專利名稱：：戊型肝炎病毒熒光定量pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是一種涉及生物工程領(lǐng)域的檢測方法，特別是用于定量檢測臨床標(biāo)本中戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
：戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(hepatitisEvims,HEV)引起的一種急性、自限性疾病。病毒主要通過糞-口途徑傳播，廣泛流行于發(fā)展中國家，主要侵犯青壯年，孕婦感染后死亡率可達(dá)20%以上，構(gòu)成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。我國為戊型肝炎的高發(fā)區(qū)，控制該病刻不容緩。目前，對戊型肝炎的診斷除臨床癥狀外，通常采用ELISA法檢測血清中抗HEV-IgG抗體。但是，目前ELISA檢測靈敏度及特異性較低，漏檢率高，給戊型肝炎的診治帶來困難。而實時熒光定量PCR作為一種新的技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病診斷，因此迫切需要建立一種靈敏、穩(wěn)定、特異性強的熒光定量PCR方法，用于戊型肝炎的臨床診斷及HEV定量檢測。建立該方法將為戊型肝炎的早期診斷，病程中糞便和血清中病毒載量的消長規(guī)律、抗病毒藥物篩選、感染動物模型的研究提供方法；為戊肝的抗病毒治療效果的評價提供技術(shù)平臺；為戊型肝炎的流行病學(xué)監(jiān)測、致病機理的研究提供技術(shù)支持；還可用于監(jiān)測戊型肝炎流行區(qū)水體的HEV污染狀況，以及食品及生物制品的HEV檢測，進一步提高我國的戊型肝炎防治水平。熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、無污染、實時和準(zhǔn)確等特點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原體檢測、單核苷酸多態(tài)性(SNP)測定及突變分析、基因表達(dá)分析、腫瘤基因檢測等方面的研究。在病毒檢測方面，它不僅能對病毒定性，更能快速、準(zhǔn)確地定量病毒核酸，使研究病毒負(fù)荷和疾病進展的關(guān)系成為可能，從而可以動態(tài)地研究在整個病程中病毒載量的消長規(guī)律，并可對抗病毒治療的效果和耐藥變異毒株的出現(xiàn)作出評估，為抗病毒藥物的篩選以及研究工作提供有效的技術(shù)平臺。目前，在國內(nèi)外熒光定量PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于疾病的臨床診斷，定量檢測乙型肝炎病毒、艾滋病病毒、巨細(xì)胞病毒、結(jié)核桿菌等各種病原體的商品化試劑盒己經(jīng)面世，但是尚無HEV熒光定量PCR試劑盒問世。戊型肝炎的實驗室診斷常用酶聯(lián)免疫法檢測血清抗HEV-IgG和IgM，逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測糞便和血清中病毒RNA。但是，ELISA檢測戊型肝炎特異性抗體的敏感度有限，而且所用抗原不盡相同，導(dǎo)致檢出率差異較大，隨著人們發(fā)現(xiàn)的HEV基因型的日益增多，需要合成更多的抗原檢測試劑，以降低漏檢率。而由于臨床樣本中的病毒含量非常低，常規(guī)RT-PCR方法靈敏度不夠，易產(chǎn)生漏檢。本發(fā)明采用絕對定量技術(shù)，建立靈敏、穩(wěn)定、特異性強的熒光定量PCR檢測HEV的方法，適用于戊型肝炎的臨床診斷。熒光PCR定量檢測HEV方法的建立，將給戊型肝炎的診斷技術(shù)帶來巨大飛躍；為抗病毒藥物篩選、感染動物模型、患者發(fā)病過程中糞便和血清中病毒載量消長規(guī)律等方面的研究提供方法；為戊肝的抗病毒治療效果的評價提供技術(shù)平臺；為戊型肝炎的流行病學(xué)監(jiān)測、致病機理的研究提供技術(shù)支持；還可用于監(jiān)測戊型肝炎流行區(qū)水體的HEV污染狀況，以及食品及生物制品的HEV檢測，進一步提高我國的戊型肝炎防治水平。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種HEV病毒的熒光定量PCR檢測方法。該方法的檢測靈敏度可達(dá)10°數(shù)量級，較傳統(tǒng)的RT-PCR和RT-nPCR方法具有更高的靈敏度，且操作簡便，可進行大批量的樣本分析，并對HEV進行定量，從而為戊型肝炎病毒的檢測和監(jiān)控提供有效方法。本發(fā)明通過對Genbank中HEV全序列進行生物信息學(xué)分析，選取HEVORJF2基因的保守區(qū)段為耙目標(biāo)，應(yīng)用primerexpress軟件和primerpremier5.0軟件，設(shè)計一對PCR引物和Taqman探針。本發(fā)明所述的HEV特異性定量檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標(biāo)片段長度為151bp。引物和探針序列為上游引物HEV-1(+):GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT;下游引物HEV-2(—)AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG;Taqman探針序列5，-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3，。本發(fā)明包括如下步驟1.