專利名稱：溶葡萄球菌酶的制備方法和其衍生物及衍生物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及溶葡萄球菌酶的制備方法和其衍生物及衍生物的制備方法。
背景技術(shù)：
葡萄球菌(Staphylococcus)是革蘭氏陽性球菌的一種，廣泛分布于自然界，如空氣、水、土壤、飼料和一些物品上，也存在于人和動物的體表、鼻咽部及腸道，絕大多數(shù)不致病，少數(shù)可引起人和動物致病，其中金黃色葡萄球菌致病力最強(qiáng)，常引起皮膚、組織及器官的化膿性炎癥，是燒傷創(chuàng)面感染、急性肝功能衰竭和血源性腎炎等疾病的主要病源菌。金黃色葡萄球菌還和G-膿毒病菌同時發(fā)生，協(xié)同作用，嚴(yán)重威脅患者的生命。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素還可污染食物而導(dǎo)致食物中毒。醫(yī)院的醫(yī)師和護(hù)士中鼻腔帶菌達(dá)到80～100％，而且常為耐藥菌株，是醫(yī)院感染的重要因素。
1940年，青霉素G的發(fā)現(xiàn)和使用有效的控制了金黃色葡萄球菌的感染，90％的金葡菌對青霉素敏感。1944年，英國發(fā)現(xiàn)了耐青霉素的金葡菌。隨著β-類酰胺類抗生素在臨床的廣泛使用，耐藥菌比例不斷增加。耐藥菌通過產(chǎn)生β-類酰胺酶分解抗生素表現(xiàn)出耐藥性。1960年，甲氧西林研制成功，因其對青霉素酶穩(wěn)定而在臨床上對耐青霉素金葡菌表現(xiàn)出良好的治療效果。但隨著新型抗生素的使用，耐甲氧西林金葡菌(MRSA)比例不斷增加，目前金黃色葡萄球菌占所有革蘭氏陽性球菌感染的第一位。金黃色葡萄球菌中耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌占75％。
萬古霉素是治療MRSA的首選藥物，然而1997年日本就分離出第一株對萬古霉素中度耐藥的金黃色葡萄球菌，萬古霉素對其最小抑菌濃度為8mg/L。2002年，美國首次報道了萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌，萬古霉素對其最小抑菌濃度為32mg/L。萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)使細(xì)菌感染再次成為非常棘手的臨床問題，2003年美國CDC制定了“VRSA/VISA檢測和控制指南”，2005年NCCLS藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中增加了萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌檢測方法，要求各實(shí)驗(yàn)室開展對萬古霉素耐藥菌的監(jiān)測。
面對金葡菌對傳統(tǒng)抗菌藥物耐藥狀況日益嚴(yán)重的情況，開發(fā)新型抗菌制劑顯得尤為迫切。溶葡萄球菌酶作為葡萄球菌細(xì)胞壁裂解酶引起了人們的重視。1964年，Schindler和Schuhardt首次從一株編號為NRRL B-2628的模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)并分離了溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)。該酶為246個氨基酸組成的單鏈分子，分子量27kDa，鋅為必須的輔助因子。氨基酸組成中缺少半胱氨酸，堿性氨基酸的比例較高，等電點(diǎn)在10.4～11.4之間。溶葡萄球菌酶能特異性地水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖交聯(lián)結(jié)構(gòu)甘氨酸五肽橋聯(lián)中第二位和第三位甘氨酸形成的肽鍵，因此具有破壁溶菌作用。由于甘氨酸五肽橋聯(lián)結(jié)構(gòu)僅大量存在于葡萄球菌細(xì)胞壁，其中又以金葡菌細(xì)胞壁分布最廣，因此溶葡萄球菌酶主要對葡萄球菌尤其是金葡菌具有溶菌殺菌作用。
早期獲得溶葡萄球菌酶的主要手段是從模仿葡萄球菌培養(yǎng)物中分離提取((Schindler C.A.et al(1965)″Purification and properties of lysostaphina lyticagent for the Staphylococcus aureus.″Biochem.Biophys.Acta.97242-250；IversonO.J.et al(1973)″Studies on lysostaphin，separation and characterization of threeenzymes.″Eur.J.Biochem.38293-300；Valisena S.，F(xiàn).E.et al(1982)″Purificationand Characterization of three separate bacteriolytic enzymes excreted by S.aureus，S.simulans and S.saprophyticus.″J.Bact.151636-647；Sugai M.，T.et al(1990)″Rapid purification of lysostaphin for analysis of cell-wall proteins.