專利名稱：Ot型雜種系百合脫毒組培快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組培快繁技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種OT型雜交百合的脫毒組培快繁方法。
背景技術(shù)：
OT型雜交百合(Oriental×Trumpet Hybrid)系東方百合與喇叭百合/奧列連諾斯雜種系的雜交系列，為百合科多年生觀賞植物，主要用于切花栽培。其植株莖桿強(qiáng)度、抗病性、耐熱性、耐鹽堿性等性狀明顯優(yōu)于東方百合，故有很好的市場(chǎng)開發(fā)前景。近年我國(guó)百合切花生產(chǎn)量年增長(zhǎng)20％以上，但百合種球卻一直依賴于從國(guó)外進(jìn)口。然而，病毒病侵染造成百合種性的嚴(yán)重退化，給世界各地百合種球生產(chǎn)者帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此開發(fā)百合組培脫毒快繁技術(shù)對(duì)實(shí)現(xiàn)種球國(guó)產(chǎn)化具有重要的意義。百合傳統(tǒng)采用簡(jiǎn)便的鱗片扦插繁育方法，但其一方面繁殖系數(shù)較低，新品種通過鱗片扦插繁殖至大面積推往往需要5～8年時(shí)間，十分不利于新品種的快速推廣；另一方面由于長(zhǎng)期無(wú)性繁殖導(dǎo)致病毒的感染和積累，使種球產(chǎn)量和質(zhì)量下降，從而限制了種球生產(chǎn)的發(fā)展。
組培與脫毒苗生產(chǎn)的關(guān)鍵是脫毒技術(shù)，而脫毒技術(shù)有多種，例如熱處理脫毒、莖尖培養(yǎng)脫毒和愈傷組織脫毒及相互間的組合脫毒。其中普遍采用較好的是莖尖培養(yǎng)脫毒法，其常規(guī)的步驟是通過植物頂端分生組織切取0.2～0.3mm莖尖，誘導(dǎo)愈傷組織，然后從愈傷組織分化產(chǎn)生鱗莖芽，長(zhǎng)成小植株得到脫毒苗或培養(yǎng)試管鱗莖。百合科百合屬園藝種應(yīng)用組培技術(shù)快速繁殖試管鱗莖已有成功的例子，并有相關(guān)的專利報(bào)導(dǎo)，例如，CN1762205A披露了采用莖尖作為外植體，經(jīng)莖尖培養(yǎng)后得到東方百合脫毒鱗莖的方法；CN1695427A發(fā)明名稱為“一種培育東方百合試管鱗莖的方法”公開了通過選擇無(wú)病毒的鱗莖，采用鱗片接種進(jìn)行無(wú)菌條件下培育鱗莖。
但是這兩種脫毒組織培養(yǎng)法存在的問題是前者切取很小的莖尖分生組織，在添加6-BA 1.0～2.0mg/L和NAA0.2～0.5mg/L的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)20～25d，莖尖會(huì)同時(shí)形成愈傷組織和不定芽，但從愈傷組織分化的不定芽(鱗莖芽)易發(fā)生遺傳變異；后者選擇生長(zhǎng)健壯植株的鱗莖，對(duì)經(jīng)檢測(cè)不帶病毒的鱗莖，直接進(jìn)行鱗片誘導(dǎo)培養(yǎng)，該方法一方面由于受檢測(cè)病毒種類的限制，存在有未經(jīng)莖尖脫毒培養(yǎng)的鱗莖仍帶有其它種類病毒的可能性；另一方面隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，容易產(chǎn)生植物體內(nèi)內(nèi)生菌大量繁殖而引起的污染，嚴(yán)重影響組培苗正常生產(chǎn)。
OT型雜交百合是近年荷蘭新育成的種間雜交品種，其品種特性與東方百合有較大差異，按常規(guī)方法進(jìn)行OT型雜交百合莖尖脫毒培養(yǎng)時(shí)易發(fā)生玻璃化，而且增殖系數(shù)較低，其鱗莖膨大培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件有嚴(yán)格的要求，故尚未見有關(guān)該品種百合組織培養(yǎng)成功的報(bào)道，因此，開發(fā)此項(xiàng)技術(shù)對(duì)加快OT型雜交百合新品種的推廣有重要價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是克服以上常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒法，所存在的通過愈傷組織分化，產(chǎn)生的鱗莖芽易發(fā)生遺傳變異、易發(fā)生玻璃化、增殖系數(shù)較低及脫毒不徹底等缺陷，提出一種適于OT型雜交百合脫毒組織培養(yǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基配方和應(yīng)用該配方進(jìn)行快速、種性好、低成本繁殖試管鱗莖的方法。