專利名稱：一種高活性雞溶菌酶的基因克隆、表達(dá)與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)制藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種高活性雞溶菌酶的基因克隆、表達(dá)與應(yīng)用，基因工程重組方法生產(chǎn)雞溶菌酶的方法。
背景技術(shù)：
溶菌酶主要存在于動(dòng)植物的組織液和某些微生物體內(nèi)，如鼻粘液、眼淚、唾液、卵蛋白、枯草桿菌培養(yǎng)物和某些蔬菜中。該酶能水解細(xì)菌的細(xì)胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4-糖苷鍵，故又稱胞壁質(zhì)酶，即N-乙酰胞壁質(zhì)糖苷聚糖水解酶。
其中對(duì)雞蛋清溶菌酶的研究最清楚，它是由129個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的一種堿性蛋白，分子量約為14KD，對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)堿不穩(wěn)定，對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌有較強(qiáng)的殺菌作用。可藥用，具抗菌、清除局部壞死組織、止血、消腫、消炎等作用。在食品工業(yè)上可用作防腐劑，還可添加在牙膏中作為防治齲齒的藥用牙膏。在發(fā)酵工業(yè)上是一種重要的溶菌劑，用于分解細(xì)胞壁，制備無菌體提取液。
目前，從雞蛋清提取溶菌酶以及從霉菌中提取溶菌酶均已達(dá)工業(yè)化生產(chǎn)水平，市場(chǎng)銷售的溶菌酶大多來源于雞蛋蛋清中工業(yè)化提取的，價(jià)格較高。但隨著國(guó)內(nèi)外需求量的增大，市場(chǎng)上溶菌酶供不應(yīng)求；同時(shí)溶菌酶的生產(chǎn)也受到原材料的限制，無法滿足市場(chǎng)上溶菌酶的需求。因此，提高溶菌酶的產(chǎn)量與活性是一個(gè)急需解決的重要問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是為了克服上述技術(shù)的不足，而提供了一種高活性雞溶菌酶的基因克隆、表達(dá)與應(yīng)用，通過發(fā)酵大批量生產(chǎn)溶菌酶的方法，本方法生產(chǎn)的溶菌酶是在篩選多種雞蛋溶菌酶的基礎(chǔ)上，獲得了高生物活性、高表達(dá)的溶菌酶基因。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案。這種DNA分子，它編碼具有雞溶菌酶蛋白活性的多肽核苷酸序列，多肽核苷酸序列如附圖1所示，載體含有上述的DNA序列。本發(fā)明采用真核表達(dá)載體pPIC6αA、pGAPZαA與畢赤酵母宿主菌X-33進(jìn)行重組雞蛋清溶菌酶的表達(dá)。
本發(fā)明的解決方法是分離獲得一種具有高活性的雞蛋溶菌酶基因，經(jīng)過PCR擴(kuò)增、酶切等操作后，克隆到真核表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化整合到畢赤酵母基因組內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，然后提取、純化出高活性雞蛋清溶菌酶。
這種生產(chǎn)基因工程雞溶菌酶的方法，具體步驟如下(a)、將篩選獲得的LYS蛋白質(zhì)的核苷酸序列可操作性的連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成LYS表達(dá)載體，所述的核苷酸編碼一多肽，所述的多肽具有溶菌酶活性；(b)、將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成表達(dá)LYS蛋白的重組細(xì)胞；(c)、在適合表達(dá)LYS多肽的條件下，培養(yǎng)、表達(dá)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)、分離純化出LYS蛋白。
本發(fā)明蛋白表達(dá)方法中的提取工藝為工程菌種接種于BMGY培養(yǎng)基中，28℃，300rpm條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，離心收集菌體；重新懸浮、接種于含BMMY培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，流加100％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，控制溶氧度在30％以上，28℃條件下發(fā)酵100h，離心收集上清液，透析去離子，經(jīng)過陽離子交換樹脂層析柱，連續(xù)洗脫留取活性峰液，再透析去離子，經(jīng)活性鑒定后分裝凍干，即為成品。
雞蛋溶菌酶作為飼料添加劑的應(yīng)用，其使用方法為按重量百分比計(jì)，溶菌酶添加量為10000～100000U/kg。
本發(fā)明有益的效果由于采用基因工程重組技術(shù)，發(fā)酵生產(chǎn)基因重組雞蛋清溶菌酶，能夠較大批量的生產(chǎn)基因工程修飾的雞蛋清溶菌酶，不受原材料來源的限制，顯著提高溶菌酶的產(chǎn)量。其產(chǎn)品具有穩(wěn)定、純凈、生物活性高的特點(diǎn)。