″J.Microb.Meth.12133-138；Marova I.et al(1993)″Modified simplified method for isolation oflysostaphin from the culture filtrate of Staphylococus staphylolyticus.″FoliaMicrobiol.38245-252)，產(chǎn)物純度不高而且不均一，容易被熱源和過敏原污染?；蚬こ毯偷鞍踪|(zhì)分離純化技術(shù)的發(fā)展為大量制備高純度的溶葡萄球菌酶開辟了新的途徑。1987年，Heath，L.S.等表達(dá)了溶葡萄球菌酶基因(″Cloning of thelysostaphin gene of S.simulans biovar staphylolyticus.″Abstr.Ann.Meet.Am.Soc.Microb.H58p 149；″Plasmid encoded lysostaphin endopeptidase gene of S.simulansbiovar staphylolyticus.″FEMS Microb.Lett.44129-133)，Recsei P.A.等克隆了完整基因(″Cloning，sequence，and expression of the lysostaphin gene fromStaphylococcus simulans.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 841127-1131，1987)，Heinrich P.，R.等(″The molecular organization of the lysostaphin gene and itssequences repeated in tandem.″Mol.Gen.Genet.209563-569，1987)和美國專利U.S.Pat.No.4,931,390報道和公開了完整的基因序列。目前溶葡萄球菌酶已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、球形芽孢桿菌等多種工程菌中的重組表達(dá)。重組產(chǎn)品的產(chǎn)量和純度均有很大的提高，其理化性質(zhì)、酶活性等和天然酶沒有本質(zhì)區(qū)別，為臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
Dajes等動物試驗(yàn)研究表明重組溶葡萄球菌酶的局部有效治療劑量眼部0.28％，Kokai-kun等鼻腔使用劑量0.5％，Patron等對動物全身給藥的劑量為5mg/kg，每日3次，因此有效的溶葡萄球菌酶治療劑量是很高的，因此構(gòu)建高效表達(dá)菌株，開發(fā)大規(guī)模的工業(yè)化制備技術(shù)對此酶的臨床應(yīng)用十分重要。
1990年印度生物技術(shù)國際有限公司申請了國際專利WO01/29201“Expression of recombinant mature lysostaphin”，該方法直接表達(dá)溶葡萄球菌酶成熟肽基因，表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)以可溶形式表達(dá)，表達(dá)量為20.2％，蛋白回收率8.9mg/L。中國專利CN190290A公開了一種大腸桿菌高效外分泌表達(dá)溶葡萄球菌酶的方法，該方法用3升培養(yǎng)液經(jīng)過分離純化得到溶葡萄球菌酶83mg，回收率27.7mg/L。以上專利的方法生產(chǎn)溶葡萄球菌酶都存在表達(dá)量低，收率低的問題。
另外，溶葡萄球菌酶作為異源蛋白質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)的主要不良反應(yīng)是產(chǎn)生免疫反應(yīng)，引起過敏反應(yīng)。動物藥代動力學(xué)研究表明該酶進(jìn)入體內(nèi)1小時95％的酶已經(jīng)降解。聚乙二醇(PEG)修飾技術(shù)的應(yīng)用使聚乙二醇(PEG)的許多優(yōu)良特性轉(zhuǎn)移到修飾蛋白中去。當(dāng)聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)到蛋白質(zhì)分子表面時，可減少蛋白質(zhì)藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中很快消除，并使蛋白質(zhì)藥物不易被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞識別。PEG類修飾劑的藥物動力學(xué)性質(zhì)也發(fā)生很大改變，半衰期延長。2003年Walsh等報道了溶葡萄球菌酶的PEG修飾，采用了分支PEG，PEG化溶葡萄球菌酶半衰期延長到24小時。該方法的主要問題是分支PEG成本很高，不適合產(chǎn)業(yè)化的要求。
現(xiàn)有技術(shù)表達(dá)溶葡萄球菌酶產(chǎn)量無法滿足大規(guī)模制備的要求，PEG修飾的成本很高，因此有必要開發(fā)適合大量制備溶葡萄球菌酶的方法及低成本的修飾技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)量高，收率高，適合大規(guī)模制備的溶葡萄球菌酶的制備方法。
