1,0.5g/L;MgS04*7H20，0.5g/L;FeS04，0.01g/L;pH7.0~7.2，在121。C下滅菌20分鐘，CH2C12終濃度為32mM,培養(yǎng)時(shí)分4次加入；(3)以上方法獲得的菌懸液(濃度lxl()S個(gè)/ml),在050mm的有機(jī)玻璃生物滴濾池內(nèi)，聚丙烯填料表面接種和掛膜，接種液(組成NaN03,2.5g/L;K2HP04,1.5g/L;KC1,0.6g/L;MgS04*7H20,0.8g/L;FeS04,0.015g/L;pH7.2)48L，接種菌懸液約9.6L,接種和掛膜約需30天。二氯曱烷模擬氣體和循環(huán)液在滴濾池內(nèi)逆流操作，循環(huán)液pH值為7.0±0.5,溫度維持在28.5士2。C的條件下，在氣體空床停留時(shí)間為15.7s、二氯曱烷進(jìn)口濃度為0.73.12g/m3的范圍內(nèi)，去除效率為72.0%~89.1%。實(shí)施例3:采用工業(yè)微生物育種方法提高二氯曱烷降解效率以本發(fā)明菌抹WZ-12為出發(fā)菌抹，采用無碳查氏固體培養(yǎng)基如實(shí)施例1的方法獲得菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)物，采用紫外輻照結(jié)合6QCoy射線誘變的工業(yè)微生物育種方法，獲得遺傳改良的降解菌抹，對(duì)該菌抹與它的出發(fā)菌株的降解能力進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果顯示，對(duì)二氯曱烷的降解能力提高了24~32%。具體方法如下(1)菌種誘變程序出發(fā)抹—紫外線輻照—初篩、復(fù)篩—6GCoY射線輻照—初篩、復(fù)篩—二氯曱烷高降解效率菌株。(2)紫外線誘變處理取培養(yǎng)35d的新鮮斜面，用無菌生理鹽水洗下菌莒制成菌懸液，經(jīng)玻璃珠振蕩打散和脫脂棉過濾后，調(diào)整菌懸液濃度1()s個(gè)/mL左右，吸取5mL菌懸液至無菌的小平皿中，在25W紫外燈(距離30cm)照射下，磁力攪拌，照射時(shí)間才艮據(jù)致死率確定，菌懸液在無菌室紅燈下適當(dāng)稀釋涂平壽反，平板倒置于30。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7~8d。(3)^CoY射線輻照處理采用培養(yǎng)好的新鮮試管斜面直接進(jìn)行輻照。分別以0.5kGy、2.0kGy劑量對(duì)試管中菌體進(jìn)行^CoY射線輻照，用無菌生理鹽水將經(jīng)輻照處理后的斜面制成孢子懸液,并經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂平板，平板倒置于3(TC恒溫箱中培養(yǎng)7~8d。(4)初篩和復(fù)篩采用無碳查氏固體培養(yǎng)基，以二氯甲烷為唯一碳源和能源，采用氣態(tài)碳源提供方法進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，挑選單菌落，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基，上搖床通過檢測(cè)降解效率進(jìn)行復(fù)篩。(4)降解能力對(duì)比試驗(yàn)改良菌株與它的出發(fā)菌林的降解能力對(duì)比試驗(yàn)是在250mL三角瓶?jī)?nèi)上搖床分別檢測(cè)降解效率。序列表[1].ST25SEQUENCELISTING<110〉浙江工業(yè)大學(xué)<120>環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12及其在微生物分解處理二氯甲烷中的應(yīng)用<130><160〉1<170>Patentlnversion3,2<210〉1〈211>1490<212>DNA<213>Bacilluscirculans〈400>1ctgggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggactt犯aa60agcttgctttttaagttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaag120actgggat朋cttcgggaaaccggagct犯t8ccggata8tcctttcctactcatgtagg180aB3gctgaaagacggtttacgctgtcacttac卿tgggcccgcggcgcattagctagtt240ggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgageigggtgatcggcca300cactgggactg,cacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgca360atggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatg鄉(xiāng)gttttcggatcgtaaaa420ctctgttgttagggaag犯caagtacgagagtaactgctcgtetccttgacggtacct犯c480cagaaagccacggct犯cteicgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttg540tccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtcctttaagtctgatgtgaaagccc600acggctcaaccgtggagggtCattgg333Ctgggggacttgagtgcagaa660g犯ttccacgtgtagcggtga犯tgcgtag卿tgtggaggaacaccagtggcg犯ggcg720actctttggtctgtaactgacgctgaggcgcg,gcgtggggagcsaacaggattsg3t7803CCCtggt3gtccacgccgttgctaagtgtt柳gggtttccgcccttta840gtgctgcagca犯cgcattaagcactccgcctggggagtacggccgc卿gCtg333CtC900犯3gg33ttgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgc960gaagaaccttaccaggtcttgacatctcctgac^tcct3gagataggacgttccccttc1020ggggg織ggatg織ggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggt1080taagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactcta1140aggtgactgccggtgac3犯ccggagg鄉(xiāng)gtggggatgacgtcaaatcatcatgcccct1200tatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggcagcaaaaccgcgsgg1260tcgagccaatcccatsaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatg1320犯gctggaiEitcgct3gtaatcgcggstcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggcctt1380gtacacaccgcccgtcacaccacgsgagtttgtaacacccg卿tcggtggggt幼ccct1440tctgggagccagccgcct犯ggtggg由gatgattggggtg犯gttcgt1490權(quán)利要求1.環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12(BacilluscirculansWZ-12)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2007年1月19日，保藏編號(hào)CCTCCNoM207006。2.如權(quán)利要求1所述的環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12，其特征在于所述環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12菌落特征和生理生化特性為桿狀，大小為0.40.6jumx0.91.5jim,端生單根鞭毛，革蘭氏染色為陰性，在無碳查氏固體培養(yǎng)基30。C培養(yǎng)23d后，菌落呈乳白潤澤，較小，圓形，邊緣整齊，表面光滑，不易挑起；接觸酶、過氧化氬酶陰性，曱基紅反應(yīng)、V.P反應(yīng)陰性，p引哚反應(yīng)陽性，淀粉水解陽性，明膠液化陽性。3.如權(quán)利要求1所述的環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12,其特征在于所述環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12的16SrDNA序列為501CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTA651GAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAG751CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT1201TATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCAGCAA1301AACCGCGAGGTCGAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTA1351GGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAG1401CATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACAC1451CACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCCTTCTGGGAGCC1490AGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTTCGT。4.如權(quán)利要求13之一所述的環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12在微生物分解處理二氯曱烷中的應(yīng)用。5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為以二氯曱烷為唯一碳源和能源，對(duì)環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以培養(yǎng)獲得的菌液為酶源，使二氯甲烷礦化為氯離子和曱酸鹽。6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為以二氯曱烷為唯一碳源和能源，對(duì)環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以培養(yǎng)獲得的菌液浸沒生物填料，掛膜后用于二氯曱烷分解處理，所述菌液細(xì)胞濃度為0.5-2Xl()6個(gè)/mL。7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述菌液由如下方法得到將環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得菌懸液，菌懸液以0.5~2x1(每個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基的接種量接種到種子培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)，48h后終止培養(yǎng)，得菌液；種子培養(yǎng)基各組分終濃度為NaN03，0.5~3g/L;K2HP04,0.5~2g/L;KCl，0.2~1.0g/L;MgS04*7H20,0.31.0g/L;FeS04,0.0050.02g/L;pH7.07.2,在121。