專(zhuān)利名稱(chēng)：生產(chǎn)5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其構(gòu)建和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其構(gòu)建和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)廣泛存在于生物體中，是合成血紅素、葉綠素、維生素B12等四吡咯化合物的共同前體。ALA作為一種光動(dòng)力學(xué)劑(photodynamic agent，PDT)，在農(nóng)用化學(xué)品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的用途。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，ALA具有除草、殺蟲(chóng)、增加植物抗逆性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等多種功能，并且易降解無(wú)殘留、對(duì)人畜無(wú)毒性，成為極具發(fā)展前途的無(wú)公害綠色農(nóng)用化學(xué)品。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，作為新一代光動(dòng)力學(xué)藥劑其具有毒性小，選擇性高等顯著優(yōu)點(diǎn)，被用來(lái)治療皮膚癌、膀胱癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等多種癌癥，在光化療領(lǐng)域正逐步展現(xiàn)其巨大的應(yīng)用性。基于ALA的功能和廣闊的應(yīng)用前景，其合成研究已經(jīng)引起廣泛的重視。
目前ALA的生產(chǎn)較多采用化學(xué)合成法，其步驟繁瑣、副產(chǎn)物多且產(chǎn)率低；而生物誘變法生產(chǎn)ALA，主要是優(yōu)化類(lèi)球紅細(xì)菌突變株，所報(bào)道ALA的最高產(chǎn)量為27mmol/L，但其培養(yǎng)周期長(zhǎng)，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是應(yīng)用上述構(gòu)建的工程菌實(shí)現(xiàn)一種工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高，對(duì)環(huán)境友好的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的方法。
本發(fā)明的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌，是含有放射形土壤桿菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，中文名為大腸埃希氏菌，拉丁文學(xué)名為Escherichia coli Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA，在中國(guó)專(zhuān)利局指定的保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.1938。
生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌的構(gòu)建方法，其步驟如下1)從保藏編號(hào)為CGMCC No.1332的工程菌中獲得重組子pET28a-A.R-hemA，所說(shuō)的CGMCC No.1332工程菌的中文名為大腸埃希氏菌，拉丁文學(xué)名為Escherichia coliBL21(DE3)-pET28a-A.R-hemA；
2)將重組子pET28a-A.R-hemA轉(zhuǎn)化至宿主菌Rosetta(DE3)(商業(yè)化菌株，從德國(guó)Novagen公司購(gòu)買(mǎi))中，得到工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA，其保藏編號(hào)為CGMCC No.1938。
本發(fā)明的應(yīng)用保藏編號(hào)為CGMCC No.1938工程菌生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的方法，包括以下步驟1)用接種針從保藏編號(hào)為CGMCC No.1938工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有30-40μg/ml卡那霉素和30-40μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基平板上劃線后，置于37℃烘箱中過(guò)夜培養(yǎng)；2)將平板上的單克隆接種于含30-50ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，轉(zhuǎn)速為200-220rmp，在37℃培養(yǎng)7-10h得到一級(jí)種子；3)取2ml-4ml一級(jí)種子接種于含100-150ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml的搖瓶中培養(yǎng)3-4h，得到二級(jí)種子；4)將100-150ml二級(jí)種子接種于含8-10L發(fā)酵培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，使罐上的初始菌液密度OD600為0.08-0.15，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為400-500rpm，空氣流量為3-4.5L/min，起始培養(yǎng)溫度為37℃，2h后降至27-29℃，再用0.050.2mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)；5)誘導(dǎo)培養(yǎng)4-8h后流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，在菌體密度OD600達(dá)到7-10時(shí)，分批補(bǔ)加葡萄糖作為5-氨基乙酰丙酸脫水酶的抑制劑；6)發(fā)酵培養(yǎng)初始pH采用10％-20％體積分?jǐn)?shù)的稀硫酸控制在5.8-6.0；誘導(dǎo)培養(yǎng)4-8h通過(guò)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基控制pH為6.1-6.3。