本發(fā)明的另外一個目的在于提供一種低成本的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶。
本發(fā)明還有一個目的是提供上述的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶的制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用的溶葡萄球菌酶的制備方法，包括以下的步驟(1)、溶葡萄球菌酶基因的獲得；(2)、表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌將溶葡萄球菌酶基因片段插入到表達(dá)載體質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)，然后直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，其中所述的表達(dá)載體質(zhì)粒是pET系列載體質(zhì)粒；(3)、陽性克隆的篩選、培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)篩選出陽性克隆在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)誘導(dǎo)使目標(biāo)蛋白表達(dá)；(4)、表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化首先將大腸桿菌工程菌菌體收集、破菌，經(jīng)離心得到破菌液上清，然后對破菌液上清用層析技術(shù)純化。
上述的溶葡萄球菌酶cDNA序列是已知的，編碼一個全長246個氨基酸的蛋白質(zhì)。溶葡萄球菌酶的編碼序列可以來源于基因文庫，或根據(jù)文獻(xiàn)報道的溶葡萄球菌酶cDNA序列全基因合成，還可以設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增獲得。
作為優(yōu)選，上述的溶葡萄球菌酶基因序列如SEQ ID NO.1所述。這里是根據(jù)大腸桿菌高效表達(dá)的需要優(yōu)化設(shè)計溶葡萄球菌酶基因序列。
作為優(yōu)選，上述的pET系列載體質(zhì)粒是pET-11b、pET-22b、pET-15b、pET-19b、pET-30a-c和pET-32a-c中的一種或多種。
作為優(yōu)選，上的步驟(2)酶切位點(diǎn)是Nde I/BamH I或Nco I/BamH I位點(diǎn)。
作為優(yōu)選，上的步驟(3)中陽性克隆篩選是用氨芐青霉素做抗性篩選。
作為優(yōu)選，上述的步驟(3)中培養(yǎng)的溫度控制在28℃～40℃。再優(yōu)選的培養(yǎng)的溫度控制在30℃～35℃。
作為優(yōu)選，上述的步驟(3)中誘導(dǎo)表達(dá)使用濃度為0.1～1.5mmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑。再優(yōu)選的誘導(dǎo)表達(dá)使用濃度為0.4～1.0mmol/L。
作為優(yōu)選，上述的步驟(3)中誘導(dǎo)的溫度控制在20℃～40℃。再優(yōu)選的培養(yǎng)的溫度控制在25℃～30℃。
作為優(yōu)選，上述的步驟(4)中層析技術(shù)是離子交換層析、分子篩層析、疏水層析和親和層析中的一種或多種方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明的聚乙二醇修飾的溶葡萄球菌酶由溶葡萄球菌酶與聚乙二醇采用單點(diǎn)或多點(diǎn)修飾構(gòu)成。
作為優(yōu)選，上述的聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇。作為再優(yōu)選，上述的單甲氧基聚乙二醇選自單甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇醛中的一種或多種。作為最優(yōu)選，上述的單甲氧基聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇醛。
作為優(yōu)選，上述的聚乙二醇的分子量為5kDa～100kDa。再優(yōu)選的分子量為5kDa～40kDa。最優(yōu)選的分子量為20kDa～40kDa。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個目的，本發(fā)明的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶的制備方法，包括了上述實(shí)現(xiàn)第一個目的的溶葡萄球菌酶的制備步驟和純化后的溶葡萄球菌酶聚乙二醇修飾步驟。
上述的聚乙二醇修飾反應(yīng)的條件為配制修飾反應(yīng)緩沖液，離子強(qiáng)度為5～500mmol/L，pH值為4～8；時間8～24小時，反應(yīng)溫度4～25℃。
作為優(yōu)選，上述的聚乙二醇與溶葡萄球菌酶發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的重量比例為0.5～20。再優(yōu)選的重量比例為2～10。