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種OT型雜交百合脫毒組培快繁方法，按如下步驟進(jìn)行(1)培養(yǎng)基的配制、備用包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的組分與各組分在每升培養(yǎng)基內(nèi)所含重量為a)基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基選用白糖為30～50g/L，瓊脂粉為4～5g/L的MS基本培養(yǎng)基，pH為5.6～5.8；試管鱗莖膨大培養(yǎng)基選用白糖為70～90g/L，瓊脂粉為4.0g/L的MS基本培養(yǎng)基，另加甘露醇1.0～5.0g/L，AC 1.0～5.0mg/L，pH為6.0；b)誘導(dǎo)培養(yǎng)基I(種源鱗莖莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基)MS+6-BA 1.0～2.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+AC 1.0～3.0mg/L；c)誘導(dǎo)培養(yǎng)基II(組培苗莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基)MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；d)增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0.2～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；e)鱗莖膨大培養(yǎng)基MS+NAA 0.1～0.5mg/L；(2)外植體熱處理和滅菌取經(jīng)過5℃低溫處理3～4個(gè)月，打破休眠后的OT型雜交百合種源鱗莖，用透氣塑料薄膜包裹后置在潮濕泥炭中，于50℃培養(yǎng)箱內(nèi)熱處理70～90分鐘，剝離外層鱗片，取3～5cm長(zhǎng)的鱗莖芽，用水清洗后，進(jìn)行滅菌處理；(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)取步驟(2)0.2～0.3mm莖尖作為外植體，植于誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度1000～3000Lx的環(huán)境條件下，經(jīng)2個(gè)月培養(yǎng)，直接誘導(dǎo)成鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗；切去葉片，將鱗莖縱向切成2塊，轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度1000～3000Lx的環(huán)境條件下，誘導(dǎo)出多個(gè)鱗莖芽，經(jīng)2～3個(gè)月培養(yǎng)全部形成無(wú)根組培苗；將無(wú)根組培苗放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)按30、35、38℃的順序，每3d變換一檔，循環(huán)熱處理50～60d后，取0.2～0.3mm莖尖接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上，進(jìn)行第二次莖尖脫毒培養(yǎng)，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度1000～3000Lx的環(huán)境條件下，經(jīng)2～3個(gè)月培養(yǎng)，直接誘導(dǎo)出鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗，然后將它們直接放入3～5℃低溫處理45～60d，以提高組培苗生長(zhǎng)活性；(4)增殖培養(yǎng)將步驟(3)低溫處理后的鱗莖芽或無(wú)根組培苗，切去葉片和部分基部組織后的鱗莖，縱切成4～6塊，接種在增殖培養(yǎng)基上，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度1000～3000Lx的環(huán)境條件下培養(yǎng)2個(gè)月，形成健壯的鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗；(5)鱗莖膨大培養(yǎng)將步驟(4)鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗切去葉片和部分基部組織，接種在鱗莖膨大培養(yǎng)基中，在20±2℃和黑暗條件下培養(yǎng)60～70d，長(zhǎng)成直徑0.8～1.2cm，根系5～10條/粒，重0.5～1.0g/粒的試管鱗莖；(6)冷藏取出步驟(5)試管鱗莖用清水洗去瓊脂，包裹于消毒泥炭中，經(jīng)10～12℃預(yù)處理10～20d，再經(jīng)3～5℃冷藏處理50～60d打破休眠，打破休眠的鱗莖可在2～3℃下延長(zhǎng)貯藏2～3個(gè)月；(7)移栽將步驟(6)鱗莖，選擇具夏季冷涼氣候的800～1000米海拔地區(qū)，在避雨和防蟲隔離條件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒過的基質(zhì)上，定植30～35d后出苗；(8)病毒檢測(cè)采用RT-PCR檢測(cè)法，對(duì)步驟7)脫毒組培苗進(jìn)行LSV、LMoV病毒檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)病毒的侵染。