本發(fā)明生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸中，所說(shuō)的初始發(fā)酵培養(yǎng)基是由質(zhì)量體積比分別為1％-2％蛋白胨、0.5％-1％酵母粉、0.3％-0.6％琥珀酸、0.2％-0.4％甘氨酸和0.1％-0.5％葡萄糖組成，其pH值為6.0-6.3。所說(shuō)的補(bǔ)料培養(yǎng)基中含有50-70g琥珀酸和30-50g甘氨酸，體積為800-1000ml。所說(shuō)的5-氨基乙酰丙酸脫水酶的抑制劑為4-6g/L D-葡萄糖。
本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、可控性高、成本低、發(fā)酵過(guò)程對(duì)環(huán)境友好，所得的胞外ALA產(chǎn)量高，具有廣闊的工業(yè)化前景。


圖1是工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA誘導(dǎo)表達(dá)示意圖。
圖2胞外ALA濃度及菌體密度OD600與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系曲線。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1獲得的5-氨基乙酰丙酸工程菌，其構(gòu)建包括以下步驟1.重組質(zhì)粒pET28a-A.R-hemA的提取1)將保藏編號(hào)為CGMCC No.1332的工程菌接種到液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12hr，到細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即可收獲；2)取3ml細(xì)菌培養(yǎng)液(分2次，每次1.5ml)于Eppendorf管中，13,000rpm離心30s，棄上清液(盡可能完全)；3)加入100ul冰預(yù)冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L TrisCl(pH8.0)；10mmol/LEDTA(pH8.0)，可成批配制，蒸汽滅菌15min，貯存于4℃)，劇烈振蕩使細(xì)胞完全重懸，室溫下靜置5～10min；4)加入200ul新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH；1％SDS)，快速顛倒4次，輕輕混合以混勻內(nèi)容物，冰浴5min；5)加入150ul冰預(yù)冷的溶液III(5mol/L乙酸鉀60ml；冰乙酸11.5ml；水28.5ml；所配成的溶液終濃度鉀離子是3mol/L，乙酸根是5mol/L)，溫和振蕩10秒鐘使溶液III均勻地分散在細(xì)菌裂解物中，冰浴5～10min；6)13,000rpm離心5～10min，將上清液移入另一離心管中；7)加等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25/24/1)，振蕩混勻，13,000rpm離心5min，上清移入另一干凈離心管；8)先加入1/10體積3M NaAc，混勻，再加入2倍體積無(wú)水乙醇，顛倒混合，-20℃冰箱內(nèi)靜置10分鐘，沉淀DNA；9)13,000r/min離心5min；10)小心倒棄上清，將離心管倒置于濾紙上將剩余液體滴盡；11)用1ml70％乙醇洗滌DNA沉淀一次，13,000r/min離心5min獲得DNA沉淀；去上清，使液體流盡，在空氣中使沉淀干燥10分鐘；12)將沉淀溶解于50ul TE緩沖液(含RNase A 20ug/ml)，55℃下消化15min，即可獲得重組質(zhì)粒pET28a-A.R-hemA；儲(chǔ)存于-20℃冰箱內(nèi)備用。
2.將獲得的重組質(zhì)粒pET28a-A.R-hemA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)即可獲得工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA，其用IPTG誘導(dǎo)過(guò)量表達(dá)ALA合成酶如圖1所示。
實(shí)施例2用工程菌生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的方法，包括以下步驟
1.用接種針從保藏編號(hào)為CGMCC No.1938工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的甘油管中蘸取少量菌液，在含30μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基平板上劃線，于37℃烘箱中過(guò)夜培養(yǎng)；2.挑取單克隆接種于含50ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，轉(zhuǎn)速為200rmp，在37℃培養(yǎng)8h，得到一級(jí)種子；3.取2ml一級(jí)種子接種于含100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml的搖瓶中，在37℃，200rpm條件下培養(yǎng)3h，得到二級(jí)種子。其中初始發(fā)酵培養(yǎng)基是由質(zhì)量體積比分別為1％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.3％琥珀酸、0.2％甘氨酸和0.2％葡萄糖組成，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為5.9；4.將100ml二級(jí)種子接種于含9L上述發(fā)酵培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐中，使罐上的初始菌液密度OD600近似為0.1，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為400rmp，空氣流量為3L/min，起始培養(yǎng)溫度為37℃，2h后降至28℃，用0.05mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)；5.誘導(dǎo)培養(yǎng)4h流加含有63g琥珀酸和36g甘氨酸，體積為850ml的補(bǔ)料培養(yǎng)基，用菌體的密度監(jiān)測(cè)菌體生長(zhǎng)情況，當(dāng)菌體密度OD600達(dá)到7時(shí)，開(kāi)始每隔3h添加4g/L D-葡萄糖作為5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑，總共添加3次葡萄糖。