作為優(yōu)選，上述的聚乙二醇與溶葡萄球菌酶發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的緩沖液的pH值為3～8。再優(yōu)選的pH值為5～7。
作為優(yōu)選，上述的聚乙二醇與溶葡萄球菌酶發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的溫度為4℃～37℃。再優(yōu)選的溫度為4℃～25℃。
作為優(yōu)選，上述的聚乙二醇與溶葡萄球菌酶發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的時間為4～48小時。再優(yōu)選的時間為16～24小時。
本發(fā)明的溶葡萄球菌酶的制備方法，其表達(dá)方案簡單，表達(dá)量高，達(dá)到30％以上，純化工藝簡單，收率高，表達(dá)產(chǎn)物可溶，不需要復(fù)性，直接用層析方法進(jìn)行純化，純化收率大大提高，純化收率達(dá)到1～3g/L，適合大規(guī)模制備。
本發(fā)明聚乙二醇修飾的溶葡萄球菌酶由溶葡萄球菌酶與聚乙二醇采用單點(diǎn)或多點(diǎn)修飾構(gòu)成，聚乙二醇修飾的溶葡萄球菌酶免疫原性降低，半衰期延長，適合臨床應(yīng)用于葡萄球菌感染的治療，且修飾的成本低。


圖1目標(biāo)蛋白的表達(dá)分析M蛋白分子量，從上而下97.4、66.2、43、30、20.1、14.4kd；1～3誘導(dǎo)菌體全蛋白；4未誘導(dǎo)菌體。
圖2陽離子交換層析圖譜。
圖3疏水層析圖譜。
圖4純化產(chǎn)物的電泳分析1～3純化中間體；4純化Lysostaphin；M蛋白分子量，從上而下97.4、66.2、43、30、20.1、14.4kd。
圖5純化產(chǎn)物的RP-HPLC分析結(jié)果。
圖6聚乙二醇修飾的Lysostaphin電泳分析1～3未修飾的Lysostaphin；4聚乙二醇化Lysostaphin；
M蛋白分子量，從上而下97.4、66.2、43、30、20.1、14.4kd。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1溶葡萄球菌酶基因的合成、克隆和表達(dá)表達(dá)載體采用pET-22b(Invitrogen)，宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
根據(jù)Genebank公布的Staphylococcus simulans的Lysostaphin基因序列(AX828346)及專利WO03074689的溶葡萄球菌酶基因序列，根據(jù)大腸桿菌高效表達(dá)的需要優(yōu)化設(shè)計溶葡萄球菌酶基因序列，見SEQ ID NO.1，基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列見SEQ ID NO.2。合成20段互補(bǔ)的寡核苷酸，并在5’端和3’端分別引如酶切位點(diǎn)Nde I、BamH I，按分子克隆的常規(guī)方法，首先用T4噬菌體多核苷酸激酶37℃處理30min，磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩爾混合，94℃變性5min，立即65℃退火10min，然后加入T4連接酶，16℃連接過夜。取連接產(chǎn)物用下述引物進(jìn)行擴(kuò)增引物15‘--TATACATATGGCTGCAACACATGAACA引物23‘-TCTGGATCCTCAGTTACTTTATAGTTCCCCAAA擴(kuò)增條件95℃、30s；55℃、30s；70℃、60s，循環(huán)次數(shù)30次。最后70℃保溫延伸10min。用Nde I和BamH I消化所述的溶葡萄球菌酶的PCR產(chǎn)物。
pET-22b質(zhì)粒用Nde I、BamH I雙酶切回收大片段，與合成的溶葡萄球菌酶基因片段連接，20μL反應(yīng)體系基因片段與載體大片段的比例為10∶1，加T4 DNA連接酶300單位，15℃連接過夜，取10μL連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)過夜，獲得工程菌經(jīng)進(jìn)一步篩選。氨芐青霉素做抗性篩選，得到陽性克隆。提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定。陽性轉(zhuǎn)化子用通用引物進(jìn)行序列分析，結(jié)果克隆序列與設(shè)計序列完全一致。
接種陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，結(jié)果見圖1。
實(shí)施例2、不同培養(yǎng)條件對表達(dá)的影響采用培養(yǎng)基(0.5％Yeast Extract，1.0％Peptone，0.5％NaCl，0.05mg/L Amp，pH7.4)研究了不同溫度條件誘導(dǎo)對產(chǎn)物表達(dá)狀態(tài)的影響。接種量5％(種子液體積占培養(yǎng)基體積的比例)，誘導(dǎo)前培養(yǎng)溫度37℃，采用IPTG誘導(dǎo)，劑量1mmol/L。培養(yǎng)后4個溫度進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果見下表。