附圖1是本發(fā)明多肽核苷酸序列示意圖；附圖2雞蛋殼提取溶菌酶抑菌試驗(yàn)與Weatern-Blot分析結(jié)果附圖3pIC6αA-mLYS單拷貝表達(dá)載體構(gòu)建策略附圖4pPIC6αA-mLYS多拷貝表達(dá)載體構(gòu)建策略附圖5pGAPZαA-mLYS單拷貝表達(dá)載體構(gòu)建策略附圖6pGAPZαA-mLYS多拷貝表達(dá)載體構(gòu)建策略具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
一、獲取雞蛋溶菌酶基因1雞蛋清溶菌酶的提取工藝將購(gòu)買自全國(guó)各地的56種地方品種來源的雞蛋作為原料提取雞蛋清溶菌酶，工藝如下1.1配制蛋清液 純蛋清中加入適量去離子水，攪拌混勻，過濾，測(cè)濃度，備用。
1.2樹脂吸附 向制備的蛋清液中加入已經(jīng)充分平衡后的陽離子吸附樹脂，慢速攪拌，以樹脂在液體中充分運(yùn)動(dòng)無死角為宜。室溫下吸附2～3h，然后過濾將樹脂蛋清分離，對(duì)樹脂進(jìn)行洗脫。
1.3洗脫 濾除蛋清液后的樹脂，每次用樹脂體積的1～1.5倍的去離子水?dāng)嚢柘礈?，漂去上層泡沫，濾除洗水，重復(fù)洗滌數(shù)次，直至基本無泡沫為止；總用水量約為5～6倍的樹脂體積。將水洗后的樹脂分為數(shù)份(根據(jù)樹脂量而定)，分別裝入帶熔沙濾片的玻璃交換柱中，用0.1M的NaCl沖洗，除去雜蛋白，直至用20％的三氯醋酸檢查溶液不顯渾濁為止；然后將交換柱自上而下串連，由上面第一柱加2M NaCl溶液，控制流速，流經(jīng)樹脂層進(jìn)入第二柱。一次進(jìn)行，流經(jīng)最后一柱的流出液含有一定濃度的溶菌酶。再用2M NaCl溶液連續(xù)洗滌下，各柱中樹脂所含溶菌酶一次自上而下地被洗脫干凈。
1.4濃縮、脫鹽與凍干 含酶洗脫液用中空纖維超濾膜裝置濃縮脫鹽，在NaCl含量合格后，將脫鹽液送入冷凍干燥機(jī)干燥即為成品酶。
2雞蛋清溶菌酶生物學(xué)鑒定2.1溶菌酶抑菌活性檢測(cè)2.1.1接種溶壁微球菌于LB(組成為1％Trypton，0.5％Yeast Extract，1％NaCl，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0)液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩過夜，4000rpm離心收集菌體，用少許pH 6.2的0.1M PBS重懸菌體；
2.1.2稱量1g Argoase溶解于100mL pH 6.2的0.1M PBS(組成為NaH2PO4·2H2O 1.482g，Na2HPO4·12H2O29.011g，NaCl 9.0g，加雙蒸水至1000ml)中，121℃高壓滅菌30min；2.1.3待冷卻至50～60℃時(shí)，加入金黃色微球菌，調(diào)節(jié)OD600約為2.0左右；2.1.4澆制平板，冷凝后根據(jù)需要打制適當(dāng)孔徑的圓孔；2.1.5向圓孔內(nèi)加各溶菌酶樣品以及標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶對(duì)照樣品，37℃溫箱孵育24h；2.1.6測(cè)定各樣品加樣孔周圍形成的抑菌圈的直徑，借以分析溶菌酶的抑菌活性，結(jié)果見附圖2。
2.2溶菌酶活力單位的測(cè)定2.2.1試驗(yàn)菌懸浮液的制備 接種溶壁微球菌于試驗(yàn)菌斜面培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)48h。用滅菌蒸餾水將菌體洗下，4000rpm離心10min收集菌體，再用滅菌蒸餾水洗滌3次。最后用少量水調(diào)制成OD450為0.8左右的試驗(yàn)菌懸浮液冷藏備用。
2.2.2標(biāo)準(zhǔn)酶液的配制 準(zhǔn)確稱取16mg溶菌酶粉，用pH 6.2的0.1mol/L的PBS溶解，配成濃度為4mg/mL的酶溶液，再用同樣緩沖液將此酶液依次稀釋成2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/mL。
2.2.3比濁測(cè)量 取試驗(yàn)菌懸浮液3.0mL，置于比色皿中測(cè)定450nm下的OD450值，然后加入酶液0.2mL，迅速搖勻。從加入酶液起計(jì)時(shí)，每隔30s記錄1次OD450。
2.2.4溶菌酶酶活力的計(jì)算 酶活力單位定義在25℃和pH 6.2條件下，OD450每分鐘下降0.001為1個(gè)酶活力單位(1U)。由此得酶活力計(jì)算公式為每mg酶的活力單位＝[OD450(零時(shí))-OD450(60s時(shí))]×1000/樣品毫克數(shù)2.3溶菌酶Western Blot定性分析方法見“五、表達(dá)蛋白的鑒定”，結(jié)果見附圖2。
3雞溶菌酶基因的克隆從56種不同品種的本地雞蛋清中分離純化了溶菌酶(步驟1)，并分析了它們的活性后，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為26號(hào)的雞蛋溶菌酶活性明顯高于其它編碼的雞蛋溶菌酶，于是采用RACE方法克隆該溶菌酶基因，實(shí)施步驟如下3.1采集該品種雞輸卵管細(xì)胞，迅速液氮冷凍，將冷凍組織研磨粉碎后抽提mRNA。方法為將100mg冷凍組織在含液氮的研缽中，用研棒研磨，研磨過程中可加入液氮使組織保持冷凍狀態(tài)，將組織碎末移入含3mL溶液D(4mol/L硫氰酸胍，25mmol/L檸檬酸鈉，0.5％月桂基肌酸鈉，0.1mol/Lβ-巰基乙醇)的管中，用攪拌子室溫下攪拌組織15～30s；將混合物移入另一管中，每毫升組織液立即加入0.1mL 2mol/L的醋酸鈉(pH 4.0)，1mL酚，0.2mL氯仿-異戊醇，蓋上管蓋，倒置混勻；勻漿劇烈振蕩10s，冰浴15min使核蛋白復(fù)合體徹底裂解；1000g，4℃離心20min，將上層含RNA的水相移入一新管中；加入與提取的RNA等量的異丙醇，充分混合液體，冰在-20℃沉淀RNA 1h或更長(zhǎng)時(shí)間；10000g，4℃離心20min，收集沉淀的RNA；輕輕倒出異丙醇加入溶液D溶解RNA顆粒，每1mL第一步所使用的溶液加0.3mL溶液D；將溶液移至一微量離心管，旋渦振蕩，并在-20℃用等量異丙醇沉淀RNA 1h或更長(zhǎng)時(shí)間；在微量離心機(jī)上，于4℃最高轉(zhuǎn)速離心10min收集RNA沉淀，用75％的乙醇洗滌沉淀2次，重復(fù)離心，吸去乙醇，吹干；加50～100μL DEPC處理過的水，將RNA儲(chǔ)存于-70℃。
3.2用抽提的mRNA作為模板，5’-RACE快速擴(kuò)增cDNA，步驟如下取1pg～100ng的poly(A)+RNA或1μg總RNA至一只新的試管中，用水調(diào)整體積至9μL，將RNA樣品在75℃變性5min，將離心管迅速插入冰中冷卻；配制20μL的RT-PCR反應(yīng)體系

注基因特異反義引物1序列為5’-TCACAGCCGGCAGCCTCTGAT-3’37℃反應(yīng)60min。
去除過剩的寡核苷酸或隨機(jī)六核苷酸引物可用水將反應(yīng)液中止體積稀釋至2mL，然后用Centricon-100微量濃縮器，500～1000g，4℃離心20min，轉(zhuǎn)移殘留的液體到一支新的0.5mL離心管，用旋轉(zhuǎn)真空抽干使體積濃縮至10μL。
加入10μL體積的如下試劑至反轉(zhuǎn)錄cDNA中

反應(yīng)管孵育在37℃水浴中反應(yīng)15min。
在80℃放置3min使末端轉(zhuǎn)移酶失活，使帶有dA尾的cDNA樣品用TE pH 7.6稀釋至終體積1mL。按以下次序，將各成分加入在一只0.5mL滅菌離心管中、擴(kuò)增管孔內(nèi)，建立PCR系列反應(yīng)管

注(dT)17-接頭引物序列為5’-GACTCGAGTCGACATCGA-3’接頭引物序列為5’-GACTCGAGTCGACATCG-3’基因特異性引物2序列為5’-AAAGAAAAGTCTTTGGACGATGTGAG-3’如果PCR儀沒有配置加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層應(yīng)加一滴礦物油(約50μL)，防止樣品在PCR反應(yīng)多個(gè)加熱于冷卻的循環(huán)中蒸發(fā)。
按以下方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增