C下滅菌20分鐘，氣態(tài)碳源CH2Cl2終濃度為32mM，培養(yǎng)時(shí)分4次加入；8.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用按如下順序步驟進(jìn)行:(1)斜面培養(yǎng)采用無碳查氏固體培養(yǎng)基，斜面涂布環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12菌種，定時(shí)滴加二氯甲烷，30。C下培養(yǎng)23天，獲得的單菌落轉(zhuǎn)入大試管斜面，在斜面的對(duì)側(cè)試管壁上放置滴有二氯曱烷的棉花，獲得斜面菌種；(2)將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得菌懸液，菌懸液以0.5~2x106個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基的接種量接種到種子培養(yǎng)基中，30。C震蕩培養(yǎng)，48h后終止培養(yǎng)，得菌液；種子培養(yǎng)基各組分終濃度為NaN03,2g/L;K2HP04,1g/L;KC1,0.5g/L;MgS04*7H20,0.5g/L;FeS04，0.01g/L;pH7.07.2，在121。C下滅菌20分鐘，CH2C12終濃度為32mM,培養(yǎng)時(shí)分4次加入；(3)將菌液轉(zhuǎn)入生物滴濾池，聚丙烯填料表面接種和掛膜，接種量為20%體積比，30天后，二氯曱烷氣體和循環(huán)液在滴濾池內(nèi)逆流才喿作，在循環(huán)液pH值7.0士0.5、溫度28.5土2。C、氣體空床停留時(shí)間15.0~16.0s、二氯曱烷進(jìn)口濃度為0.73.12g/m3的條件下進(jìn)行二氯甲烷廢氣處理。9.如權(quán)利要求1~3之一所述的環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12在制備二氯甲烷脫卣素酶中的應(yīng)用。10.如權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于所述二氯曱烷脫囟素酶由如下方法制備得到(1)環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得菌懸液，菌懸液以1x1()6個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，pH7.5、30。C震蕩培養(yǎng)48h,得產(chǎn)酶培養(yǎng)物；種子培養(yǎng)基各組分終濃度為NaN03,2g/L;K2HP04，1g/L;KC1,0.5g/L;MgS04*7H20，0.5g/L;FeS04,0.01g/L;pH7.07.2,在121°C下滅菌20分鐘，CH2Cl2終濃度為32mM,培養(yǎng)時(shí)分4次加入；產(chǎn)酶培養(yǎng)基各組分終濃度為KH2P04,6.8g/L;(NH4)2S04，0.2g/L;MgS04,O.lg/L;甘油，5g/L;在121。C下滅菌18分鐘后，補(bǔ)加質(zhì)量濃度0.25%的Ca(N03)2溶液1ml/L和痕量元素溶液1ml/L;所述痕量元素溶液組成為MnCl2*4H20，0.2g/L;CoCl2*6H20,0.34g/L;ZnCl2，0.2g/L;CaCl2'2H20,0.4g/L;H3B03,0.038g/L;NiCl2*6H20,O.lg/L;Na2M0O4*4H2O，0.04g/L;NH4V03，0.04g/L;KI,0.8g/L;(2)步驟(1)所得產(chǎn)酶培養(yǎng)物4。C,lOOOrpm離心15min，細(xì)胞沉淀用0.05MTris-HCl、pH7.5緩沖液水洗一次，得濕菌體，濕菌體懸浮于0.05MTris-HCl、pH7.5緩沖液中，超聲波破碎2次，4°C、15000rpm離心2次，每次15min,取上清液，即為粗酶液，粗酶液經(jīng)分離純化，即得所述二氯曱烷脫卣素酶。全文摘要本發(fā)明提供了一株可降解二氯甲烷的新菌株——環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12，及其在微生物分解處理二氯甲烷和制備二氯甲烷脫鹵素酶中的應(yīng)用。環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12(BacilluscirculansWZ-12)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2007年1月19日，保藏編號(hào)CCTCCNoM207006。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供一株可降解二氯甲烷的新菌株——環(huán)狀芽孢桿菌WZ-12，該菌可在有氧條件下快速降解二氯甲烷，為以二氯甲烷為代表的鹵代烴類有機(jī)污染物的生物降解機(jī)理的研究提供了重要的基礎(chǔ)，亦可以直接應(yīng)用在有機(jī)廢氣的生物處理工藝上。此外，該菌株為野生型，遺傳背景非常清晰，適于進(jìn)行遺傳改良，有望大幅度提高對(duì)有機(jī)廢氣的處理能力。文檔編號(hào)C12N1/20GK101200697SQ200710067510公開日2008年6月18日申請(qǐng)日期2007年3月2日優(yōu)先權(quán)日2007年3月2日發(fā)明者吳成強(qiáng),吳石金,張麗麗,朱潤曄,王家德,陳建孟申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué);陳建孟;吳石金