總結(jié)加誘導(dǎo)劑后25℃培養(yǎng)4小時，表達(dá)量可以達(dá)到30％，而且目標(biāo)蛋白主要表達(dá)在破菌上清中，如果延長表達(dá)時間，如表達(dá)8小時，則目標(biāo)蛋白超過80％在破菌后的沉淀中，因此優(yōu)選的條件是37℃培養(yǎng)后，25℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時，目標(biāo)蛋白主要在破菌后上清中，有利于分離純化。
實(shí)施例3表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化用菌體破碎緩沖液(40mM Tris-Cl，02M NaCl，0.5mM EDTA，pH8.0)按照20ml/g的比例懸浮濕菌體。超聲波法破碎菌體(220V，20khz，900W，冰水浴條件下超聲破碎)。
將破菌液用高速離心進(jìn)行離心(10000g，30min，4℃)，去掉沉淀，收集上清。收集到的破菌上清液用離子交換層析法分離純化，其過程為用pH值為8.5的20mmol/L Tris.CL緩沖液稀釋，使其電導(dǎo)率小于5mS/cm。用同樣的緩沖液平衡層析柱(50mm×10cm)，層析凝膠可選用CM-Sepharose Fast Flow、SP-Sepharose Fast Flow、Mono-S(Amersham Pharmacia)。上樣后用平衡緩沖液洗至基線，用緩沖液(0.01～0.5mol/L NaCL，20mM Tris-Cl，pH8.0)進(jìn)行梯度洗脫，當(dāng)NaCL濃度達(dá)到30％時出現(xiàn)目標(biāo)蛋白，收集目標(biāo)蛋白峰，層析圖譜見圖2。洗脫出來的蛋白樣品純度在85-90％。將離子交換目標(biāo)蛋白峰補(bǔ)加(NH4)2SO4使終濃度為0.6～0.8mol/L，疏水層析柱(XK26/20)用緩沖體系A(chǔ)(20mM Tris-Cl，pH8.5，0.6M(NH4)2SO4)平衡，疏水凝膠可選用Phenyl-Sepharose Fast Flow、Phenyl-Sepharose High Perforance及Butyl-Sepharose Fast Flow，流速10ml/min，上樣后用緩沖液B(20mM Tris-Cl；pH8.5)通過降低鹽濃度梯度洗拖，收集目標(biāo)蛋白峰，疏水層析圖譜見圖3。目標(biāo)蛋白電泳純度95％，分析結(jié)果見圖4。
得到的疏水層析峰經(jīng)Sephadex G-25脫鹽，平衡液為20mmol/L PB，pH7.4。樣品脫鹽后即為精細(xì)純化的溶葡萄球菌酶。
實(shí)施例4純化產(chǎn)物的酶活性分析酶活性分析采用比濁法，參照Piotr Szweda等的方法(Cloning，Expression，and Purification of the Staphylococcus simulans Lysostaphin Using theIntein-Chitin-Binding Domain(CBD)System(Protein)，受試菌為金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus。活化的金黃色葡萄球菌在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD620nm為0.25，加入適量純化溶葡萄球菌酶(10μL，約1μg)，37℃保溫10min后測定OD620nm的吸收值。酶活性單位定義為pH7.5條件下37℃保溫10min，將6ml金黃色葡萄球菌懸液OD620nm為0.25降至0.125所需的酶量為1個的單位。本發(fā)明的溶葡萄球菌酶比活性達(dá)到412U/mg。
實(shí)施例5純化產(chǎn)物的純度分析純化溶葡萄球菌酶的純度采用RP-HPLC方法進(jìn)一步進(jìn)行分析，分析柱為Alltech公司Vydac 214TP5415，150mm×4.6mm，5μm，流動相A0.1％TFA，ACN-H2O(5∶95)；流動相B0.1％TFA，ACN-H2O(95∶5)，流速0.8ml/min，檢測波長214nm，分析方法見下表

樣品純度達(dá)到99％，分析結(jié)果見圖5。
實(shí)施例6溶葡萄球菌酶的聚乙二醇修飾將純化的溶葡萄球菌酶(LSS)溶于pH8.0、100mM的磷酸鹽緩沖液中，按溶葡萄球菌酶單甲氧基聚乙二醇醛＝1∶5(w/w)的比例加入溶解后，加入NaCNBH3使其終濃度為8mM，冰箱2～8℃反應(yīng)16～24小時。修飾反應(yīng)結(jié)束后采用分子篩柱(Sephacryl-200)去除未修飾的LSS以及游離的聚乙二醇。以pH8.0、20mM PB為洗脫液，流速5ml/min，收集第一個蛋白峰為修飾蛋白峰，電泳分析結(jié)果見圖6。
序列表<110>杭州北斗生物技術(shù)有限公司<120>一種溶葡萄球菌酶及其衍生物的制備方法<160>2<210>1<211>757<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(741)<220>