抽取每種擴(kuò)增樣品5～10μL，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用DNA marker來判斷擴(kuò)增片段的大小，凝膠用golden view染色。
從擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物中分離掉殘余的熱穩(wěn)定DNA聚合酶和dNTP，方法為將2mL TE(pH 8.0)在Centricon-100濃縮器的貯液腔內(nèi)，用移液器小心地從上層礦物油下面抽取反應(yīng)液，用1000g室溫離心30min。轉(zhuǎn)移濃縮管內(nèi)的殘留濃縮液至另一新的離心管內(nèi)，即為該溶菌酶基因，命名為L(zhǎng)YS(hen lysozyme gene)。
二、提取的溶菌酶基因的鑒定將以上方法獲得的溶菌酶基因通過DNA測(cè)序儀進(jìn)行基因測(cè)序，結(jié)果如下<110>李浙烽<120>新型雞蛋溶菌酶序列表<140>
<141>2006-12-17<160>1<170>PatentIn Version 3.2<210>1<211>390(核苷酸)<212>cDNA<213>雞蛋清(Hen Egg White)<220>
<221>CDS<222>(36)...(51)...(87)...(111)...(168)...(186)...(204)...(231)...(258)...(294)...(303)...(315)...(351)...(387)<223>n＝a或g或c或t<400>1aaagtctttg gacgatgtga gctggcagca gctttgaagc gtcacggaat ggatgggtat 60cggggataca gcctgggaaa ctggatgtgt gccgcaaaat tcgagagtgg tttcaacacc 120caggctacaa accgtaacac cgatgggagt accgactacg gaatcttcca gatcaacagc 180cgctactggt gcaacgatgg caagacccca ggctccagga acctgtgcca catcccgtgc 225tcagccctgc tgagcgacga cataacagcg agcgtgaact gcgcgaagaa gatcgtcagc 270ggtggaaacg gcatcaacgc gtgggtcgcc tggcgcaacc gctgcaagaa caccgacgtc 360caggcgtgga tcagaggctg ccgggtgtga 390<220>
<221>PRT<222>(37)...(62)...(101)
Lys Val Phe Gly Arg Cys Glu Leu Ala Ala Ala Leu Lys Arg His Gly Met Asp Gly Tyr 20Arg Gly Tyr Ser Leu Gly Asn Trp Met Cys Ala Ala Lys Phe Glu Ser Gly Phe Asn Thr 30Gln Ala Thr Asn Arg Asn Thr Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser 60Arg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ser Arg Asn Leu Cys His Ile Pro Cys 75Ser Ala Leu Leu Ser Asp Asp Ile Thr Ala Ser Val Asn Cys Ala Lys Lys Ile Val Ser 90Gly Gly Asn Gly Ile Asn Ala Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Lys Asn Thr Asp Val 120Gln Ala Trp Ile Arg Gly Cys Arg Val End 130<220>
<120>已報(bào)道的雞蛋溶菌酶序列表<160>390bp<170>PatentIn Version 3.2<210>1<211>390(核苷酸)<212>cDNA<213>雞蛋清(Hen Egg White)<221>n＝a或g或c或t<222>
<400>1aaagtctttg gacgatgtga gctggcagcg gctatgaagc gtcacggact tgataactat 60cggggataca gcctgggaaa ctgggtgtgt gccgcaaaat tcgagagtaa cttcaacacc 120caggctacaa accgtaacac cgatgggagt accgactacg gaatcctaca gatcaacagc 180cgctggtggt gcaacgatgg caggacccca ggctccagga acctgtgcaa catcccgtgc 240tcagccctgc tgagctcaga cataacagcg agcgtgaact gcgcgaagaa gatcgtcagc 300gatggaaacg gcatgaacgc gtgggtcgcc tggcgcaacc gctgcaaggg caccgacgtc 360caggcgtgga tcagaggctg ccggctgtga 390與已報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因比較，結(jié)果如下1與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第12位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的蛋氨酸(Met，ATG)突變?yōu)榱涟彼?Leu，TTG)；2與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第17位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的亮氨酸(Leu，CTT)突變?yōu)榈鞍彼?Met，ATG)；3與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第29位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的丙氨酸(Val，GTG)突變?yōu)榈鞍彼?Met，ATG)；4與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第37位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的天門酰氨(Asn，AAC)突變?yōu)楦拾彼?Gly，GGT)；5與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第56位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的亮氨酸(Leu，CTA)突變?yōu)楸奖彼?Phe，TTC)；6與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第62位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的色氨酸(Trp，TGG)突變?yōu)槔野彼?Tyr，TAT)；7與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第68位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的亮氨酸(Leu，CTG)突變?yōu)楸彼?Val，ATT)；8與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第77位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的天門酰氨(Asn，AAC)突變?yōu)楫惲涟彼?Ile，ATT)；9與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第86位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的亮酰氨(Leu，CTA)突變?yōu)楸奖彼?Phe，TTC)；10與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第98位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的異亮氨酸(Ile，ATT)突變?yōu)楫惲涟彼?Ile，ATT)；11與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第101位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的天門冬氨酸(Asp，GAT)突變?yōu)楦拾彼?Gly，GGT)；12與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第105位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的蛋氨酸(Met，ATG)突變?yōu)楫惲涟彼?Ile，ATC)；13與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第117位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的甘酰氨(Gly，GGC)突變?yōu)樘於０?Asn，AAC)；14與已有報(bào)道的雞蛋溶菌酶基因序列比較，在第129位氨基酸處發(fā)生了氨基酸突變，由原有的亮氨酸(Leu，CTG)突變?yōu)楸彼?Val，ATT)。
三重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1誘導(dǎo)表達(dá)型單拷貝質(zhì)粒的構(gòu)建1.1表達(dá)系統(tǒng) 采用真核表達(dá)載體pPIC6αA與畢赤酵母宿主菌X-33進(jìn)行重組溶菌酶基因的表達(dá)。pPIC6αA屬甲醇正表型(Mut+)質(zhì)粒，含有分泌因子α-factor，可將表達(dá)蛋白分泌至細(xì)胞外，便于純化。
1.2表達(dá)基因的準(zhǔn)備 設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1/P2(P1序列為5’-GGGGTCGAGAAAAGAAAAGTCTTTGGACGATGTGAG-3’；P2序列為5’-GGGGCTAGATCACAGCCGGCAGCCTCTGAT-3’)對(duì)提取的雞蛋溶菌酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，添加5’端和3’端的酶切位點(diǎn)；發(fā)應(yīng)體系如下

反應(yīng)條件為94℃，5min；(94℃，45s；60℃，45s；72℃，45；32個(gè)循環(huán))；72℃，10min。
取全部PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，100v，30min；紫外燈下切下含有擴(kuò)增產(chǎn)物片斷的凝膠塊，經(jīng)PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用XhoI和XbaI對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系如下

37℃酶切過夜(約14h)，去除兩端的保護(hù)堿基，形成粘性末端；經(jīng)1％瓊脂糖電泳后，再次經(jīng)純化回收試劑盒回收含有表達(dá)基因的酶切片斷。
1.3表達(dá)載體的準(zhǔn)備 對(duì)pPIC6αA質(zhì)粒DNA經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系如下

37℃酶切過夜(約14h)，切除兩端的保護(hù)堿基，形成粘性末端；經(jīng)1％瓊脂糖電泳后，再次經(jīng)純化回收試劑盒回收線性表達(dá)載體。
1.4重組表達(dá)質(zhì)粒 pPIC6αA-mLYS將純化回收的含有表達(dá)基因的酶切片斷和線性表達(dá)載體片斷按摩爾比10∶1的摩爾比例混合，在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下