所述的種源鱗莖為OT型雜交百合(Oriental×Trumpet Hybrid)的周莖14～16cm的種球，其收獲期為11月下旬，經(jīng)5℃低溫處理3～4個(gè)月，打破休眠后用于莖尖脫毒培養(yǎng)。
所述的外植體滅菌處理為75％酒精浸泡0.5～1.0min，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1％升汞溶液滅菌15～20min，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用10％的次氯酸鈉水溶液滅菌13～15min，無(wú)菌水沖洗3～5次。
所述的移栽基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖按體積比7∶3配制而成。
本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明利用種源鱗莖莖尖作為脫毒組培的外植體，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基6-BA和IBA用量，并添加少量活性碳，達(dá)到不經(jīng)愈傷組織生長(zhǎng)階段而直接誘導(dǎo)出鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗，避免了從愈傷組織分化鱗莖芽易產(chǎn)生遺傳變異的弊病，保持了優(yōu)良品種的特性，并縮短了誘導(dǎo)培養(yǎng)周期60～70d，接種誘導(dǎo)率達(dá)77.0％，而不添加活性炭接種誘導(dǎo)率僅32.5％。
(2)本發(fā)明在種源鱗莖莖尖脫毒的基礎(chǔ)上，提出了利用組培苗進(jìn)行第2次熱處理莖尖脫毒與誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，即通過30、35、38℃三檔交替變溫處理，既能防止莖尖壞死，又能徹底脫毒；對(duì)誘導(dǎo)的鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗，進(jìn)行3～5℃低溫處理，克服了組培苗因高溫處理而導(dǎo)致的活性下降，使鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗切塊培養(yǎng)的增殖系數(shù)提高1～2倍。
(3)本發(fā)明所生產(chǎn)的試管鱗莖便于冷藏和延長(zhǎng)定植期，定植操作容易，定植成活率達(dá)98％以上，而一般生根組培苗定植成活率為70％左右。經(jīng)5℃低溫處理打破休眠的試管鱗莖，可在2～3℃條件下延長(zhǎng)貯藏2～3個(gè)月，在此期間可根據(jù)氣候條件選擇適宜時(shí)期集中定植，便于生產(chǎn)管理，克服了傳統(tǒng)的生根組培苗出瓶后必須隨時(shí)定植導(dǎo)致成活率低的難題，特別適合大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
種源鱗莖為OT型雜交百合(Oriental×Trumpet Hybrid)的周莖為14～16cm的種球，其收獲期為11月下旬，經(jīng)5℃低溫處理3～4個(gè)月，打破休眠后用于莖尖脫毒培養(yǎng)。
滅菌處理取種源鱗莖3～5cm長(zhǎng)的鱗莖芽，用水清洗后，以75％酒精浸泡0.5～1.0min，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1％升汞溶液滅菌15～20min，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用10％的次氯酸鈉水溶液滅菌13～15min，無(wú)菌水沖洗3～5次。
移栽基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖按體積比7∶3配制而成。
實(shí)施例1(OT型雜種系百合脫毒組培快繁方法1)具體方法按以下步驟進(jìn)行(1)培養(yǎng)基的制備、備用包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的組分與各組分在每升培養(yǎng)基內(nèi)所含重量按下述配方。
(2)外植體選取及滅菌于3月上旬，取休眠已打破的鱗莖，在50℃下濕熱處理70分鐘，經(jīng)75％酒精浸泡0.5min，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1％升汞溶液滅菌15min，無(wú)菌水沖洗3～5次，用10％的次氯酸鈉水溶液滅菌15min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5次，作為脫毒組培用的外植體。
