專利名稱：一種生產(chǎn)5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是四氫吡咯的前綴化合物，是生物體合成葉綠素、血紅素、卟啉和維生素B12等必不可少的物質(zhì)。近年來ALA除作為一種環(huán)境相容性及選擇性很高的新型光活化農(nóng)藥外，還在臨床上用作光化療劑。作為新一代光動力學藥劑其具有毒性小，選擇性高等顯著優(yōu)點，被用來治療皮膚癌、膀胱癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等多種癌癥，在光化療領(lǐng)域正逐步展現(xiàn)其巨大的應用性。
由于化學法合成ALA步驟繁瑣且產(chǎn)率低，故生物合成方法正逐步展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢。其一是生物誘變法，優(yōu)化類球紅細菌的突變株CR 720(Rhodobactersphaeroides CR720)培養(yǎng)條件，ALA的產(chǎn)量可達27mmol/L，但其培養(yǎng)條件復雜、周期長和成本較高。其二是基因工程方法，Mariet J.Vander Werf等(1996年)和Choi等(1999年)分別構(gòu)建了含有類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides和大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicμm.的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(hemA)的工程菌，用于生產(chǎn)ALA，但酶活和產(chǎn)量均較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌是含有類球紅細菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，在中國專利局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.1939。保藏日期2007.1.25，分類命名中文名為大腸埃希氏菌，拉丁文學名為Escherichia coliRosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA，保藏單位地址中國科學院微生物研究所。
上述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示的序列。
上述5-氨基乙酰丙酸合成酶氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示的序列或在其基礎(chǔ)上減少、替代、增加一個氨基酸殘基的具有5-氨基乙酰丙酸合成酶活性的氨基酸序列。
生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟1)從類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)的菌液中提取總基因組DNA，類球紅細菌可由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心購買得到，保藏編號為CGMCC編號1.2174；2)用聚合酶鏈式反應擴增出5-氨基乙酰丙酸合成酶基因；3)將擴增出的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因與克隆載體pMD-18T simple(商業(yè)化載體，從TaKaRa公司購買)連接，進行DNA測序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；4)將測序后的目的基因片斷與表達載體pET28a(商業(yè)化載體，從德國Novagen公司購買)連接，構(gòu)建出重組子pET28a-R.S.hemA；5)將重組子pET28a-R.S.hemA轉(zhuǎn)化至宿主菌中，即可。
為獲得較高的5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量，本發(fā)明中的宿主菌采用大腸桿菌Rosetta(DE3)(商業(yè)化菌株，從德國Novagen公司購買)。
本發(fā)明將一種類球紅細菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因接入表達載體pET28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，在誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作用下，有較高的可溶性5-氨基乙酰丙酸合成酶表達，且經(jīng)優(yōu)化表達后胞外ALA的產(chǎn)量高達6.6g/L。


圖1是重組質(zhì)粒pET28a-R.S.hemA的構(gòu)建圖，圖中，R.S.hemA為5-氨基乙酰丙酸合成酶基因，Kana+為卡那霉素抗性基因，EcoRI和HindIII為限制性內(nèi)切酶位點；圖2是工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA誘導表達示意圖。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明實施例1本發(fā)明生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟1.類球紅細菌基因組DNA的提取1)將過夜培養(yǎng)的菌液放在1.5ml離增中，13,000×g離心1min后去上清；2)用500μl TE緩沖液溶解后，加30μl 10％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液，同時加3μl 20mg/ml蛋白酶K，混勻后，37℃保溫1h；3)加1/5體積5mol/L NaCl溶液，再加約1/5體積CTAB/NaCl溶液(4.1g NaCl溶解于80ml H2O，緩慢加入10g CTAB，加水至100ml)，65℃保溫30min；4)加等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液(酚∶氯仿∶異戊醇的體積比為25∶24∶1)，13,000×g離心5min；