<221>misc_feature<223>Lysostaphin編碼序列<400>1ATGGCTGCAA CACATGAACA TTCAGCACAA TGGTTGAATA ATTACAAAAA50AGGATATGGT TACGGTCCTT ATCCATTAGG TATAAATGGC GGTATGCACT 100ACGGAGTTGA TTTTTTTATG AATATTGGAA CACCAGTAAA AGCTATTTCA 150AGCGGAAAAA TAGTTGAAGC TGGTTGGAGT AATTACGGAG GAGGTAATCA 200AATAGGTCTT ATTGAAAATG ATGGAGTGCA TAGACAATGG TATATGCATC 250TAAGTAAATA TAATGTTAAA GTAGGAGATT ATGTCAAAGC TGGTCAAATA 300ATCGGTTGGT CTGGAAGCAC TGGTTATTCT ACAGCACCAC ATTTACACTT 350CCAAAGAATG GTTAATTCAT TTTCAAATTC AACTGCCCAA GATCCAATGC 400CTTTCTTAAA GAGCGCAGGA TATGGAAAAG CAGGTGGTAC AGTAACTCCA 450ACGCCGAATA CAGGTTGGAA AACAAACAAA TATGGCACAC TATATAAATC 500AGAGTCAGCT AGCTTCACAC CTAATACAGA TATAATAACA AGAACGACTG 550GTCCATTTAG AAGCATGCCG CAGTCAGGAG TCTTAAAAGC AGGTCAAACA 600ATTCATTATG ATGAAGTGAT GAAACAAGAC GGTCATGTTT GGGTAGGTTA 650TACAGGTAAC AGTGGCCAAC GTATTTACTT GCCTGTAAGA ACATGGAATA 700AATCTACTAA TACTTTAGGT GTTCTTTGGG GAACTATAAA GTAACTGAGG 750ATCCAGA 757
<210>2<211>247<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia Coli)<400>2Met Ala Ala The His Glu His Ser Ala Gln Trp Leu Asn Asn Tyr Lys Lys Gly Tyr Gly1 5 10 15 20Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu Gly Ile Asn Gly Gly Met His Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met25 30 35 40Asn Ile Gly The Pro Val Lys Ala Ile Ser Ser Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly Trp Ser45 50 55 60Asn Tyr Gly Gly Gly Asn Gln Ile Gly Leu Ile Glu Asn Asp Gly Val His Arg Gln Trp65 70 75 80Tyr Met His Leu Ser Lys Tyr Asn Val Lys Val Gly Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gln Ile85 90 95 100Ile Gly Trp Ser Gly Ser The Gly Tyr Ser The Ala Pro His Leu His Phe Gln Arg Met105 110 115 120Val Asn Ser Phe Ser Asn Ser The Ala Gln Asp Pro Met Pro Phe Leu Lys Ser Ala Gly125 130 135 140Tyr Gly Lys Ala Gly Gly The Val The Pro The Pro Asn The Gly Trp Lys The Asn Lys145 150 155 160Tyr Gly The Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Ser Phe The Pro Asn The Asp Ile Ile The165 170 175 180Arg The The Gly Pro Phe Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly Val Leu Lys Ala Gly Gln The185 190 195 200Ile His Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr The Gly Asn205 210 215 220Ser Gly Gln Arg Ile Tyr Leu Pro Val Arg The Trp Asn Lys Ser The Asn The Leu Gly225 230 235 240Val Leu Trp Gly The Ile Lys24權(quán)利要求