(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)在接物鏡下取0.2～0.3mm莖尖接種在白糖30g/L，瓊脂粉4.0g/L的MS基本培養(yǎng)基+BA 2.0mg/L+IBA 0.15mg/L+AC3.0mg/L，pH為5.8的誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的環(huán)境條件下，不經(jīng)過愈傷組織階段，直接分化成鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗；經(jīng)2個(gè)月培養(yǎng)后將鱗莖縱向切成2塊，再移植至誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度1000Lx的環(huán)境條件下，誘導(dǎo)出多個(gè)鱗莖芽，經(jīng)2個(gè)月培養(yǎng)全部形成無(wú)根組培苗；將無(wú)根組培苗放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)按30、35、38℃的順序，每3d變換一檔，循環(huán)熱處理60d后，取0.2～0.3mm莖尖培養(yǎng)接種在白糖30g/L，瓊脂粉4.0g/L的MS基本培養(yǎng)基+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的環(huán)境條件下，直接誘導(dǎo)出鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗，然后將組培瓶苗直接放入3℃低溫處理45d，以提高組培苗生長(zhǎng)活性。
(4)增殖培養(yǎng)在無(wú)菌條件下將鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗切去葉片和部分基部組織，將帶有鱗莖基部組織的鱗莖切成4～6塊，接種在白糖30g/L，瓊脂粉4.0g/L的MS基本培養(yǎng)基+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L的增殖培養(yǎng)基上，在溫度為21℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1000Lx的環(huán)境條件下，誘導(dǎo)出鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗；(5)鱗莖膨大培養(yǎng)將步驟(4)鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗切去葉片和部分基部組織，接種在白糖為70g/L，瓊脂粉為4.0g/L的MS基本培養(yǎng)基+NAA 0.5mg/L+AC 1.0mg/L+甘露醇1.0g/L的鱗莖膨大培養(yǎng)基上，在22℃和黑暗條件下培養(yǎng)70d，直接生成直徑0.8～1.2cm，根系5～10條/粒，重0.5～1.0g/粒的試管鱗莖；(6)冷藏當(dāng)步驟(5)鱗莖膨大培養(yǎng)結(jié)束后，取出鱗莖用清水洗去瓊脂，包裹于消毒過的泥炭中，經(jīng)12℃預(yù)處理20d，再在3℃處理冷藏50d；(7)移栽當(dāng)步驟(6)試管鱗莖打破休眠后，選擇具夏季冷涼氣候的800～1000米海拔地區(qū)，在避雨和防蟲隔離條件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒過的基質(zhì)上，定植后30～35d出苗；(8)病毒檢測(cè)采用RT-PCR檢測(cè)法，對(duì)脫毒組培苗進(jìn)行LSV、LMoV病毒檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果未發(fā)預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，說明經(jīng)過莖尖脫毒培養(yǎng)的組培苗中不存在這2種病毒的侵染。
實(shí)施例2(OT型雜種系百合脫毒組培快繁方法2)(1)培養(yǎng)基的制備、備用包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的組分與各組分在每升培養(yǎng)基內(nèi)所含重量按下述配方。
(2)外植體選取及滅菌于3月中旬，取休眠已打破的鱗莖，在50℃下濕熱處理90分鐘，經(jīng)75％酒精浸泡1.0min，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1％升汞溶液滅菌20min，無(wú)菌水沖洗3～5次，用10％的次氯酸鈉水溶液滅菌13min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5次，作為脫毒組培用的外植體。
