專利名稱：一種基于氧化/還原探針的抗體/抗原或dna雜化檢測裝置及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于氧化/還原探針的抗體/抗原或DNA雜化檢測裝置與方法。本發(fā)明的主要應(yīng)用領(lǐng)域包括生化、環(huán)保以及食品安全等。
背景技術(shù)：
免疫檢測技術(shù)是利用抗原和抗體之間的特異性反應(yīng)來對抗原或抗體進行定性或定量測定的快速檢測技術(shù)，其中包括酶免疫分析技術(shù)，熒光免疫測定技術(shù)，免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)，免疫磁珠技術(shù)等。但是，大多數(shù)的免疫傳感器還需要額外的帶標(biāo)記的抗體把抗原和抗體的結(jié)合轉(zhuǎn)化為可檢測的信號，這樣就增大了檢測的復(fù)雜度，因此很有必要開發(fā)無需標(biāo)記的免疫檢測傳感器。目前已經(jīng)開發(fā)出一些無需標(biāo)記的免疫傳感器，它們從原理上分可以分為石英晶體免疫傳感器，表面等離子體共振免疫傳感器和電化學(xué)免疫傳感器等。在這之中，電化學(xué)免疫傳感器由于結(jié)構(gòu)簡單，使用方便而引起了人們的極大重視。
無需標(biāo)記的電化學(xué)免疫傳感器的基本原理如下。在電極表面，先固定上抗體，然后放入溶液中。同時，在被測溶液中加入氧化/還原探針，如[Fe(CN)6]3-/4-作為探針(在這里，氧化/還原對其實就相當(dāng)于標(biāo)記，只不過這個標(biāo)記是直接添加在溶液中，而不需要固定在抗體上)。當(dāng)溶液中存在被測對象，例如大腸桿菌時，它就會和電極表面的抗體結(jié)合?？乖涂贵w都是一些生物電介質(zhì)，不導(dǎo)電，也就是說它們相當(dāng)于是電極表面的一層絕緣物質(zhì)，這樣就會阻礙氧化/還原對在電極表面的電化學(xué)反應(yīng)速度，從而達到檢測目的。這一檢測原理不僅可用于基于免疫法的致病菌檢測，也可以用于DNA的雜交、biotin-avidin結(jié)合等的檢測，因為這些檢測從原理上來講和抗原/抗體的反應(yīng)是一樣的，都是介電生物分子的結(jié)合。
傳統(tǒng)的電化學(xué)免疫傳感器主要通過測量工作電極(在本發(fā)明中相當(dāng)于產(chǎn)生電極)上在抗原/抗體反應(yīng)前后的電化學(xué)動力學(xué)參數(shù)，如電化學(xué)阻抗、氧化還原電流等的變化來實現(xiàn)抗原的檢測。但在測量時間、靈敏度等方面還存在一些問題，發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能提高靈敏度的基于氧化/還原探針的抗體/抗原或DNA雜化結(jié)合檢測裝置。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它包括參比電極、產(chǎn)生電極、收集電極以及對電極，所述產(chǎn)生電極和收集電極之間的距離小于等于100微米，在產(chǎn)生電極和收集電極表面固定有被測對象的抗體或單鏈的DNA分子，它還設(shè)有檢測收集電極上的電極動力學(xué)參數(shù)的雙電極恒電流電位儀。
由于采用本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明將生物材料的介電特性和產(chǎn)生電極/收集電極之間的耦合效應(yīng)結(jié)合起來，以[Fe(CN)6]3-/4-為例，二價的鐵離子首先在產(chǎn)生電極上被氧化，然后通過擴散到達收集電極上，再在收集電極上被還原。在產(chǎn)生電極和收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)都會受到生物反應(yīng)的影響，因此，在溶液中的生物反應(yīng)之后，收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)參數(shù)會有更大的變化，從而能夠進一步提高檢測靈敏度。在本發(fā)明的技術(shù)方案中，產(chǎn)生電極和收集電極之間的距離越小，其檢測靈敏度越高，只要保證產(chǎn)生電極和收集電極之間不接觸即可?？紤]工藝難度并綜合考慮靈敏度，產(chǎn)生電極和收集電極之間的距離在大于等于80納米至小于等于100微米之間，是比較經(jīng)濟并且保證測量結(jié)果高精度的選擇。
本發(fā)明另一個所要解決的技術(shù)問題是提供一種高靈敏度的基于氧化/還原探針的抗體/抗原或DNA雜化檢測裝置的檢測方法。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案，在生物反應(yīng)前后分別進行以下操作以參比電極為電位參考點，在產(chǎn)生電極上施加一氧化電壓，收集電極上施加一還原電壓，然后測量流經(jīng)收集電極上的電流；在上述操作結(jié)束后對比收集電極上的電流得到測量結(jié)果；或在生物反應(yīng)前后分別進行以下操作以參比電極為電位參考點，在產(chǎn)生電極上施加一還原電壓，收集電極上施加一氧化電壓，然后測量流經(jīng)收集電極上的電流；在上述操作結(jié)束后對比收集電極上的電流得到測量結(jié)果。
