專利名稱：一種單胺氧化酶活性的熒光檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，尤其是一種以香豆素類化合物為熒光探針的單胺氧化酶活性的熒光檢測方法。
背景技術(shù)：
單胺氧化酶是一類線粒體膜結(jié)合酶，它在大腦和周圍神經(jīng)組織中催化生物體內(nèi)的胺類化合物，氧化脫氨生成相應(yīng)的醛。研究表明單胺氧化酶在代謝多巴胺的過程中，伴隨產(chǎn)生自由基和過氧化氫等內(nèi)源性物質(zhì)，其表達量的異常與帕金森病和抑郁癥有著極其密切的關(guān)系。此外測定分析患者血液中單胺氧化酶活性，對于急、慢性肝炎，肝硬化早期診斷具有重要價值。因此尋找高靈敏度的單胺氧化酶的檢測方法具有較大的科研和臨床應(yīng)用價值。然而目前臨床診斷中所用的熒光試劑采取非直接法檢測單胺氧化酶的活性，準(zhǔn)確性不高。
目前有多種方法檢測單胺氧化酶的活性紫外法，分光光度法，放射性法以及熒光法等。前兩種方法的靈敏度不高，而放射性法雖具有較高的靈敏度，但是它需要放射性標(biāo)記的化合物，操作上有一定的危險性。
因此，設(shè)計出一種更為快速、靈敏、有效的單胺氧化酶的檢測方法是相當(dāng)必要和迫切的，而熒光探針作為一種非放射性的標(biāo)記技術(shù)，因其具有較好的安全性和較高的靈敏度而被廣泛應(yīng)用于細胞內(nèi)、外酶蛋白活性的檢測。目前雖然有一些通過熒光探針檢測和分析單胺氧化酶的方法，但其制備都較為復(fù)雜，缺少一種簡單、有效的熒光探針檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，方法所用到的熒光探針制備方法簡單，性質(zhì)穩(wěn)定，檢測的精確度、準(zhǔn)確度高，檢測速度快。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，所述方法是以單胺氧化酶水解熒光探針形成熒光物質(zhì)，測定熒光強度，獲得單胺氧化酶活性數(shù)據(jù)；其特征在于所述熒光探針為香豆素類化合物，所述香豆素類化合物結(jié)構(gòu)如式(1)所示 式中，R1、R2各自獨立為H或C1～C6的烷基。較好的，所述的R1、R2各自獨立為H、CH3或C2H5，即所述的香豆素類化合物為7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素、7-[3-(二甲基氨基)-丙氧基]-香豆素、7-[3-(二乙基氨基)-丙氧基]-香豆素、7-[3-(甲乙基氨基)-丙氧基]-香豆素、7-[3-(甲基氨基)-丙氧基]-香豆素或7-[3-(乙基氨基)-丙氧基]-香豆素；更優(yōu)選的，R1、R2各自獨立為H。
所述的方法為將待測單胺氧化酶活性的樣品溶于離心管(EP管)中，取部分放入pH7.4～9.0的硼酸緩沖液中，25～40℃恒溫預(yù)熱后，加入香豆素類化合物及BSA溶液反應(yīng)，反應(yīng)完全后檢測其熒光強度，進而獲得單胺氧化酶活性數(shù)據(jù)。所述的硼酸緩沖液濃度推薦為50mM。
預(yù)熱時可在恒溫水浴搖床中進行，預(yù)熱時間以5～10min為宜。檢測熒光強度時可在全功能熒光分光光度計中的96孔篩板中檢測。
較為具體的，單胺氧化酶活性的熒光檢測方法為將待測單胺氧化酶活性的樣品溶于EP管中，按照1∶9(V/V)的比例將樣品放入pH8.4的硼酸緩沖液中，35℃恒溫預(yù)熱后，加入所述的香豆素類化合物及BSA溶液，終濃度分別為香豆素類化合物5-500umol/L，BSA0.2-20mg/mL，反應(yīng)完全，在96孔篩板中用全功能熒光分光光度計檢測，獲得單胺氧化酶的活性數(shù)據(jù)。
較好的，緩沖液中香豆素類化合物的終濃度為50umol/L，BSA的終濃度為1-2mg/mL。
以所述的香豆素類化合物為7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素為例，所述的方法按照以下步驟進行將待測單胺氧化酶活性的樣品溶于EP管中，取100體積份EP管中的溶液放入900體積份50mM pH8.4的硼酸緩沖液中，置于恒溫水浴搖床中，35℃預(yù)熱5min，加入5體積份濃度為10mM7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素溶液和2體積份的1g/mLBSA反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，在96孔篩板中用全功能熒光分光光度計檢測。
方法中所述香豆素類化合物可按如下方法制備得到將7-羥基-香豆素與NaH溶于二甲基亞砜中，充分混勻后，加入N-Boc-3-溴丙胺類化合物，加熱至回流溫度下反應(yīng)8～10小時，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到N-Boc香豆素類化合物，再將所述的N-Boc香豆素類化合物與20％(體積濃度)三氟乙酸水溶液混合，加入二氯甲烷溶劑，室溫反應(yīng)2～3小時，除去溶劑及三氟乙酸(TFA)，即得所述香豆素類化合物，各物質(zhì)的投料物質(zhì)的量比為7-羥基-香豆素NaH∶N-Boc-3-溴丙胺類化合物為1∶1.0～1.5∶1.0～1.5，N-Boc香豆素類化合物與三氟乙酸物質(zhì)的量比為1∶5～20，加入的二氯甲烷的體積量為N-Boc香豆素類化合物質(zhì)量的8～12倍。