16℃連接過夜(約14h)，取2μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5a)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法為(1)取2μL連接反應(yīng)產(chǎn)物加入80μL感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，用中指輕彈混勻；(2)冰浴40min后，取出置42℃水浴熱激1min；(3)再次冰浴5min，(4)取出，開蓋，加入320μL SOC培養(yǎng)基(組成為1％Trypton，0.5％Yeast Extract，0.05％NaCl，2％Glucose)；(4)置37℃振蕩搖床內(nèi)，125rpm，培養(yǎng)1h；(5)分別取10μL，50μL，100μL涂布含100μg/mL Blasticidin抗性的LB固體平板培養(yǎng)基，37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)16～20h。
挑取5～10個(gè)克隆分別接種于含有Blasticidin的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜，收集菌體，按照常規(guī)方法小量抽提質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定確定陽性克隆，方法同表達(dá)載體構(gòu)建部分。(重組質(zhì)粒pPIC6αA-mLYS的構(gòu)建策略見附圖3)2誘導(dǎo)表達(dá)型多拷貝質(zhì)粒的構(gòu)建2.1提取pPIC6αA-LYS質(zhì)粒DNA，經(jīng)BglII和BamHI雙酶切過夜，反應(yīng)體系如下

37℃酶切過夜(約14h)，切除兩端的保護(hù)堿基，形成粘性末端；經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳后，經(jīng)純化回收試劑盒回收大小約為400bp的酶切片斷AOX-LYS fragment。
2.2提取pPIC6αA-LYS質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHI單酶切過夜，酶切體系如下

37℃酶切過夜(約14h)，將pPIC6aA-LYS酶切成線性質(zhì)粒；經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳后，經(jīng)純化回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物pPIC6aA-LYS linear。
2.3將BglII和BamHI雙酶切片斷AOX-LYS在T4 DNA Ligase作用下連接過夜，因?yàn)锽glII和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)中共有四個(gè)相同的堿基，所以BglII和BamHI也能發(fā)生連接，連接反應(yīng)體系如下

16℃連接過夜(約14h)，連接產(chǎn)物(multicopy AOX-LYS，mAOX-LYS)置65℃水浴30min，使liagse失活。
2.4將以上連接產(chǎn)生的頭對(duì)尾、頭對(duì)頭和尾對(duì)尾連接多拷貝片斷，在BglII和BamHI內(nèi)切酶的作用下酶切過夜，酶切體系如下

37℃酶切過夜(約14h)，去除頭對(duì)頭和尾對(duì)尾的連接方式，經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠回收試劑盒純化回收最大的片斷(mAOX-LYS頭對(duì)尾連接方式)；2.5將獲得的多拷貝片斷與步驟2.2中的線性表達(dá)載體按摩爾比10∶1的摩爾比例混合，經(jīng)T4 DNA連接酶連接過夜，連接體系如下

16℃連接過夜(約14h)，形成pPIC6aA-mLYS多拷貝表達(dá)載體(見附圖4)；2.6將以上構(gòu)建的多拷貝表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α，抽提質(zhì)粒DNA，用于轉(zhuǎn)化酵母。
3連續(xù)表達(dá)型單拷貝質(zhì)粒的構(gòu)建3.1抽提pPIC6αA-mLYS質(zhì)粒DNA，經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切，酶切體系如下

37℃酶切過夜(約14h)，經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠回收試劑盒純化回收含mLYS的酶切片斷；3.2抽提pGAPZαA質(zhì)粒DNA，經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切，體系如下

37℃酶切過夜(約14h)，經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠回收試劑盒純化回收pGAPZaA線性片斷；3.3將步驟3.1與3.2的回收片斷按10∶1的摩爾比例混合，經(jīng)T4 DNA ligase連接，體系如下

16℃連接過夜，得pGAPZαA-mLYS(見附圖5)。
3.4取2μL連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α，方法同前；抽提質(zhì)粒DNA，用于轉(zhuǎn)化酵母。
4連續(xù)表達(dá)型多拷貝質(zhì)粒的構(gòu)建4.1提取pGAPZαA-LYS多拷貝質(zhì)粒DNA，經(jīng)BglII和BamHI雙酶切過夜，膠回收試劑盒含LYS的酶切片斷；

37℃酶切過夜(約14h)，經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠回收試劑盒純化回收GAP-LYS片斷。
4.2將以上BglII和BamHI雙酶切片斷在T4D NA Ligase作用下連接過夜，因?yàn)锽glII和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)中共有四個(gè)相同的堿基，所以BglII和BamHI也能發(fā)生連接，連接反應(yīng)體系如下


16℃連接過夜(約14h)，連接產(chǎn)物(multicopy GAP-LYS，mGAP-LYS)置65℃水浴30min，使liagse失活。
4.3將以上連接產(chǎn)生的頭對(duì)尾、頭對(duì)頭和尾對(duì)尾連接多拷貝片斷，在BglII和BamHI內(nèi)切酶的作用下酶切過夜，酶切體系如下

37℃酶切過夜(約14h)，去除頭對(duì)頭和尾對(duì)尾的連接方式，經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠回收試劑盒純化回收最大的片斷(mGAP-LYS頭對(duì)尾連接方式)；4.4抽提pGAPZαA-mLYS質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHI酶切，體系如下

37℃酶切過夜(約14h)，經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠回收試劑盒純化回收pGAPZaA-mLYS linear片斷。
4.5將獲得的多拷貝片斷與步驟4.4中的線性表達(dá)載體按摩爾比10∶1的摩爾比例混合，經(jīng)T4 DNA Ligase連接過夜，連接體系如下


16℃連接過夜(約14h)，形成pGAPZaA-mLYS多拷貝表達(dá)載體(見附圖6)；4.5將以上構(gòu)建的多拷貝表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α，抽提質(zhì)粒DNA，用于轉(zhuǎn)化酵母。四重組mLYS工程菌株的構(gòu)建通過以上步驟將雞蛋溶菌酶基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體pPIC6αA和pGAPZαA內(nèi)，得到的重組表達(dá)載體，為得到真核表達(dá)的溶菌酶，需將重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α和酵母X-33，方法如下(一)大腸桿菌轉(zhuǎn)化方法1大腸桿菌感受態(tài)的制備1.1.用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10mL LB液體培養(yǎng)基的50mL離心管中。(同時(shí)做培養(yǎng)基和槍頭的空白對(duì)照)1.2.37℃，220rpm，培養(yǎng)14-16個(gè)小時(shí)。
1.3以1％的比例將這10mL菌液接種到1000mL LB液體培養(yǎng)基中，37度，220rpm，振搖2-3h，每30min測(cè)一次OD600，當(dāng)OD值達(dá)到0.3～0.4時(shí)，停止培養(yǎng)。
1.4.將菌液在冰上預(yù)冷30min，隨后將菌液分裝到500mL預(yù)冷的離心杯中，4℃，2500rpm離心10min。
1.5.棄上清，離心杯中加入少量ddH2O，使沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯，4℃，4000rpm離心10min。
1.6.棄上清，加少量滅菌水，重懸菌體，再將水注滿離心杯，4000rpm，4℃，離心10min。
1.7.棄上清，往離心杯中加入少量10％甘油(滅菌，預(yù)冷)，重懸菌體，再加滿10％甘油，4℃，4000rpm，離心10min。
1.8.棄上清，每個(gè)離心杯中加入5mL 10％的甘油，使沉淀懸浮后，將菌液以300μL/管分裝于1.5mL的離心管中，-80℃冰箱中保存。同時(shí)取100μL感受態(tài)加0.01ng pUC18直接電穿孔轉(zhuǎn)化，檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率。
1.9.次日觀察轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況，并記錄。
2電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)2.1.用無水乙醇清洗浸泡在無水乙醇中的電擊杯，于超凈臺(tái)吹干。將連接產(chǎn)物和0.1cm的電擊杯一起置于冰上預(yù)冷。準(zhǔn)備800μL無抗LB，于冰上預(yù)冷。
2.2.從-70℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。
2.3.取1μL連接產(chǎn)物加入到100μL感受態(tài)中，混勻后轉(zhuǎn)入電擊杯中。輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極杯的底部。
2.4.打開電轉(zhuǎn)儀，將電擊杯放入。
2.5.按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入800μL的LB液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中。
2.6.37℃，220～250rpm復(fù)蘇1小時(shí)。
2.7.5000rpm，5min，棄上清剩100μL，涂板，放于37℃過夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。
3陽性克隆的篩選3.1從轉(zhuǎn)化的平板上選取10～20個(gè)克隆，最好標(biāo)記，用于Cloning PCR檢測(cè)；3.2Cloning PCR反應(yīng)體系如下(以TaKaRa Taq DNA polymerase反應(yīng)為例)