(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)在接物鏡下取0.2～0.3mm莖尖接種在白糖40g/L，瓊脂粉4.5g/L的MS基本培養(yǎng)基+BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L，AC1.0mg/L，pH為5.8的誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的環(huán)境條件下，不經(jīng)過愈傷組織階段，直接分化成鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗；經(jīng)2個(gè)月培養(yǎng)后將鱗莖縱向切成2塊，再移植至誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的環(huán)境條件下，誘導(dǎo)出多個(gè)鱗莖芽，經(jīng)3個(gè)月培養(yǎng)全部形成無(wú)根組培苗；將無(wú)根組培苗放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)按30、35、38℃的順序，每3d變換一檔，循環(huán)熱處理50d后，取0.2～0.3mm莖尖培養(yǎng)接種在白糖40g/L，瓊脂粉4.5g/L的MS基本培養(yǎng)基+6-BA0.75mg/L+IBA 0.5mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度3000Lx的環(huán)境條件下，直接誘導(dǎo)出鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗，然后將組培瓶苗直接放入5℃低溫處理60d，以提高組培苗生長(zhǎng)活性。
(4)增殖培養(yǎng)在無(wú)菌條件下將鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗切去葉片和部分基部組織，將帶有鱗莖基部組織的鱗莖切成4～6塊，接種在白糖40g/L，瓊脂粉4.5g/L的MS基本培養(yǎng)基+6-BA 0.55mg/L+IBA 0.3mg/L的增殖培養(yǎng)基上，在溫度為20℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的環(huán)境條件下，誘導(dǎo)出鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗；(5)鱗莖膨大培養(yǎng)將步驟(4)鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗切去葉片和部分基部組織，接種在白糖為80g/L，瓊脂粉為4.0g/L的MS基本培養(yǎng)基+NAA 0.3mg/L+AC 2.5mg/L+甘露醇3.0g/L的鱗莖膨大培養(yǎng)基上，在21℃和黑暗條件下培養(yǎng)60d，直接生成直徑0.8～1.2cm，根系5～10條/粒，重0.5～1.0g/粒的試管鱗莖；(6)冷藏當(dāng)步驟(5)鱗莖膨大培養(yǎng)結(jié)束后，取出鱗莖用清水洗去瓊脂，包裹于消毒過的泥炭中，經(jīng)10℃預(yù)處理10d，再在5℃處理冷藏60d；(7)移栽當(dāng)步驟(6)試管鱗莖打破休眠后，選擇具夏季冷涼氣候的800～1000米海拔地區(qū)，在避雨和防蟲隔離條件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒過的基質(zhì)上，定植后30～35d出苗；(8)病毒檢測(cè)RT-PCR檢測(cè)法，對(duì)脫毒組培苗進(jìn)行LSV、LMoV病毒檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果未發(fā)預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，說明經(jīng)過莖尖脫毒培養(yǎng)的組培苗中不存在這2種病毒的侵染。
實(shí)施例3(OT型雜種系百合脫毒組培快繁方法3)(1)培養(yǎng)基的制備、備用包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的組分與各組分在每升培養(yǎng)基內(nèi)所含重量按下述配方。
(2)外植體選取及滅菌于3月上旬，取休眠已打破的鱗莖，在50℃下濕熱處理80分鐘，經(jīng)75％酒精浸泡0.75min，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1％升汞溶液滅菌18min，無(wú)菌水沖洗3～5次，用10％的次氯酸鈉水溶液滅菌14min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5次，作為脫毒組培用的外植體。
(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)在接物鏡下取0.2～0.3mm莖尖接種在白糖50g/L，瓊脂粉5.0g/L的MS基本培養(yǎng)基+BA1.5mg/L+IBA 0.3mg/L+AC2.0mg/L，pH為5.7的誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的環(huán)境條件下，不經(jīng)過愈傷組織階段，直接分化成鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗；經(jīng)2個(gè)月培養(yǎng)后將鱗莖縱向切成2塊，再移植至誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度3000Lx的環(huán)境條件下，誘導(dǎo)出多個(gè)鱗莖芽，經(jīng)3個(gè)月培養(yǎng)全部形成無(wú)根組培苗；將無(wú)根組培苗放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)按30、35、38℃的順序，每3d變換一檔，循環(huán)熱處理60d后，取0.2～0.3mm莖尖培養(yǎng)接種在白糖50g/L，瓊脂粉5.0g/L的MS基本培養(yǎng)基+6-BA0.5mg/L+IBA 0.1mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度2000Lx的環(huán)境條件下，直接誘導(dǎo)出鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗，然后將組培瓶苗直接放入4℃低溫處理50d，以提高組培苗生長(zhǎng)活性。