5)取上清液加等體積的氯仿和異戊醇的混合液(氯仿∶異戊醇的體積比為24∶1)，13,000×g離心5min；7)取上清液加2倍體積的無水乙醇及1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH 4.6)，于-20℃下靜置10min后，13,000×g離心5min；8)去上清液所得的DNA沉淀用70％的乙醇洗2次后，自然風干后，溶于TE緩沖液中(含20μg/ml RNase)，55℃水浴處理30min，即得到基因組DNA。
2用聚合酶鏈反應(PCR)擴增出5-氨基乙酰丙酸合成酶基因1)取上述提取的基因組DNA 20μg，濃度均為10μmol/L的兩引物各1μl(5’端引物為GGATCCGAATTCATGGACTACAATCTGGCACTC，3’端引物為AAGCTTTCAGGCAACGACCTCGGCGCGA)，10×反應緩沖液2μl，PfuDNA聚合酶(5unit/μl)0.5μl，4種脫氧核苷酸(dNTP)濃度均為10mmol/L的混合液0.5μl，加于0.5ml PCR管中，用雙蒸水補足20μl；2)將上述20μl反應液，放入PCR儀中，反應條件為94℃預變性5min，然后94℃變性30s，59℃復性30s，72℃延伸2min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min；3)把PCR擴增后的產(chǎn)物，加5μl上樣緩沖液，用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定出一條約1.2kb的條帶；3.將擴增出的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因與克隆載體pMD-18T simple連接，進行DNA測序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列1)將PCR擴增的hemA基因用膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)進行切膠回收；2)在10μl的反應體系中取7μl回收的基因片斷加0.5μl 200μmol/L脫氧腺苷酸(dATP)，0.3μl 25mmol/L MgCl2，0.2μl(5unit/μl)TaqDNA聚合酶，1μl 10×反應緩沖液，其余用雙蒸水補足，此反應系統(tǒng)在70℃下反應30min，使hemA基因加上脫氧腺苷酸(A’)末端；3)將具有A’末端的目的基因與克隆載體pMD-18T simple在16℃下連接2h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α(見圖1)；4)在含100μg/μl的氨芐青霉素及5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和IPTG各800μg的LB培養(yǎng)基平板上經(jīng)藍白斑系統(tǒng)篩選出陽性克隆，即從轉(zhuǎn)化平皿上挑出5個白色克隆進行鑒定(1升LB培養(yǎng)基含10克蛋白胨、5克酵母粉、10克氯化鈉，pH 7.0)；5)對這5個克隆用EcoRI和HindIII雙酶切，其中4個分別在約3kb和1.2kb處有條帶，具有1.2kb的基因片斷認為連接成功，其余1個只有在3kb處有條帶，說明目的基因沒有連接上；6)用EcoRI和HindIII雙酶切鑒定出有正確插入的克隆(即重組子)命名為pMD18T-R.S.-hemA，進行DNA測序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.將測序后的目的基因片斷與表達載體pET28a連接，構(gòu)建出重組子pET28a-R.S.-hemA，用此重組子轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)1)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII酶切重組質(zhì)粒pMD18T-R.S.-hemA；切下1.2kb片斷進行膠回收；2)用內(nèi)切酶EcoRI和HindIII處理表達載體pET28a，用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收約5.0kb的大片斷；3)兩種回收產(chǎn)物在16℃下連接4h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Rosetta(DE3)，這樣hemA基因就定向連接到表達載體pET28a的EcoRI和HindIII位點處，將這種表達載體命名為pET28a-R.S.-hemA，而含有這種表達載體的工程菌命名為Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA，即為本發(fā)明的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌(見圖1)。
實施例25-氨基乙酰丙酸合成酶在誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作用下的表達1)將本發(fā)明工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA培養(yǎng)在含50ml LB培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中，先在37℃，200rpm下培養(yǎng)2.0h；然后降溫至28℃，用2.5μl 1mol/L IPTG誘導，繼續(xù)培養(yǎng)6h后，取30ml菌液于10,000×rpm離心10min去上清液；2)用9ml 50mmol/L Tris·Cl(pH 7.5)洗滌一次后，再用同樣量的緩沖液重懸，超聲破胞，其條件為300w工作5s，間歇7s，重復30次，10,000×rpm離心10min；3)取上清液進行10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；4)根據(jù)電泳結(jié)果在約50.0kDa處有占總蛋白量25％的可溶蛋白表達(見圖2)，此大小與SEQ ID NO.2的氨基酸序列大小基本一致，即認為此蛋白為5-氨基乙酰丙酸合成酶過量表達。