通過生物信息學(xué)分析，選擇HEVORF2基因的保守片段為耙目標(biāo)，其基因片段的擴增目標(biāo)核苷酸序列為GAATGCTCAGCAGGATMGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCT;2.應(yīng)用primerexpress軟4牛禾卩primerpremier5.0軟牛，設(shè)計一)(寸病毒牛寺異性定量PCR引物和Taqman探針設(shè)計。探針5'端的熒光報告基團是FAM，3，端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMRA。上游引物HEV-1(+):GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT;下游引物HEV-2(—):AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG;Taqman探針序列5，-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3，3.構(gòu)建和制備質(zhì)粒定量標(biāo)準(zhǔn)品pET28a-ORF2。根據(jù)確定的PCR引物，利用DNA重組技術(shù)將包含目的擴增片段的基因克隆到質(zhì)粒載體pET-28a中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-ORF2作為檢測HEV滴度的定量標(biāo)準(zhǔn)品。4.樣本中戊型肝炎病毒的分離濃縮，及其病毒RNA的提取樣本用聚乙二醇(PEG)和氯化鈉(NaCl)進行濃縮，以提高檢測的靈敏度。5.對提取的樣本RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得樣本cDNA6.戊型肝炎病毒特異性定量檢測方法的優(yōu)化和建立經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗，并經(jīng)過臨床樣品的檢測應(yīng)用評估。對建立的方法進行靈敏度、穩(wěn)定性、特異性以及對臨床標(biāo)本的有效性進行綜合評價。(1).靈敏度用滅菌雙蒸水分別將質(zhì)粒定量標(biāo)準(zhǔn)品pET28a-ORF2稀釋至108、107、106、105、104、103、102、101、10Qcopies/^il，采用經(jīng)優(yōu)化后的體系進行檢測，驗證所建立的方法的靈敏度。本檢測方法在10G108copies/reaction數(shù)量級范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R二0.9995，其檢測范圍可達(dá)9個數(shù)量級，其靈敏度可到10拷貝以下。(2).穩(wěn)定性我們從批間重復(fù)和批內(nèi)重復(fù)兩個方面進行評價。批內(nèi)重復(fù)性:選取同一份標(biāo)本，設(shè)10個平行反應(yīng)管同時進行反應(yīng)，檢驗其CT值的變異系數(shù)。批間重復(fù)性選取2個不同濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，一周內(nèi)重復(fù)檢測5次，檢測其C"直的變異系數(shù)。(3).特異性本研究選擇了7個標(biāo)本進行檢測，3份RT-nPCR檢測呈陽性的人的糞便標(biāo)本，3份健康標(biāo)本以及1份甲型肝炎病毒標(biāo)本。Trizol提取的標(biāo)本RNA溶于無RNase的DEPC-H20中，并按常規(guī)方法合成cDNA第一鏈。cDNA產(chǎn)物應(yīng)用建立的Real-timePCR方法進行定量檢測。定量結(jié)果顯示3份陽性標(biāo)本的病毒載量分別為3.8xl02、5.4><102和l.lxlO3copies/mg,其余標(biāo)本均為陰性結(jié)果。本發(fā)明采用Taqman探針定量PCR進行戊型肝炎病毒的特異性檢測，具有以下優(yōu)點和效果1.與傳統(tǒng)的定量方法相比，此實時熒光定量PCR具有高靈敏度、高特異性、高穩(wěn)定性等特點。直接對PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線。特異性好。由于Taqman法采用雜交的方式對目標(biāo)分子進行甄別，具有很高的準(zhǔn)確性。同時，耙序列由引物和探針雙重控制，具有特異性好，假陽性率低等特點。2.本發(fā)明建立的基于Taqman探針的熒光定量PCR方法具有靈敏度高，檢測范圍廣的特點。在10°108拷貝范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系(R=0.9995)，檢測范圍可以達(dá)到9個數(shù)量級，達(dá)到國際先進水平。其檢測靈敏度可到IO個拷貝以下，具有極高的靈敏度，適合檢測低病毒含量的實驗標(biāo)本。3.穩(wěn)定性和重復(fù)性高其批內(nèi)重復(fù)性檢測的CT值變異系數(shù)(CV)為1.49%，批內(nèi)重復(fù)性檢測的CT值變異系數(shù)(CV)為1.98%和2.23。％。4.操作簡單，自動化程度高。基于Taqman探針的定量技術(shù)在同一反應(yīng)管內(nèi)同時進行多重反應(yīng)。反應(yīng)過程中無需開蓋，避免污染，擴增和檢測同步完成，操作簡單，易于實現(xiàn)自動化。本發(fā)明采用的熒光定量PCR技術(shù)巧妙地利用了PCR技術(shù)的DNA高效擴增、探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的敏感性及實時定量的優(yōu)點，克服了常規(guī)PCR定性檢測的一些不足，極大地提高了檢測的敏感性和特異性，縮短了實驗時間，簡化了實驗操作，而且熒光檢測的結(jié)果由電腦軟件分析，避免了產(chǎn)物后處理過程所致的污染，較常規(guī)PCR更為客觀、靈敏、準(zhǔn)確。