(4)增殖培養(yǎng)在無(wú)菌條件下將鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗切去葉片和部分基部組織，將帶有鱗莖基部組織的鱗莖切成4～6塊，接種在白糖50g/L，瓊脂粉5.0g/L的MS基本培養(yǎng)基+6-BA0.25mg/L+IBA 0.1mg/L的增殖培養(yǎng)基上，在溫度為19℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度3000Lx的環(huán)境條件下，誘導(dǎo)出鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗；(5)鱗莖膨大培養(yǎng)將步驟(4)鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗切去葉片和部分基部組織，接種在白糖為90g/L，瓊脂粉為4.0g/L的MS基本培養(yǎng)基+NAA 0.15mg/L+AC4.5mg/L+甘露醇1.5g/L的鱗莖膨大培養(yǎng)基上，在19℃和黑暗條件下培養(yǎng)70d，直接生成直徑0.8～1.2cm，根系5～10條/粒，重0.5～1.0g/粒的試管鱗莖；(6)冷藏當(dāng)步驟(5)鱗莖膨大培養(yǎng)結(jié)束后，取出鱗莖用清水洗去瓊脂，包裹于消毒過的泥炭中，經(jīng)11℃預(yù)處理15d，再在4℃處理冷藏55d；(7)移栽當(dāng)步驟(6)試管鱗莖打破休眠后，選擇具夏季冷涼氣候的800～1000米海拔地區(qū)，在避雨和防蟲隔離條件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒過的基質(zhì)上，定植后30～35d出苗；(8)病毒檢測(cè)采用RT-PCR檢測(cè)法，對(duì)脫毒組培苗進(jìn)行LSV、LMoV病毒檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果未發(fā)預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，說明經(jīng)過莖尖脫毒培養(yǎng)的組培苗中不存在這2種病毒的侵染。
實(shí)施例4(脫毒組培苗的病毒檢測(cè))(1)植物材料a)對(duì)照材料以帶毒的百合鱗莖為材料。
b)處理材料以實(shí)施例1獲得的百合脫毒組培苗為材料。
(2)病毒的RNA抽提采用RNeasy Plant mini(QIAGEN)試劑盒，分別對(duì)每個(gè)百合樣品進(jìn)行總RNA的抽提，所用試劑器皿均需作無(wú)RNA酶處理，具體操作流程如下a)稱取約0.1g的百合葉片，在滅菌的研缽中加液氮磨細(xì)后轉(zhuǎn)入無(wú)菌Eppendorf管中。
b)迅速加入450μL RLT，緩沖液，振蕩混勻后56℃溫育3min。
c)將裂解液全部轉(zhuǎn)入紫色管，13,000g離心2min。
d)將濾液轉(zhuǎn)入新的無(wú)菌Eppendorf管中(注意不要攪動(dòng)沉淀)，加225μL無(wú)水乙醇輕柔顛倒混勻。
e)將所有樣品轉(zhuǎn)入粉紅色小管，13,000g離心15秒，棄濾液，留收集管。
f)加700μL RW1于粉紅色小管，13,000g離心15秒，棄濾液和收集管。
g)將RNA柱移入新的Kit中提供的2mL收集管中。
h)加500μL RPE于粉紅色小管，13,000g離心15秒，棄濾液。
i)再次加500μL RPE于粉紅色小管，13,000g離心2min，干燥膜，確保柱邊無(wú)水痕，棄濾液和收集管。
j)將粉紅色小管插到無(wú)菌的Eppendorf管(Kit中提供)加30μL無(wú)RNase水，10,000g離心1min，提取的RNA置-80℃保存。
(3)病毒各基因序列的擴(kuò)增a)引物設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)中的引物主要根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的百合斑駁病毒(Lily mottle virus，LMoV)和百合無(wú)癥病毒(Lily symptomless virus，LSV)分離物序列設(shè)計(jì)。