3.3PCR反應(yīng)條件94℃，5min；(94℃，45s；58℃45s；72℃，30s；34個(gè)循環(huán))；72℃，10min。取5μL經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳檢測(cè)。
(二)酵母轉(zhuǎn)化方法1酵母X-33感受態(tài)制備1.1.挑取酵母單菌落，接種至含有5mL YPD培養(yǎng)基(組成為2％Trypon，2％D-Glucose，1％Yeast Extract)的50mL三角瓶中，28℃，250-300rpm培養(yǎng)過夜；1.2.取100-500μL的培養(yǎng)物接種至含有500mL新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28℃，250-300rpm培養(yǎng)過夜，至OD600達(dá)到1.3～1.5；1.3.將細(xì)胞培養(yǎng)物于4℃，3500rpm離心5min，用500mL的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸；1.4.按步驟3離心，用250mL的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸；1.5.按步驟3離心，用20mL的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；1.6.按步驟3離心，用1mL的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為1.5mL；1.7.立即用于轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，一般不作凍存保存。
2轉(zhuǎn)化重組表達(dá)質(zhì)粒的制備2.1.選取已經(jīng)過鑒定的表達(dá)載體陽性克隆的大腸桿菌菌株，接種于含有合適抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜；2.2.離心收集菌體，按照常規(guī)方法抽提5～10μg的含mLYS的重組表達(dá)載體質(zhì)粒DNA；2.3.用BstX1將重組質(zhì)粒DNA酶切過夜，形成線性重組表達(dá)質(zhì)粒；2.4.乙醇沉淀方法濃縮線性重組表達(dá)質(zhì)粒至5～10μL。
3電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-333.1.將5～10μL的線性化DNA(5～10μg)，加入80μL的上述步驟制得的畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯內(nèi)；3.2.將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min，并輕彈電轉(zhuǎn)化杯，使DNA與感受態(tài)細(xì)胞充分混合；3.3.根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀提供的資料，設(shè)定合適的電壓、電流、電容等參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)，進(jìn)行電擊；3.4.電擊完畢后，加入1mL冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1.5mL的EP管中，28℃靜置1h；3.5.取200～600μL轉(zhuǎn)化菌體懸液涂布于多塊含有適當(dāng)抗性MD或RDB平板上；3.6.將平板到置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24h左右。
4篩選與鑒定陽性克隆轉(zhuǎn)化株4.1.模板的處理4.1.1.待平板上的菌落生長(zhǎng)約24h，有明顯的菌落形成后；4.1.2.將除了模板之外的其它PCR反應(yīng)液的組分準(zhǔn)備好，并分裝。引物最好使用Kit中已有的檢測(cè)專用的引物，或者一條使用載體上的引物，一條使用基因的特異性引物(這樣做可以鑒定非定向克隆的方向)；4.1.3.用半根滅菌的牙簽(節(jié)約，而且好用)挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一個(gè)滅菌的1.5mL離心管，對(duì)PCR管和1.5mL離心管編號(hào)；4.1.4.PCR擴(kuò)增，1.5％agarose電泳；4.1.5.對(duì)于PCR擴(kuò)增顯現(xiàn)特異性條帶的克隆，把置于1.5mL離心管中的半截牙簽扔到5mL YPD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，8～12h，對(duì)鑒定過的菌株做stock，用于誘導(dǎo)表達(dá)分析。
4.2.PCR反應(yīng)體系(以TaKaRa Taq DNA聚合酶反應(yīng)為例)