上述檢測方法還可以采用以下技術(shù)方案，以參比電極為電位參考點，在產(chǎn)生電極上施加一氧化電壓，收集電極上施加一還原電壓，然后再疊加一幅度較小的交流電壓，然后測量收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)阻抗；在上述操作結(jié)束后對比收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)阻抗得到測量結(jié)果；或在生物反應(yīng)前后分別進行以下操作以參比電極為電位參考點，在產(chǎn)生電極上施加一還原電壓，收集電極上施加一氧化電壓，然后再疊加一幅度較小的交流電壓，然后測量收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)阻抗；在上述操作結(jié)束后對比收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)阻抗得到測量結(jié)果。
本發(fā)明采用測量收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)參數(shù)的方法進行測量，參數(shù)變化范圍大，能獲得更高的檢測靈敏度。


圖1為本發(fā)明結(jié)構(gòu)的俯視示意圖。
圖2為本發(fā)明結(jié)構(gòu)的側(cè)視示意圖。
圖3為采用叉指電極實施方式的本發(fā)明結(jié)構(gòu)俯視示意圖。
具體實施例方式
實施例1大腸桿菌的檢測參照附圖1和2。本發(fā)明包括參比電極1、產(chǎn)生電極2、收集電極3以及對電極4，所述產(chǎn)生電極和收集電極之間的距離小于等于100微米，以及檢測收集電極上的電極動力學(xué)參數(shù)的雙電極恒電流電位儀8。附圖3為本發(fā)明采用叉指電極形式的實施示意圖，在圖中，參比電極、對電極的附圖標(biāo)號與圖1和2相同，產(chǎn)生電極的附圖標(biāo)號為6，收集電極的附圖標(biāo)號為7。
根據(jù)檢測對象的不同，若是抗原或致病菌檢測，在產(chǎn)生電極和收集電極表面固定有被測對象的抗體。
在這里，參比電極的作用主要是用來提供電壓基準(zhǔn)，對電極用來提供電極旁路，使得電流從對電極而不是從參比電極流過，以避免電流對參比電極的電壓的影響。產(chǎn)生電極和收集電極是本發(fā)明中起主要作用的電極。
本實施例用于對大腸桿菌的檢測。在本實施例中，產(chǎn)生電極6和收集電極7采用叉指電極的結(jié)構(gòu)(如圖3所示)，其目的主要是在保持產(chǎn)生電極和收集電極微小間距的前提下同時增大兩電極的工作面積。參比電極、產(chǎn)生電極，收集電極以及對電極都采用標(biāo)準(zhǔn)集成電路加工工藝，通過濺射或蒸鍍的方法在玻璃基底上形成，其中參比電極所采用的材料為銀，而產(chǎn)生電極，收集電極以及對電極所采用的材料為金。產(chǎn)生電極和收集電極的叉指寬度為10微米，叉指間的距離也為10微米。在電極表面通過常用的生物化學(xué)方法固定商品化的大腸桿菌抗體。在實際檢測中，首先將裝置浸入含有[Fe(CN)6]3-/4-的溶液中，一般控制[Fe(CN)6]3-/4-濃度小于100mM，本實施例[Fe(CN)6]3-/4-的濃度為10mM，以參比電極為基準(zhǔn)，在產(chǎn)生電極上施加0.4V電壓，而在收集電極上施加-0.2V電壓，分別測試加入含有大腸桿菌的被測溶液前后收集電極上流經(jīng)的電流，實現(xiàn)大腸桿菌的檢測。對生物反應(yīng)前后收集電極上的電流進行比較，當(dāng)溶液中不存在大腸桿菌時，在收集電極上測得電流為800微安，而當(dāng)溶液中大腸桿菌的濃度為107cfu/ml時，在收集電極上測得電流為300微安。而當(dāng)溶液中大腸桿菌的濃度為1010cfu/ml時，在收集電極上測得電流為50微安。
上述檢測方法也可以是以參比電極為電位參考點，在生物反應(yīng)前分別在產(chǎn)生電極上施加一還原電壓，收集電極上施加一氧化電壓，然后測量流經(jīng)收集電極上的電流；在生物反應(yīng)結(jié)束后再重復(fù)上述操作；在上述操作結(jié)束后對比收集電極上的電流得到測量結(jié)果。
實施例2大腸桿菌的檢測本實施例所提供的檢測裝置與實施例1相同。在檢測過程中首先將裝置浸入含有10mM[Fe(CN)6]3-/4-的溶液中，以參比電極為基準(zhǔn)，在產(chǎn)生電極上施加0.4V電壓，而在收集電極上施加-0.2V直流電壓疊加一幅度較小的交流電壓，一般，交流電壓小于10mV，本實施例的采用頻率從1Hz到1MHz幅值為10mV的正弦交流電壓，分別采用標(biāo)準(zhǔn)電化學(xué)阻抗法測試加入含有大腸桿菌的被測溶液前后收集電極上電化學(xué)反應(yīng)阻抗，對比實現(xiàn)大腸桿菌的檢測。對生物反應(yīng)前后收集電極上阻抗進行比較，當(dāng)溶液中不存在大腸桿菌時，在收集電極上測得電極阻抗為400歐姆，而當(dāng)溶液中大腸桿菌的濃度為107cfu/ml時，在收集電極上測得電極阻抗為900歐姆安。而當(dāng)溶液中大腸桿菌的濃度為1010cfu/ml時，在收集電極上測得電極阻抗為2000歐姆。