實施例35-氨基乙酰丙酸合成酶的比活力測定1)將500μl含有50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、20mmol/L MgCl2、0.1mol/L甘氨酸、0.27mmol/L磷酸吡哆醛、0.2mmol/L琥珀酰輔酶A和破胞后的細胞上清液的混合液，于37℃反應10min；2)取上述反應液加150μl 10％三氯乙酸于1.5mL離心管中混合，13,000×g離心5min；3)取300μl上清液與400μl 1mol/L乙酸鹽緩沖液(pH 4.6)和35μl乙酰丙酮混合，沸水浴15min；4)冷卻15min至室溫后，再加入700μl新鮮配制的Ehrlich試劑(依次加入30ml的冰乙酸，1g對-二甲氨基苯甲醛，5ml 70％的高氯酸，5ml水，溶解后用冰乙酸定容至50ml)，反應30min后在554nm處測定其吸光值，ALA的濃度(mg/L)＝20.574×OD554-0.49(R2＝0.9994)；5)蛋白濃度由蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(BCA Protein Assay Kit)測定，測出含有hemA基因的重組菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶的比活力為33.8nmol-1min-1mg of protein-1(1個酶單位定義為1min內(nèi)生成1nmol ALA所需的酶量；酶的比活力為每毫克蛋白所含的酶單位)，而不含重組子的大腸桿菌Rosetta(DE3)檢測不到5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性。
SEQ ID NO.1長度1224bp類型脫氧核糖核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性來源從類球紅細菌基因組中PCR擴增而來特征編碼5-氨基乙酰丙酸合成酶的核苷酸序列SEQ ID NO.2長度407個氨基酸殘基類型肽鏈鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性來源類球紅細菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因推斷得到特征具有5-氨基乙酰丙酸合成酶活性序列表<110>浙江大學<120>一種生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其構(gòu)建方法<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1224<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1atggactaca atctggcact cgataccgct ctgaaccggc tccataccga gggccggtac60cggaccttca tcgacatcga gcggcgcaag ggtgccttcc cgaaagccat gtggcgcaag 120cccgacggga gcgagaagga aatcaccgtc tggtgcggca acgactatct cggcatgggc 180cagcatccgg tggtgctggg ggccatgcac gaggcgctgg attcgaccgg cgccgggtcg 240ggcggcacgc gcaacatctc gggcaccacg ctctatcaca agcgcctcga ggccgagctc 300gccgacctgc acggcaagga agcggcgctg gtcttctcgt cggcctatat cgccaacgac 360gcgaccctct cgacgctgcc gcagctgatc ccgggcctcg tcatcgtctc ggacaagttg 420aaccacgctt cgatgatcga gggcatccgc cgctcgggca ccgagaagca catcttcaag 480cacaatgacc tcgacgacct gcgccggatc ctgacctcga tcggcaagga ccgtccgatc 540ctcgtggcct tcgaatccgt ctattcgatg gatggcgact tcggccgcat cgaggagatc 600tgcgacatcg ccgacgagtt cggcgcgctg aaatacatcg acgaggtcca tgccgtcggc 660atgtacggcc cccgcggcgg cggcgtggcc gagcgggacg ggctgatgga ccggatcgac 720atcatcaacg ggacgctggg caaggcctat ggcgtgttcg gcggctatat cgcggcctcg 780tcaaagatgt gcgacgcggt gcgctcctac gcgccgggct tcatcttctc gacctcgctg 840ccgcccgtcg tggcggccgg tgcggcggcc tcggtgcgcc acctcaaggg cgatgtggag 900ctgcgcgaga agcaccagac ccaggcccgc atcctgaaga tgcgcctcaa ggggctcggc 960ctgccgatca tcgaccacgg ctcgcacatc gtgccggtcc atgtgggcga ccccgtgcac 1020tgcaagatga tctcggacat gctgctcgag catttcggca tctatgtcca gccgatcaac 1080ttcccgaccg tgccgcgcgg gaccgagcgg ctgcgcttca ccccgtcgcc cgtgcatgat 1140tccggcatga tcgatcacct cgtgaaggcc atggacgtgc tctggcagca ctgtgcgctg 1200aatcgcgccg aggtcgttgc ctga 1224
<210>2<211>407<212>PRT<213>Escherichia coli<400>2Met Asp Tyr Asn Leu Ala Leu Asp Thr Ala Leu Asn Arg Leu His Thr1 5 10 15Glu Gly Arg Tyr Arg Thr Phe Ile Asp Ile Glu Arg Arg Lys Gly Ala20 25 30Phe Pro Lys Ala Met Trp Arg Lys Pro Asp Gly Ser Glu Lys Glu Ile35 40 45Thr Val Trp Cys Gly Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Val50 55 60Val Leu Gly Ala Met His Glu Ala Leu Asp Ser Thr Gly Ala Gly Ser65 70 75 80Gly Gly Thr Arg Asn Ile Ser Gly Thr Thr Leu Tyr His Lys Arg Leu85 90 95Glu Ala Glu Leu Ala