4.3PCR反應(yīng)條件94℃，5min；(94℃，45s；58℃45s；72℃，30s；34個(gè)循環(huán))；72℃，10min。取5μL經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳檢測(cè)，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物片斷的大小。
經(jīng)過以上鑒定，證實(shí)目的基因已經(jīng)成功整合到酵母基因組后，鑒定獲得陽性克隆株即為重組雞蛋溶菌酶基因工程表達(dá)菌(Recombinant LYS Yeast strain)。
五溶菌酶的表達(dá)(一)溶菌酶的誘導(dǎo)表達(dá)1搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)1.1.挑選一經(jīng)過鑒定的pPIC6αA-LYS單拷貝或多拷貝酵母工程菌株，接種于裝有25mL BMGY培養(yǎng)基(組成為1％YeastExtract，2％peptone，100mM potassium phosphate，pH6.0，1.34％YNB，4×10-5％ biotin，1％glycerol)的250mL搖瓶中，于28℃，250-300rpm培養(yǎng)至OD600＝1.1～1.3；1.2.室溫下1500～3000g離心5min，收集菌體，用BMMY(組成為1％Yeast Extract，2％peptone，100mMpotassium phosphate，pH6.0，1.34％YNB，4×10-5％ biotin，0.5％methanol)重懸菌體，使OD600＝1.0左右(約100～200mL)；1.3.將步驟1.2所得的菌液置于1L的搖瓶中，用雙層紗布封口，于28℃，250-300rpm的搖床上繼續(xù)生長(zhǎng)；1.4.每24h向培養(yǎng)基中添加0.5～1.0％體積的100％甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)；1.5.按開始誘導(dǎo)時(shí)間為起點(diǎn)分別取菌液樣品，每次取樣量為1mL，置于1.5mL EP管中。時(shí)間點(diǎn)一般取0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；1.6.將取樣最大轉(zhuǎn)速離心2～3min，收集上清液氮或干冰速凍后，于-80℃保存?zhèn)溆?，用于分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。
2發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)2.1.挑選一株經(jīng)過鑒定的pPIC6αA-LYS單拷貝或多拷貝酵母工程菌株，接種于裝有25mL YPD培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，于28℃，250-300rpm培養(yǎng)至OD600＝1.1～1.3；離心收集菌體，用25％～50％體積的去離子水重懸細(xì)胞；2.2.將配制好的上罐發(fā)酵基本培養(yǎng)基(每升含85％H3PO426.7mL，CaSO40.93g，K2SO418.2g，MgSO4·7H2O 14.9g，KOH 4.13g，甘油40.0g，PTM1 trace salts 4.35mL)加入到發(fā)酵罐中(約50％發(fā)酵罐體積)，同熱蒸汽對(duì)罐體全面消毒，121℃滅菌30min，冷卻至28℃，添加氨水調(diào)節(jié)pH至5～6；2.3.接種重懸的工程菌細(xì)胞，在28℃，500rpm，空氣通入率為2L/min以上條件下培養(yǎng)；2.4.培養(yǎng)24h后，以18mLL-1h-1的速率添加含1.2％PTM1的50％甘油，持續(xù)約6.5h；2.5.開始添加含1.2％PTM1的100％甲醇以取代1.2％PTM1的50％甘油開始誘導(dǎo)，在起初的3h內(nèi)，甲醇添加速率為1mLL-1h-1使細(xì)胞適應(yīng)甲醇的生長(zhǎng)環(huán)境；然后增加持續(xù)2h到7.2mLL-1h-1持續(xù)2h；最后甲醇添加量增加到10mLL-1h-1一直持續(xù)到誘導(dǎo)結(jié)束，總共誘導(dǎo)的時(shí)間為100h。
2.6.放罐，收集發(fā)酵液，4000rpm離心收集發(fā)酵上清液用于純化表達(dá)蛋白。
(二)溶菌酶的持續(xù)表達(dá)1搖瓶持續(xù)表達(dá)1.1.挑選一株經(jīng)過鑒定的pGAPZαA-LYS單拷貝或多拷貝酵母工程菌株，接種于裝有5mL YPD培養(yǎng)基的15mL試管中，于28℃，250-300rpm培養(yǎng)至OD600＝1.1～1.3；1.2.按1％比例重新接種于含50mL YPD的250mL搖瓶中，于28℃，250-300rpm培養(yǎng)，開始表達(dá)；1.3.按開始表達(dá)時(shí)間為起點(diǎn)分別取菌液樣品，每次取樣量為1mL，置于1.5mL EP管中。時(shí)間點(diǎn)一般取0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；1.4.將收集的表達(dá)取樣最大轉(zhuǎn)速離心2～3min，收集上清，液氮或干冰速凍后，于-80℃保存?zhèn)溆茫糜诜治瞿康牡鞍椎谋磉_(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。
2發(fā)酵持續(xù)表達(dá)2.1.挑選一經(jīng)過鑒定的pGAPZαA-LYS單拷貝或多拷貝酵母工程菌株，接種于裝有25mL YPD培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，于28℃，250-300rpm培養(yǎng)至OD600＝1.1～1.3；離心收集菌體，用25％～50％體積的去離子水重懸細(xì)胞；2.2.將配制好的上罐發(fā)酵基本培養(yǎng)基(每升含85％磷酸26.7mL，硫酸鈣0.93g，硫酸鉀18.2g，七水硫酸鎂14.9g，氫氧化鉀4.13g，甘油40.0g，PTM1 trace salts 4.35mL)加入到發(fā)酵罐中(約50％發(fā)酵罐體積)，同熱蒸汽對(duì)罐體全面消毒，121℃滅菌30min，冷卻至28℃，添加氨水調(diào)節(jié)pH至5～6；2.3.接種重懸的工程菌細(xì)胞，在28℃，500rpm，空氣通入率為2L/min以上條件下培養(yǎng)；2.4.培養(yǎng)24h后，以18mLL-1h-1的速率添加含1.2％PTM的50％甘油，至表達(dá)結(jié)束，總共誘導(dǎo)時(shí)間約100h；2.5.放罐，收集發(fā)酵液，4000rpm離心收集發(fā)酵上清液用于純化表達(dá)蛋白。
六表達(dá)蛋白的鑒定1SDS-PAGE電泳檢測(cè)溶菌酶1.1樣品的制備 取離心后的發(fā)酵液樣品50μL加等體積2×Loading Buffer(0.5M pH 6.8Tris-Cl 5mL，20％SDS 4mL，β-mercaptoethanol 1mL，50％甘油4mL，溴酚蘭4mg，ddH2O 6mL)，充分混勻后，煮沸5min；1.2SDS-PAGE 凝膠配制，按以下比例配制濃縮膠和分離膠