b)cDNA第一鏈合成用設(shè)計(jì)的下游引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。模板RNA 12.5μL，下游引物(100μmol/L)2μL，10×RT緩沖液2μL，10mmol/L dNTPs2μL，RNasin 0.5μL，鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，Promega)1μL，總體積20μL。37℃1-2h后加入60μL滅菌水，劇烈振蕩混勻后貯于-20℃?zhèn)溆谩?br> c)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)用病毒提取的RNA合成的cDNA第一鏈做模板來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用Ex TaqTM PCR System(Life Technology Ltd)擴(kuò)增目的片段。加入5μL 10×PCR緩沖液，再加入4μL 2.5mmol/L dNTPs，2μL(20μmol/L)上游引物及2μL下游引物，2μL cDNA第一鏈模板和0.2μL Taq DNAPolymerase(GIBCO)，用無(wú)菌去離子水調(diào)整到50μL。進(jìn)入PCR循環(huán)94℃3min94℃30secTm℃30sec30個(gè)循環(huán)72℃1-2min72℃10min具體參數(shù)可根據(jù)引物、模板、PCR片段大小來適量調(diào)整。
(4)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％Agarose Gel瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后，在紫外燈下觀察，檢測(cè)擴(kuò)增的片段和長(zhǎng)度。
對(duì)帶毒的百合鱗莖和莖尖脫毒組培苗分別進(jìn)行LSV、LMoV病毒檢測(cè)，帶毒的百合鱗莖檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，莖尖脫毒組培苗檢測(cè)結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，說明經(jīng)過莖尖脫毒培養(yǎng)的組培苗中不存在這2種病毒的侵染。
權(quán)利要求
1.OT型雜種系百合脫毒組培快繁方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行(1)培養(yǎng)基的配制、備用包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的組分與各組分在每升培養(yǎng)基內(nèi)所含重量為a)基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基選用白糖為30～50g/L，瓊脂粉為4～5g/L的MS基本培養(yǎng)基，pH為5.6～5.8；試管鱗莖膨大培養(yǎng)基選用白糖為70～90g/L，瓊脂粉為4.0g/L的MS基本培養(yǎng)基，另加甘露醇1.0～5.0g/L，AC 1.0～5.0mg/L，pH為6.0；b)誘導(dǎo)培養(yǎng)基IMS+6-BA 1.0～2.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+AC1.0～3.0mg/L；c)誘導(dǎo)培養(yǎng)基IIMS+6-BA 0.5～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；d)增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0.2～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；e)鱗莖膨大培養(yǎng)基MS+NAA 0.1～0.5mg/L；(2)外植體熱處理和滅菌取經(jīng)過5℃低溫處理3～4個(gè)月，打破休眠后的OT型雜交百合種源鱗莖，用透氣塑料薄膜包裹后置在潮濕泥炭中，于50℃培養(yǎng)箱內(nèi)熱處理70～90分鐘，剝離外層鱗片，取3～5cm長(zhǎng)的鱗莖芽，用水清洗后，進(jìn)行滅菌處理；(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)取步驟(2)0.2～0.3mm莖尖作為外植體，植于誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度1000～3000Lx的環(huán)境條件下，經(jīng)2個(gè)月培養(yǎng)，直接誘導(dǎo)成鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗；切去葉片，將鱗莖縱向切成2塊，轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度1000～3000Lx的環(huán)境條件下，誘導(dǎo)出多個(gè)鱗莖芽，經(jīng)2～3個(gè)月培養(yǎng)全部形成無(wú)根組培苗；將無(wú)根組培苗放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)按30、35、38℃的順序，每3d變換一檔，循環(huán