Asp Leu His Gly Lys Glu Ala Ala Leu Val Phe100 105 110Ser Ser Ala Tyr Ile Ala Asn Asp Ala Thr Leu Ser Thr Leu Pro Gln115 120 125Leu Ile Pro Gly Leu Val Ile Val Ser Asp Lys Leu Asn His Ala Ser130 135 140Met Ile Glu Gly Ile Arg Arg Ser Gly Thr Glu Lys His Ile Phe Lys145 150 155 160His Asn Asp Leu Asp Asp Leu Arg Arg Ile Leu Thr Ser Ile Gly Lys165 170 175Asp Arg Pro Ile Leu Val Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Asp Gly180 185 190Asp Phe Gly Arg Ile Glu Glu Ile Cys Asp Ile Ala Asp Glu Phe Gly195 200 205
Ala Leu Lys Tyr Ile Asp Glu Val His Ala Val Gly Met Tyr Gly Pro210 215 220Arg Gly Gly Gly Val Ala Glu Arg Asp Gly Leu Met Asp Arg Ile Asp225 230 235 240Ile Ile Asn Gly Thr Leu Gly Lys Ala Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr245 250 255Ile Ala Ala Ser Ser Lys Met Cys Asp Ala Val Arg Ser Tyr Ala Pro260 265 270Gly Phe Ile Phe Ser Thr Ser Leu Pro Pro Val Val Ala Ala Gly Ala275 280 285Ala Ala Ser Val Arg His Leu Lys Gly Asp Val Glu Leu Arg Glu Lys290 295 300His Gln Thr Gln Ala Arg Ile Leu Lys Met Arg Leu Lys Gly Leu Gly305 310 315 320Leu Pro Ile Ile Asp His Gly Ser His Ile Val Pro Val His Val Gly325 330 335Asp Pro Val His Cys Lys Met Ile Ser Asp Met Leu Leu Glu His Phe340 345 350Gly Ile Tyr Val Gln Pro Ile Asn Phe Pro Thr Val Pro Arg Gly Thr355 360 365Glu Arg Leu Arg Phe Thr Pro Ser Pro Val His Asp Ser Gly Met Ile370 375 380Asp His Leu Val Lys Ala Met Asp Val Leu Trp Gln His Cys Ala Leu385 390 395 400Asn Arg Ala Glu Val Val Ala40權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌，其特征在于此菌是含有類球紅細菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，中文名為大腸埃希氏菌，拉丁文學名為Escherichia coli Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA，在中國專利局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.1939。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌，其特征在于所說的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌，其特征在于所說的5-氨基乙酰丙酸合成酶氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或在其基礎(chǔ)上減少、替代和增加一個氨基酸殘基的具有5-氨基乙酰丙酸合成酶活性的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟1)從類球紅細菌的菌液中提取總基因組DNA；2)用聚合酶鏈式反應擴增出5-氨基乙酰丙酸合成酶基因；3)將擴增出的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因與克隆載體pMD-18T simple連接，進行DNA測序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；4)將測序后的目的基因片斷與表達載體pET28a連接，構(gòu)建出重組子pET28a-R.S.hemA；5)將重組子pET28a-R.S.hemA轉(zhuǎn)化至宿主菌中，即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所說的宿主菌為大腸桿菌Rosetta(DE3)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其構(gòu)建方法。該菌是含有類球紅細菌的5－氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌。構(gòu)建方法包括以下步驟1)從類球紅細菌的菌液中提取總基因組DNA；2)用聚合酶鏈式反應擴增出5－氨基乙酰丙酸合成酶基因；3)將擴增出的5－氨基乙酰丙酸合成酶基因與克隆載體pMD－18T simple連接，進行DNA測序；4)將測序后的目的基因片斷與表達載體pET28a連接，構(gòu)建出重組子pET28a－R.S.hemA；5)將重組子pET28a－R.S.hemA轉(zhuǎn)化至宿主菌中，即可。本發(fā)明具有較高酶活的可溶性5－氨基乙酰丙酸合成酶表達，且經(jīng)優(yōu)化表達后胞外ALA的產(chǎn)量高達6.6g/L。
文檔編號C12N15/52GK101063104SQ200710068168
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日
發(fā)明者林建平, 傅維琦, 岑沛霖 申請人:浙江大學