6.發(fā)酵培養(yǎng)初始pH采用10％-20％體積分?jǐn)?shù)的稀硫酸控制在5.9；誘導(dǎo)培養(yǎng)4h通過(guò)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基控制pH為6.2。采用Mauzerall和Granick的分析方法(參照Mauzerall D，Granick S.J.Bio.Chem.，1956，219435-442)測(cè)定ALA的濃度。由圖2可見(jiàn)胞外ALA的濃度22h時(shí)即可達(dá)到6.5g/L。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌，其特征在于此菌是含有放射形土壤桿菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，中文名為大腸埃希氏菌，拉丁文學(xué)名為Escherichia coli Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA，在中國(guó)專(zhuān)利局指定的保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.1938。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌的構(gòu)建方法，其步驟如下1)從保藏編號(hào)為CGMCC No.1332的工程菌中獲得重組子pET28a-A.R-hemA，所說(shuō)的CGMCC No.1332工程菌的中文名為大腸埃希氏菌，拉丁文學(xué)名為Escherichia coliBL21(DE3)-pET28a-A.R-hemA；2)將重組子pET28a-A.R-hemA轉(zhuǎn)化至宿主菌Rosetta(DE3)中，得到工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA，其保藏編號(hào)為CGMCC No.1938。
3.用權(quán)利要求1所述的工程菌生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征是包括以下步驟1)用接種針從保藏編號(hào)為CGMCC No.1938工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有30-40μg/ml卡那霉素和30-40μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基平板上劃線后，置于37℃烘箱中過(guò)夜培養(yǎng)；2)將平板上的單克隆接種于含30-50ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，轉(zhuǎn)速為200-220rmp，在37℃培養(yǎng)7-10h得到一級(jí)種子；3)取2ml-4ml一級(jí)種子接種于含100-150ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml的搖瓶中培養(yǎng)3-4h，得到二級(jí)種子；4)將100-150ml二級(jí)種子接種于含8-10L發(fā)酵培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，使罐上的初始菌液密度OD600為0.08-0.15，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為400-500rpm，空氣流量為3-4.5L/min，起始培養(yǎng)溫度為37℃，2h后降至27-29℃，再用0.05-0.2mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)；5)誘導(dǎo)培養(yǎng)4-8h后流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，在菌體密度OD600達(dá)到7-10時(shí)，分批補(bǔ)加葡萄糖作為5-氨基乙酰丙酸脫水酶的抑制劑；6)發(fā)酵培養(yǎng)初始pH采用10％-20％體積分?jǐn)?shù)的稀硫酸控制在5.8-6.0；誘導(dǎo)培養(yǎng)4-8h通過(guò)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基控制pH為6.1-6.3。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所說(shuō)的初始發(fā)酵培養(yǎng)基是由質(zhì)量體積比分別為1％-2％蛋白胨、0.5％-1％酵母粉、0.3％-0.6％琥珀酸、0.2％-0.4％甘氨酸和0.1％-0.5％葡萄糖組成，其pH值為6.0-6.3。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所說(shuō)的補(bǔ)料培養(yǎng)基中含有50-70g琥珀酸和30-50g甘氨酸，體積為800-1000ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所說(shuō)的5-氨基乙酰丙酸脫水酶的抑制劑為4-6g/L D-葡萄糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其構(gòu)建和應(yīng)用方法。該菌種是含有放射形土壤桿菌的5－氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，保藏編號(hào)為CGMCC No.1938。用上述工程菌生產(chǎn)5－氨基乙酰丙酸的方法，步驟包括用LB培養(yǎng)基平板活化獲得上述工程菌的單克隆，然后接種于搖瓶中培養(yǎng)，得到一級(jí)種子；再取一級(jí)種子接種于搖瓶中培養(yǎng)，得到二級(jí)種子；將二級(jí)種子接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，用異丙基－β－D－硫代半乳糖苷降溫誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)后進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)。本發(fā)明獲得的工程菌有較高ALA合成酶表達(dá)，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低，所得胞外ALA產(chǎn)量高，具有良好的工業(yè)化前景。
文檔編號(hào)C12N15/52GK101063105SQ200710068170
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日
發(fā)明者林建平, 傅維琦, 岑沛霖 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)