)熱處理50～60d后，取0.2～0.3mm莖尖接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基II上，進(jìn)行第二次莖尖脫毒培養(yǎng)，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度1000～3000Lx的環(huán)境條件下，經(jīng)2～3個(gè)月培養(yǎng)，直接誘導(dǎo)出鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗，然后將它們直接放入3～5℃低溫處理45～60d，以提高組培苗生長(zhǎng)活性；(4)增殖培養(yǎng)將步驟(3)低溫處理后的鱗莖芽或無(wú)根組培苗，切去葉片和部分基部組織后的鱗莖，縱切成4～6塊，接種在增殖培養(yǎng)基上，在溫度20±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度1000～3000Lx的環(huán)境條件下培養(yǎng)2個(gè)月，形成健壯的鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗；(5)鱗莖膨大培養(yǎng)將步驟(4)鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗切去葉片和部分基部組織，接種在鱗莖膨大培養(yǎng)基中，在20±2℃和黑暗條件下培養(yǎng)60～70d，長(zhǎng)成直徑0.8～1.2cm，根系5～10條/粒，重0.5～1.0g/粒的試管鱗莖；(6)冷藏取出步驟(5)試管鱗莖用清水洗去瓊脂，包裹于消毒泥炭中，經(jīng)10～12℃預(yù)處理10～20d，再經(jīng)3～5℃冷藏處理50～60d打破休眠，打破休眠的鱗莖可在2～3℃下延長(zhǎng)貯藏2～3個(gè)月；(7)移栽將步驟(6)鱗莖，選擇具夏季冷涼氣候的800～1000米海拔地區(qū)，在避雨和防蟲隔離條件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒過的基質(zhì)上，定植30～35d后出苗；(8)病毒檢測(cè)采用RT-PCR檢測(cè)法，對(duì)步驟7)脫毒組培苗進(jìn)行LSV、LMoV病毒檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)病毒的侵染。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的種源鱗莖為OT型雜交百合(Oriental×Trumpet Hybrid)的周莖為14～16cm的種球。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的外植體滅菌處理為75％酒精浸泡0.5～1.0min，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1％升汞溶液滅菌15～20min，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用10％的次氯酸鈉水溶液滅菌13～15min，無(wú)菌水沖洗3～5次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的移栽基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖按體積比7∶3配制而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了OT型雜種系百合脫毒組培快繁方法，屬于植物組培快繁技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括培養(yǎng)基的配制，取百合種源鱗莖莖尖為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)、增殖、鱗莖膨大培養(yǎng)、冷藏、移栽、病毒檢測(cè)等步驟，快速獲得大量脫毒組培苗。本發(fā)明通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的配方，并采用二次莖尖熱處理脫毒與誘導(dǎo)培養(yǎng)等技術(shù)，達(dá)到不經(jīng)愈傷組織生長(zhǎng)階段而直接誘導(dǎo)出鱗莖芽和/或無(wú)根組培苗，防止了種性變異，縮短了誘導(dǎo)培養(yǎng)周期，具有脫毒徹底，增殖系數(shù)高，生產(chǎn)成本較低，實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)，可在百合等植物脫毒組培生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/04GK101061790SQ20071006803
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月13日
發(fā)明者郭方其, 黎俠, 丁曉瑜, 林森洪, 柴金甫, 陳世平 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院