1.溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于包括以下的步驟(1)、溶葡萄球菌酶基因的設(shè)計與合成；(2)、表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌將溶葡萄球菌酶基因片段插入到表達(dá)載體質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)，然后直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，其中所述的表達(dá)載體質(zhì)粒是pET系列載體質(zhì)粒；(3)、陽性克隆的篩選、培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)篩選出陽性克隆在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)誘導(dǎo)使目標(biāo)蛋白表達(dá)；(4)、表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化將大腸桿菌工程菌菌體收集、破菌，經(jīng)離心得到破菌液上清，然后對破菌液上清用層析技術(shù)純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于溶葡萄球菌酶基因的獲得是通過全基因合成或通過設(shè)計引物，再PCR獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于溶葡萄球菌酶基因序列如SEQ ID NO.1所述。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于pET系列載體質(zhì)粒是pET-11b、pET-22b、pET-15b、pET-19b、pET-30a-c和pET-32a-c中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于步驟(3)中培養(yǎng)的溫度控制在28℃～40℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于步驟(3)中誘導(dǎo)溫度控制在20℃-37℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于步驟(4)中層析技術(shù)是離子交換層析、分子篩層析、疏水層析和親和層析中的一種或多種方法。
8.聚乙二醇修飾的溶葡萄球菌酶，其特征在于由溶葡萄球菌酶與聚乙二醇采用單點(diǎn)或多點(diǎn)修飾構(gòu)成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶，其特征在于所述的聚乙二醇選自單甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯和單甲氧基聚乙二醇醛中的一種或多種。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶，其特征在于聚乙二醇的分子量為5kDa～100kDa。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于包括如權(quán)利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制備步驟和純化后的溶葡萄球菌酶聚乙二醇修飾步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于聚乙二醇與溶葡萄球菌酶發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的重量比例為0.5～20。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的聚乙二醇修飾溶葡萄球菌酶的制備方法，其特征在于聚乙二醇與溶葡萄球菌酶發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)的緩沖液的pH值為4～8，反應(yīng)的溫度為2℃～37℃，反應(yīng)的時間為4～48小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及溶葡萄球菌酶的制備方法和其衍生物及衍生物的制備方法。溶葡萄球菌酶的制備方法主要包括設(shè)計并合成優(yōu)化的溶葡萄球菌酶基因，構(gòu)建表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌，篩選高表達(dá)菌株，發(fā)酵培養(yǎng)工程菌，表達(dá)產(chǎn)物分離純化。其中所述的表達(dá)載體質(zhì)粒是pET系列載體質(zhì)粒。本發(fā)明的方法，表達(dá)方案簡單，表達(dá)量高，純化工藝簡單，收率高，表達(dá)產(chǎn)物可溶，不需要復(fù)性，直接用層析方法進(jìn)行純化，純化收率大大提高，適合大規(guī)模制備。本發(fā)明公開的溶葡萄球菌酶衍生物由PEG修飾后免疫原性降低，半衰期延長，適合臨床應(yīng)用于葡萄球菌感染的治療。
文檔編號C12N15/56GK101092618SQ20071006872
公開日2007年12月26日 申請日期2007年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月22日
發(fā)明者劉國安, 劉沐榮, 康經(jīng)武 申請人:杭州北斗生物技術(shù)有限公司