同時，本發(fā)明中采用的陽性對照是根據(jù)戊型肝炎病毒的保守序列設(shè)計構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，使得陽性標(biāo)準(zhǔn)品的來源可靠，避免了陽性毒株在每次實驗中的使用。圖1為熒光定量PCR敏感度檢測的熒光信號圖(從左至右的標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為10G108copies/^)。圖2.戊型肝炎病毒絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=-3.257*log(conc)+45.819(注conc表示反應(yīng)體系中的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù))。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。實施例1:設(shè)計引物和Taqman探針實驗步驟在Genbank中收集HEV全序列并進行生物信息學(xué)分析，選取序列保守區(qū)段作為設(shè)計引物和探針的候選區(qū)段，重點分析比對流行于我國的HEV全序列(EMBL登錄號AB108537、AJ272108、D11092、L08816、L25547和M94177),確定位于0RF2的高保守區(qū)域作為PCR擴增的靶基因序列。應(yīng)用primerexpress軟件和primerpremier5.0軟件，設(shè)計一對PCR引物和Taqman探針，探針5，端的熒光報告基團是FAM，3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMRA。引物和探針位于ORF2區(qū)域，目的擴增片段為151bp。戊型肝炎病毒特異性定量PCR引物指的是長度為21bp的寡核苷酸鏈。引物和探針序列為上游引物HEV-1(+):GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT;下游引物HEV-2(—)AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG;Taqman探針序列5，-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3，。實施例2:定量標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與制備實驗步驟1.定量標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建利用RT-PCR方法克隆得到含有靶序列的HEV基因片段，重組到載體pET-28a中，并進行DNA序列測定。構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為定量標(biāo)準(zhǔn)品，命名為pET28a-ORF2。2.定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備質(zhì)粒pET28a-ORF2用堿裂法進行提取純化，根據(jù)紫外分光光度計測定的OD26。、OD28。和OD23。值計算質(zhì)粒濃度，檢測質(zhì)粒的純度，并根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算成拷貝數(shù)。計算公式如下質(zhì)粒濃度(嗎/pl)二OD26。x稀釋倍數(shù)x50/1000質(zhì)?？截悢?shù)=A*N/1000MA:代表質(zhì)粒濃度(^g/^d);M:代表質(zhì)粒分子量；N:代表阿伏伽德羅常數(shù)(6.02xl023/mol)實施例3:病毒樣本中病毒的分離與濃縮實驗步驟1.病毒提取和濃縮(1).用PH7.4的PBS與戊肝患者急性期的糞便標(biāo)本充分振蕩混勻，制成10%的糞便懸液。若樣品病毒含量較高，直接繼續(xù)步驟2;若病毒含量較低則繼續(xù)以下步驟(2).4°C，8000rpm離心10min后取上清；(3).4°C，12000rpm繼續(xù)離心15min，取上清；(4).上清中加入加適量PEG6000和氯化鈉，4。C靜置過夜；(5).4°C，12000rpm離心15min后獲得沉淀，沉淀用Trizol提取RNA。2.病毒核酸提取(1).每150(il的10%的糞便懸液或每1ml的病毒懸液沉淀物加1mlTrizol，充分混勻裂解；(2).加200[il氯仿，振蕩混勻30s;(3).4°C，12000rpm離心5min，上清轉(zhuǎn)入無RNA酶的1.5ml離心管中；(4).加入等體積異丙醇，室溫放置5min;(5).4°C，12000rpm離心5min，小心棄上清；(6).加入700ul170%的乙醇洗滌沉淀一次；(7).重復(fù)步驟(6)—次；(8).沉淀室溫干燥；(9).加入30(il含RNasin(2U/|il)的DEPC-H20，充分溶解提取的病毒核酸。實施例4:樣本RNA的逆轉(zhuǎn)錄實驗步驟1.取核酸樣品5ial、負(fù)鏈引物1.5(il及DEPC-H203.5111，輕輕混勻；270°C作用5min，立即冰浴2min;3.加入5x逆轉(zhuǎn)錄Buffer6(il，10mmol/LdNTP2fil，RNasin1(J(80U/|il)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1|iK200U4d)，DEPC-H2010pl，溫和混勻后42。