1.3上樣 取制備好的樣品20μL上樣至加樣孔內(nèi)，同時(shí)加樣分子量標(biāo)準(zhǔn)和溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)作對(duì)照；1.4電泳 40～50v恒壓電泳至樣品通過上層膠，在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)改用高電壓恒壓電泳(90～100v)。在溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。
1.5染色與脫色 電泳結(jié)束后，將凝膠放入0.05％考馬斯亮藍(lán)R250(內(nèi)含20％磺基水楊酸)染色液中，使染色液沒過膠板，染色30min左右。用7％乙酸浸泡漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色褪去。
2Western-blot檢測(cè)溶菌酶2.1蛋白樣品制備 同SDS-PAGE電泳檢測(cè)溶菌酶部分，步驟同上1.1；2.2電泳 同SDS-PAGE電泳檢測(cè)溶菌酶部分，步驟同上1.2～1.4；2.3轉(zhuǎn)膜 選用PVDF膜，在超純水中浸泡10min，轉(zhuǎn)至Bloting-Buffer(組成為20mM Tris-base，150mMglycine，20％methanol，0.1％SDS)中浸泡15min以上；取下凝膠塊置于bloting-buffer中；打開Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，依次擺放濕潤(rùn)的厚濾紙、薄濾紙、PVDF膜、凝膠塊、薄濾紙、厚濾紙，確保各層之間沒有氣泡，接通電流，設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為50mA/塊，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60min。
2.4封閉 轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把PVDF膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好封閉液(5％脫脂奶粉溶解于TBST，TBST組成為8.8g of NaCl，0.2g of KCl，3g of Tris base，500ul Tween-20，調(diào)節(jié)pH至7.4，加ddH2O至1L)中，封閉過夜。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。
2.5一抗孵育 按1∶10000比例將一抗溶于封閉液中制得一抗稀釋液，然后將封閉后的PVDF膜轉(zhuǎn)至一抗稀釋液中，室溫在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)，回收一抗。加入Western洗滌液(TBST)，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10min。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10min，共洗滌1h。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
2.6二抗孵育 按1∶10000比例將一抗溶于封閉液中制得一抗稀釋液，然后將一抗雜交后的PVDF膜轉(zhuǎn)至二抗稀釋液中，室溫在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。加入Western洗滌液(TBST)，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10min。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10min，共洗滌1h。
2.7蛋白檢測(cè) 將PVDF膜取出置于保鮮膜上，加入熒光測(cè)試劑，輕輕搖擺1min，使充分接觸熒光測(cè)試劑。壓片可以采用專用的壓片暗盒進(jìn)行。洗片時(shí)使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。X光片推薦選用柯達(dá)原裝的生物實(shí)驗(yàn)專用柯達(dá)X-OMATBT膠片。
3溶菌酶抑菌活性檢測(cè)同雞蛋清提取溶菌酶的活性檢測(cè)方法。
4溶菌酶活力單位的測(cè)定同雞蛋清提取溶菌酶的活力單位測(cè)定方法。
七表達(dá)蛋白的濃縮純化1發(fā)酵結(jié)束后，4000rpm離心發(fā)酵液，收集上清；2透析 將發(fā)酵液上清裝入透析袋內(nèi)，對(duì)去離子水透析去鹽，4℃透析24h；透析過的發(fā)酵上清用0.45μm的濾膜過濾，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0；3裝CM-Sephrose FF層析柱 以每升發(fā)酵液10mL CM-Sephrose FF裝柱，用0.05M Tris-Cl pH 8.0平衡柱子5～8個(gè)柱床體積；4上樣 將發(fā)酵液以10～100mL/min的流速上柱；5清洗 上樣結(jié)束后，用0.05M Tris-Cl pH 8.0洗脫未結(jié)合蛋白，共洗脫4個(gè)柱床體積；6洗脫 用含有0.15～0.20M NaCl的0.05M Tris-Cl pH 8.0溶液洗脫；7透析 將洗脫液對(duì)去離子水4℃透析24h；8凍干 將透析過的洗脫液在凍干機(jī)上凍干，得到基本純的溶菌酶干粉，如果需要進(jìn)一步的純化可對(duì)獲得干粉進(jìn)行重結(jié)晶。
八溶菌酶的用途1用于食品添加劑我國(guó)冷卻肉的生產(chǎn)和推廣已受到高度的重視，并已開始批量生產(chǎn)。溶菌酶可以作為冷卻肉生產(chǎn)過程中實(shí)用的高效、純天然保鮮劑。馬美湖等(2002)按溶菌酶1～5g，乙酸1～2g，乳酸1～2g，抗壞血酸1～4g，蒸餾水1000mL的組成配制成溶菌酶保鮮劑，對(duì)冷凍進(jìn)行保鮮處理。結(jié)果表明肉的色澤變化情況、肉的氣味、肉的彈性、粘度的變化、汁液滲出量、pH值的變化、系水力(率)、蒸煮損失的變化、肉湯試驗(yàn)、酸價(jià)測(cè)定、H2S試驗(yàn)、揮發(fā)性鹽基氮(TVB值)、冷藏期間細(xì)菌總數(shù)等檢測(cè)指標(biāo)均有明顯的提高，其保鮮效果可以達(dá)到國(guó)家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的一級(jí)鮮度標(biāo)準(zhǔn)。
目前，我國(guó)液態(tài)乳制品發(fā)展很快，溶菌酶應(yīng)用于乳制品中可起到防腐的效果，尤其適用于巴氏殺菌奶，可有效地延長(zhǎng)保存期。由于溶菌酶具有一定的耐高溫性能，也可適用于超高溫瞬間殺菌奶。添加劑量為300～600mg/kg，其方法為包裝前添加，超高溫瞬間殺菌奶也可以在殺菌前添加。新鮮的牛乳中含有少量的溶菌酶，約含0.13mg/mL，而人乳中含有40mg/mL溶菌酶。若在鮮乳或奶粉中加入一定量的溶菌酶，則不但有防腐保鮮劑的作用，而且可達(dá)到強(qiáng)化嬰兒乳品的目的，有利于嬰兒的健康。
釀造酒的酒精含量較低時(shí)，有些微生物可在其中生長(zhǎng)，而引起變質(zhì)。例如，清酒的酒精含量為15％～17％，大部分微生物不能在其中生長(zhǎng)，但部分乳酸菌，則可在清酒中生長(zhǎng)，并生成乳酸和產(chǎn)生不愉快的味道。若在清酒中加入15mg/kg的溶菌酶，即可起到良好的防腐效果。
茶湯屬低酸性飲料，pH值一般為5～7，引起茶飲料變質(zhì)的微生物主要為細(xì)菌，為保證茶飲料安全性及貯藏性，必須對(duì)茶飲料進(jìn)行殺菌處理。由于茶湯組分的復(fù)雜性和體系的不穩(wěn)定性，尤其是綠茶茶湯氧化還原電位低，體系不穩(wěn)定，因此經(jīng)熱加工處理后對(duì)其品質(zhì)的影響很大。所以溶菌酶可作為一種有效的保鮮劑，在茶飲料中添加10000～50000U/L的溶菌酶可有效抑制茶飲料中細(xì)菌的增值，保持茶飲料的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味和保質(zhì)期。
一些新鮮水產(chǎn)品(如蝦、魚等)在含甘氨酸(0.1M)、溶菌酶(0.05％)和食鹽(3％)的混合液中浸漬5min后瀝去水分，保存在5℃的冷庫中，9d后無異味、色澤無變化。另外在其他食品如香腸、奶油、生面條、飲料等食品中加入溶菌酶均可起到良好的保鮮作用。
2用作飼料添加劑仔豬腹瀉是集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)條件下的一種典型的多因素性疾病。該病是目前引起仔豬死亡最嚴(yán)重的仔豬疾病之一，據(jù)調(diào)查仔豬因腹瀉死亡占仔豬死亡總數(shù)的39.8％。嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，導(dǎo)致飼料報(bào)酬率較低、仔豬成活率下降、生長(zhǎng)緩慢、生長(zhǎng)發(fā)育停滯(即所謂的僵豬)，甚至死亡。同時(shí)隨著抗生素的普遍大劑量使用，產(chǎn)生的耐藥性越來越嚴(yán)重，因此效果并不理想?？股氐氖褂盟鶐淼奈：θ找鎳?yán)重，一些發(fā)達(dá)國(guó)家已把嚴(yán)格控制甚至禁止抗生素在飼料行業(yè)的使用納入法律法規(guī)。在飼料中添加300～500g/噸的溶菌酶，可有效治療仔豬腹瀉，與對(duì)照組相比，平均腹瀉率下降了50％。