上述檢測方法也可以是以參比電極為電位參考點，在生物反應(yīng)前分別在產(chǎn)生電極上施加一還原電壓，收集電極上施加一氧化電壓，然后再疊加一幅度較小的交流電壓，然后測量收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)阻抗；在生物反應(yīng)結(jié)束后再重復(fù)上述操作；在上述操作結(jié)束后對比收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)阻抗得到測量結(jié)果。
實施例3DNA雜化的檢測本實施例的檢測裝置結(jié)構(gòu)和實施例一基本相同，只是在電極表面固定單鏈DNA而不是大腸桿菌抗體。在實際檢測中，首先將裝置浸入含有10mM[Fe(CN)6]3-/4-的溶液中，以參考電極為基準(zhǔn)，在產(chǎn)生電極上施加0.4V電壓，而在收集電極上施加-0.2V直流電壓，分別測試加入含有對應(yīng)DNA單鏈的被測溶液前后收集電極上電化學(xué)反應(yīng)阻抗，對反應(yīng)前后收集電極上阻抗進行比較，實現(xiàn)DNA雜化的檢測。
權(quán)利要求
1.一種基于氧化/還原探針的抗體/抗原或DNA雜化檢測裝置，其特征在于它包括參比電極、產(chǎn)生電極、收集電極以及對電極，所述產(chǎn)生電極和收集電極之間的距離小于等于100微米，在產(chǎn)生電極和收集電極表面固定有被測對象的抗體或單鏈的DNA分子，它還設(shè)有檢測收集電極上的電極動力學(xué)參數(shù)的雙電極恒電流電位儀。
2.基于氧化/還原探針的抗體/抗原或DNA雜化檢測裝置的檢測方法，其特征在于在生物反應(yīng)前后分別進行以下操作以參比電極為電位參考點，在產(chǎn)生電極上施加一氧化電壓，收集電極上施加一還原電壓，然后測量流經(jīng)收集電極上的電流；在上述操作結(jié)束后對比收集電極上的電流得到測量結(jié)果；或在生物反應(yīng)前后分別進行以下操作以參比電極為電位參考點，在產(chǎn)生電極上施加一還原電壓，收集電極上施加一氧化電壓，然后測量流經(jīng)收集電極上的電流；在上述操作結(jié)束后對比收集電極上的電流得到測量結(jié)果。
3.基于氧化/還原探針的抗體/抗原或DNA雜化檢測裝置的檢測方法，其特征在于在生物反應(yīng)前后分別進行以下操作以參比電極為電位參考點，在產(chǎn)生電極上施加一氧化電壓，收集電極上施加一還原電壓，然后再疊加一幅度較小的交流電壓，然后測量收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)阻抗；在上述操作結(jié)束后對比收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)阻抗得到測量結(jié)果；或在生物反應(yīng)前后分別進行以下操作以參比電極為電位參考點，在產(chǎn)生電極上施加一還原電壓，收集電極上施加一氧化電壓，然后再疊加一幅度較小的交流電壓，然后測量收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)阻抗；在上述操作結(jié)束后對比收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)阻抗得到測量結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于氧化/還原探針的抗體/抗原或DNA雜化結(jié)合檢測裝置。它包括參比電極、產(chǎn)生電極、收集電極以及對電極，所述產(chǎn)生電極和收集電極之間的距離小于等于100微米，在產(chǎn)生電極和收集電極表面固定有被測對象的抗體或單鏈的DNA分子，它還設(shè)有檢測收集電極上的電極動力學(xué)參數(shù)的雙電極恒電流電位儀。本發(fā)明所提供的檢測裝置能提高檢測靈敏度。本發(fā)明還提供了一種基于氧化/還原探針的抗體/抗原或DNA雜化檢測裝置的檢測方法。它通過測量和對比生物反應(yīng)前后收集電極上的電流或電化學(xué)反應(yīng)阻抗得到測量結(jié)果。本發(fā)明采用測量收集電極上的電化學(xué)反應(yīng)參數(shù)的方法進行測量，參數(shù)變化范圍大，能獲得更高的檢測靈敏度。
文檔編號C12Q1/68GK101059509SQ20071006851
公開日2007年10月24日 申請日期2007年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日
發(fā)明者吳堅 申請人:浙江大學(xué)