C反應(yīng)30min(注逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表l);4.9(TC作用30s滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，獲得cDNA;5.cDNA產(chǎn)物采用建立的實時熒光PCR反應(yīng)體系進行定量檢測。表1.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例5:戊型肝炎病毒特異性定量PCR方法的優(yōu)化和建立實驗步驟1.絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立(1).質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備質(zhì)粒pET28a-ORF2用堿裂法進行提取純化，根據(jù)紫外分光光度計測定的OD26Q、OD280和OD23。值計算質(zhì)粒濃度，檢測質(zhì)粒的純度，并根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算成拷貝數(shù)。(2).定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化通過對反應(yīng)體系中不同濃度的Mg"、定量PCR引物、Taqman探針、dNTP等的實驗結(jié)果進行比較，選擇反應(yīng)靈敏度高、本底熒光信號低、具有典型S型擴增熒光信號曲線、反應(yīng)效率接近于1的反應(yīng)體系。本發(fā)明使用的熒光定量PCR儀為Corbettresearch公司的RotorGene3000。熒光檢測的程序設(shè)置在每個循環(huán)第二步結(jié)束時檢測熒光信號，檢測波長為510nm。定量PCR循環(huán)采用兩步法，退火和延伸同步進行。循環(huán)條件為:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>反應(yīng)體系的篩選:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>經(jīng)優(yōu)化后的定量PCR反應(yīng)體系(25^xl反應(yīng)體系):反應(yīng)試劑體積(pi)終濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(3).絕對定量的擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線建立用滅菌雙蒸水10倍梯度稀釋質(zhì)粒定量標(biāo)準(zhǔn)品pET28a-ORF2。稀釋后質(zhì)粒濃度分別為108、107、106、105、104、103、102、101、10Qcopies/pl。采用經(jīng)優(yōu)化后的反應(yīng)體系進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3min;94°C10s，60°C30s，共40個循環(huán)。檢測結(jié)束后利用熒光PCR自帶的軟件(Rotorgeneversion6.0.38)，根據(jù)噪聲情況設(shè)定和調(diào)整基線和閾值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖l)。本檢測方法在10Q108copies/reaction數(shù)量級范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R二0.9995，其檢測范圍可達(dá)9個數(shù)量級，其靈敏度可到10拷貝以下(圖2)。檢測反應(yīng)管中病毒cDNA拷貝數(shù)的計算公式COnC=10(—a3()7xCT+14Q69);樣品中病毒濃度的計算公式樣品病毒載量(copies/mg)二concx樣品稀釋度/YM(注conc代表檢測體系中的病毒拷貝數(shù)；Y代表cDNA合成效率；M代表樣品質(zhì)量mg)。2.穩(wěn)定性分析從批間重復(fù)性和批內(nèi)重復(fù)性兩個方面進行評價建立的熒光定量PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。a).批內(nèi)重復(fù)性檢驗選取同一份標(biāo)本，按照實施例n和實施例m所述的方法提取病毒核酸并進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件設(shè)置IO個平行反應(yīng)管同時進行反應(yīng)，利用統(tǒng)計學(xué)方法檢驗其CT值的變異系數(shù)。批內(nèi)重復(fù)性檢測的CT值變異系數(shù)(CV)為1.49%。(2).批間重復(fù)性檢驗選取2個不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，采用實施例rv所述的反應(yīng)體系和條件，一周內(nèi)重復(fù)檢測5次，利用統(tǒng)計學(xué)方法檢驗其CT值的變異系數(shù)。批間重復(fù)性CT值的變異系數(shù)(CV)分別為1.98%和2.23%。表明本發(fā)明建立的檢測方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。3.特異性分析為檢驗建立的熒光定量PCR方法的適用性，本研究選擇了7個標(biāo)本進行檢測3份RT-nPCR檢測呈陽性的人的糞便標(biāo)本，3份健康標(biāo)本以及1份甲型肝炎病毒標(biāo)本。