所述反應(yīng)液分離純化方法可如下進行在反應(yīng)液中加入飽和NaCl溶液，用乙酸乙酯萃取，萃取得到液體脫水、過濾、蒸干，即得所述N-Boc香豆素類化合物。
更為具體的，檢測時取單胺氧化酶提取液，離心，取沉淀用生理鹽水溶解，再次離心，取沉淀溶于EP管，再按照以上操作方法放入pH8.4的硼酸緩沖液溶解，加入BSA及熒光探針進行反應(yīng)，于全功能熒光分光光度計的96孔篩板中，實時檢測熒光強度。
可根據(jù)米氏方程將得到的熒光強度換算出單胺氧化酶活性的各種反應(yīng)常數(shù)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果體現(xiàn)在(1)所用熒光探針制備所需要的設(shè)備簡單，操作過程簡便，原料來源都已商品化容易得到，并且所制備的單胺氧化酶熒光探針性質(zhì)很穩(wěn)定，純度也很高(99％以上)；(2)與以前所用的檢測單胺氧化酶活性的基本方法相比，其精確度、靈敏度和檢測速率都有很大的提高，耗時則僅需幾分鐘。


圖1為實施例2探針選擇性試驗的檢測結(jié)果圖。
圖2為實施例3加入單胺氧化酶抑制劑的對比圖。
具體實施例方式以下以具體實施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護范圍不限于此實施例1以從大鼠肝提取的單胺氧化酶為例，用制備的7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素作為熒光探針檢測單胺氧化酶活性將從大鼠肝提取的單胺氧化酶的待測樣品溶于1ml EP管中，取100uL放入900uL 50mM pH8.4的硼酸緩沖液中，置于恒溫水浴搖床中，35℃預(yù)熱5min，加入5μl濃度為10mM的7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素和2μl的1g/mL BSA反應(yīng)液進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，在96孔篩板中用全功能熒光分光光度計檢測。
實驗證明，只要存在微量的單胺氧化酶(5～10mmol/L)，就能高效的水解熒光探針，通過全功能微孔板檢測系統(tǒng)測定出熒光強度從1000增加到20000，變化的幅度較大，直觀地得出單胺氧化酶的活性的變化，再根據(jù)米氏方程得到酶的各種反應(yīng)常數(shù)。
實施例2采用與實施例1相同的方法，采用以下酶制劑對底物進行作用脂肪酶(EC3.1.1.3 Type VII from Candida rugosa，和hog pancreas國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，磷酸酶(Phosphatase，Alkalinebovine)，多種蛋白酶(Protease from Aspergillus oryzae，Proteasefrom Aspergillus sojae，Protease from bovine pancreas)和一種復(fù)合酶(BS-031江門市蓮江區(qū)拜奧生物化學(xué)廠)，結(jié)果顯示，只有單胺氧化酶顯示強烈的熒光，結(jié)果如圖1所示，只有單胺氧化酶能使底物轉(zhuǎn)化，也說明了起到水解作用的是我們提取所得的單胺氧化酶，而其他的酶對底物沒有作用。
實施例3取100μl pH8.4的硼酸緩沖液，加入單胺氧化酶提取液15μl，0.1mM的單胺氧化酶抑制劑--鹽酸羥胺溶液2μl，置于35℃恒溫水浴搖床中，30分鐘后，按照實施例1的量加入7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素及BSA溶液反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，在全功能熒光分光光度計中的96孔篩板中用全功能熒光分光光度計檢測，實時檢測熒光強度。
實驗證明，單胺氧化酶的活性被鹽酸羥胺抑制后，用我們制備的探針檢測不出活性，結(jié)果如圖2所示。
實施例4～8采用實施例1的方法，將7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素分別用以下香豆素類化合物替代作為熒光探針，實施例4為7-[3-(二甲基氨基)-丙氧基]-香豆素，實施例5為7-[3-(二乙基氨基)-丙氧基]-香豆素，實施例6為7-[3-(甲乙基氨基)-丙氧基]-香豆素，實施例7為7-[3-(甲基氨基)-丙氧基]-香豆素，實施例8為7-[3-(乙基氨基)-丙氧基]-香豆素，結(jié)果表明單胺氧化酶對這類探針具有專一性。
權(quán)利要求