奶牛乳房炎是奶牛的一種常見多發(fā)性疾病，發(fā)生乳房炎的奶牛產(chǎn)奶量下降，生鮮牛奶品質(zhì)顯著降低。病情嚴(yán)重時(shí)造成奶?；疾∪閰^(qū)廢棄而失去泌乳能力被淘汰。目前對(duì)奶牛乳房炎的臨床治療普遍采用抗生素治療的方法，采用抗生素治療在治療期和休藥期內(nèi)，所產(chǎn)的牛奶不能被人食用而棄掉，嚴(yán)重影響了奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。溶菌酶作為一種有效的抗菌劑，在單獨(dú)使用或與其他成分共同使用時(shí)可有效抑制乳房炎病原菌的生長(zhǎng)。采用10～50μL此雞蛋清溶菌酶(5000U/mL)對(duì)分離出的7株乳房炎致病菌表現(xiàn)出良好的抑菌效果。將中草藥制劑和溶菌酶制劑復(fù)合使用效果明顯，尤其是溶菌酶活力較高試驗(yàn)組抑菌效果更加明顯。
在肉仔雞中添加4～100mg/kg溶菌酶，結(jié)果表明可有效降低飼料消耗，提高日增重。試驗(yàn)組平均增重比對(duì)照組提高2％～2.8％，飼料消耗量降低2.1％～5.2％，存活率提高14％～17％，飼料報(bào)酬提高5.0％～8.8％，飼喂效果明顯。
3用于醫(yī)療衛(wèi)生榮曉花等(1999)報(bào)道溶菌酶具抗菌消炎、抗病毒、增強(qiáng)免疫力等多種藥理作用。它能直接水解革蘭氏陽性菌，在分泌型免疫球蛋白A和補(bǔ)體的參與下，還能水解革蘭氏陰性菌如大腸桿菌等，并能夠增強(qiáng)抗生素和其他藥物的療效，改善組織基質(zhì)的粘多糖代謝，從而達(dá)到消炎和修復(fù)組織的目的。溶菌酶是一種堿性蛋白質(zhì)，在體內(nèi)近于中性的pH環(huán)境下帶有大量正電荷，可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接作用，和DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使侵入體內(nèi)的病毒失活。作為機(jī)體非特異免疫因子之一，溶菌酶參與機(jī)體多種免疫反應(yīng)，改善和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬和消化功能，激活其他白細(xì)胞吞噬功能，從而增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。臨床上常用于五官科各種炎癥、扁平疣及傳染性疣等各種皮膚病以及帶狀皰疹、腮腺炎、雞水痘、肝炎及流感等病毒性疾患的治療。另外，人體溶菌酶還可作為多種疾病的診斷指標(biāo)。
4用于日用化工溶菌酶作為一種蛋白質(zhì)，其用量在化妝品中應(yīng)用不受限制，能真正做到無毒、無殘留，是一種綠色防腐劑。因此，溶菌酶不僅可以用在食品防腐方面代替化學(xué)合成的食品防腐劑，也可作為化妝品的領(lǐng)域。郝杰等(2004)報(bào)道參考CTFA化妝品評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，研究了海洋溶菌酶的抑菌試驗(yàn)，通過測(cè)定第7d、14d、28d樣品中含細(xì)菌或霉菌數(shù)量，以評(píng)價(jià)防腐體系對(duì)微生物的抑殺效果。結(jié)果表明海洋溶菌酶在45℃以下、pH4～10內(nèi)均具有良好的穩(wěn)定性，受日化產(chǎn)品中常見金屬離子影響小，與護(hù)膚化妝品中常規(guī)成分配伍性良好，且廣譜殺菌，并且對(duì)參試的金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、大腸埃希氏菌等18株受試菌株均有抑制作用，防腐效果達(dá)到國(guó)內(nèi)外化妝品防腐標(biāo)準(zhǔn)。
溶菌酶還可以用于還可以有效的治療和預(yù)防感染性炎癥、非感染性炎癥。對(duì)口腔疾患，特別是牙槽化膿等牙周疾病的預(yù)防，控制及治療起到了非常重要的作用。研究表明在牙膏中添加0.05～5％的溶菌酶及若干種表面活性劑，可使之成為無礙牙膏機(jī)能的預(yù)防牙槽化膿等疾病的保健牙膏。
5用于生物工程溶菌酶具有破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的功能，以溶菌酶處理革蘭氏陽性細(xì)菌可得到原生質(zhì)體，因此溶菌酶是基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程必不可少的工具酶。國(guó)外多用于菌體內(nèi)容物質(zhì)的提取，只要把對(duì)溶菌酶敏感的菌體懸液在適當(dāng)緩沖液中用溶菌酶處理，再結(jié)合使用超聲波、冷凍離心等手段，就可得到無細(xì)胞提取液，進(jìn)一步精制，可得到所需的菌體物質(zhì)。因此生物工業(yè)的發(fā)展對(duì)溶菌酶制劑的需求量將與日俱增。
酶制劑產(chǎn)業(yè)是當(dāng)今中國(guó)最具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d產(chǎn)業(yè)之一，隨著基因工程、發(fā)酵技術(shù)等的發(fā)展，酶制劑在食品保鮮中將有更廣闊的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種DNA分子，其特征在于它編碼具有雞溶菌酶蛋白活性的多肽核苷酸序列，多肽核苷酸序列如附圖1所示。
2.一種載體，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的DNA序列，真核表達(dá)載體pPIC6αA或pGAPZαA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于構(gòu)建載體宿主細(xì)胞是大腸桿菌DH5a菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于構(gòu)建載體宿主細(xì)胞是該細(xì)胞是畢赤酵母X-33菌株。
5.一種生產(chǎn)基因工程雞溶菌酶的方法，其特征在于(a)、將篩選獲得的LYS蛋白質(zhì)的核苷酸序列可操作性的連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成LYS表達(dá)載體，所述的核苷酸編碼一多肽，所述的多肽具有溶菌酶活性；(b)、將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成表達(dá)LYS蛋白的重組細(xì)胞；(c)、在適合表達(dá)LYS多肽的條件下，培養(yǎng)、表達(dá)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)、分離純化出LYS蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)基因工程雞溶菌酶的方法，其特征在于蛋白表達(dá)方法中的提取工藝為工程菌種接種于BMGY培養(yǎng)基中，28℃，300rpm條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，離心收集菌體；重新懸浮、接種于含BMMY培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，流加100％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，控制溶氧度在30％以上，28℃條件下發(fā)酵100h，離心收集上清液，透析去離子，經(jīng)過陽離子交換樹脂層析柱，連續(xù)洗脫留取活性峰液，再透析去離子，經(jīng)活性鑒定后分裝凍干，即為成品。
7.雞蛋溶菌酶作為飼料添加劑的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雞蛋溶菌酶作為飼料添加劑的應(yīng)用，其特征在于其使用方法為按重量百分比計(jì)，溶菌酶添加量為10000～100000U/kg。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)制藥技術(shù)領(lǐng)域，主要是一種高活性雞溶菌酶的基因克隆、表達(dá)與應(yīng)用，基因工程重組方法生產(chǎn)修飾的雞蛋清溶菌酶的方法。本發(fā)明的解決方法是從數(shù)十種不同品種的雞蛋中分離獲得了一種具有高活性的雞蛋溶菌酶，通過基因克隆手段獲得了該溶菌酶基因；經(jīng)過PCR擴(kuò)增、酶切等操作后將基因?qū)氲秸婧吮磉_(dá)載體pPIC6αA和pGAPZαA中，并轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X－33內(nèi)進(jìn)行重組雞蛋清溶菌酶表達(dá)，然后提取、純化出該高活性溶菌酶。本發(fā)明由于采用基因工程重組技術(shù)，發(fā)酵生產(chǎn)基因重組高活性雞溶菌酶，可實(shí)現(xiàn)大批量的工業(yè)化生產(chǎn)，不受原材料來源的限制，其產(chǎn)品具有穩(wěn)定、純凈、生物活性高的特點(diǎn)?？蓮V泛應(yīng)用于制藥，食品，飼料，化妝品等多個(gè)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/79GK101050467SQ200710067728
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2007年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月20日
發(fā)明者黃繼榮, 傅正偉, 李浙烽, 余榮 申請(qǐng)人:李浙烽