1.一種單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，所述方法是以單胺氧化酶水解熒光探針形成熒光物質(zhì)，測定熒光強度，獲得單胺氧化酶活性數(shù)據(jù)；其特征在于所述熒光探針為香豆素類化合物，所述香豆素類化合物結(jié)構(gòu)如式(1)所示 式中，R1、R2各自獨立為H或C1～C6的烷基。
2.如權(quán)利要求1所述的單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述的R1、R2各自獨立為H、CH3或C2H5。
3.如權(quán)利要求2所述的單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述的R1、R2各自獨立為H。
4.如權(quán)利要求1所述的單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述的方法為將待測單胺氧化酶活性的樣品溶于離心管中，取部分放入pH7.4～9.0的硼酸緩沖液中，25～40℃恒溫預(yù)熱后，加入香豆素類化合物及BSA溶液反應(yīng)，反應(yīng)完全，檢測其熒光強度，獲得單胺氧化酶活性數(shù)據(jù)。
5.如權(quán)利要求4所述的單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述的方法為將待測單胺氧化酶活性的樣品溶于離心管中，按照19(V/V)的比例將樣品放入pH8.4的硼酸緩沖液中，35℃恒溫預(yù)熱后，加入所述的香豆素類化合物及BSA溶液，終濃度分別為香豆素類化合物5-500umol/L，BSA 0.2-20mg/mL，反應(yīng)完全，在96孔篩板中用全功能熒光分光光度計檢測，獲得單胺氧化酶活性數(shù)據(jù)。
6.如權(quán)利要求5所述的單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，其特征在于香豆素類化合物在緩沖液中的終濃度為50umol/L，BSA在緩沖液中的終濃度為1-2mg/mL。
7.如權(quán)利要求6所述的單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述的香豆素類化合物為7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素，所述的方法按照以下步驟進行將待測單胺氧化酶活性的樣品溶于離心管中，取100體積份離心管中的溶液放入900體積份50mM pH8.4的硼酸緩沖液中，置于恒溫水浴搖床中，35℃預(yù)熱5min，加入5體積份濃度為10mM7-(3-氨基-丙氧基)-香豆素溶液和2體積份的1g/mL BSA溶液反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，在96孔篩板中用全功能熒光分光光度計檢測。
8.如權(quán)利要求1或2所述的單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述香豆素類化合物由如下方法制備得到將7-羥基-香豆素與NaH溶于二甲基亞砜中，充分混勻后，加入N-Boc-3-溴丙胺類化合物，加熱至回流溫度下反應(yīng)8～10小時，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到N-Boc香豆素類化合物，再將所述的N-Boc香豆素類化合物與體積濃度為20％的三氟乙酸水溶液混合，加入二氯甲烷溶劑，室溫反應(yīng)2～3小時，除去溶劑及三氟乙酸，即得所述香豆素類化合物，各物質(zhì)的投料物質(zhì)的量比為7-羥基-香豆素∶NaH∶N-Boc-3-溴丙胺類化合物為1∶1.0～1.5∶1.0～1.5，N-Boc香豆素類化合物與三氟乙酸物質(zhì)的量比為1∶5～20，加入的二氯甲烷的體積量為N-Boc香豆素類化合物質(zhì)量的8～12倍。
9.如權(quán)利要求8所述的單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述反應(yīng)液分離純化方法如下在反應(yīng)液中加入飽和NaCl溶液，用乙酸乙酯萃取，萃取得到液體脫水、過濾、蒸干，即得所述N-Boc香豆素類化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶活性的熒光檢測方法，所述方法是以單胺氧化酶水解熒光探針形成熒光物質(zhì)，測定熒光強度，獲得單胺氧化酶活性數(shù)據(jù)；所述熒光探針為香豆素類化合物，結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示，式中，R
文檔編號C12Q1/26GK101021467SQ200710067620
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月19日
發(fā)明者朱勍, 陸優(yōu)優(yōu), 戴斌, 戴一琦 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)