按照實施例n和實施例III所述的方法提取病毒核酸并獲得一鏈cDNA模板，采用經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系進行定量檢測。對上述標(biāo)本的定量結(jié)果顯示，3份陽性標(biāo)本的病毒載量分別為3.8x102、5.4><102和Llx103copies/mg，其余標(biāo)本無擴增信號均為陰性結(jié)果。4.檢測結(jié)果判定及病毒的定量(1).陽性對照的CT值應(yīng)小于30.0，陰性對照的CT值應(yīng)大于35.0。陽性模板為質(zhì)粒定量標(biāo)準(zhǔn)品pET28a-ORF2，陰性模板為無菌雙蒸水；(2).若Ct惶小于30.0，且呈現(xiàn)典型的擴增曲線，則判斷為陽性結(jié)果，表明檢測樣品中含有HEV病毒核酸；(3).若CT值大于35.0或無擴增信號，則判斷為陰性結(jié)果，表明檢測樣品種無HEV病毒核酸；(4).若CT值在30.035.0之間，則視為可疑結(jié)果，樣本需重復(fù)檢測一次。若結(jié)檢測果仍在此范圍內(nèi)，則判斷為陰性結(jié)果；(5).結(jié)果呈陽性的樣本，根據(jù)其CT值以及建立的定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本內(nèi)的HEV病毒載量。計算公式如下待測樣品病毒滴度(copies/mg)=10(-o.3G7xCT+14.,x/YM(X:代表樣品稀釋度；Y:代表cDNA合成效率；M:代表樣品質(zhì)量mg)。權(quán)利要求1.一種戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于檢測方法步驟如下(1).病毒特異性定量PCR引物和探針設(shè)計，包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，在Genbank中檢索戊型肝炎病毒全序列，通過生物信息學(xué)比對分析，選取序列保守片段，應(yīng)用primerexpress軟件和primerpremier5.0軟件，設(shè)計一對PCR引物和Taqman探針，探針5'端的熒光報告基團是FAM，3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMRA，引物和探針位于戊型肝炎病毒ORF2區(qū)域，目的擴增片段為151bp，擴增序列為GAATGCTCAGCAGGATMGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTATGACAACCMCATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCT引物和探針序列為上游引物HEV-1(+):GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT;'下游引物HEV-2(—)AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG;Taqman探針序列5，-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3,;(2).定量標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建根據(jù)確定的PCR引物，利用DNA重組技術(shù)將包含目的擴增片段的基因克隆到質(zhì)粒載體pET-28a中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-ORF2作為檢測戊型肝炎病毒滴度的定量標(biāo)準(zhǔn)品；(3).樣本中戊型肝炎病毒的分離及其RNA的提取，并針對病毒含量較低的樣本用聚乙二醇和氯化鈉進行濃縮，提高檢測的靈敏度；(4).對提取的樣本RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得樣本cDNA;(5).定量檢測方法的優(yōu)化和建立通過篩選不同的Mg"濃度、引物濃度、Taqman探針濃度，選擇具有高靈敏度、合適反應(yīng)效率的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。并通過對反應(yīng)體系的靈敏度、穩(wěn)定性和特異性等指標(biāo)對建立的熒光定量PCR方法進行綜合評價；(6).經(jīng)過對臨床標(biāo)本的檢測進行應(yīng)用評估，驗證建立的熒光定量PCR的可靠性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于標(biāo)準(zhǔn)陽性模板核苷酸序列為GAATGCTCAGCAGGATMGGGTATTGCMTCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATCTGTCCTCCGAGCT3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，其特征是所述的病毒特異性定量探針，指的是長度為21bp的寡聚核苷酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，其特征是所述的探針序列為CCGCATGACATCGACCTCGGG。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，其特征是所述的探針5'端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，其特征是所述的3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMRA。全文摘要本發(fā)明是一種涉及生物工程領(lǐng)域的檢測方法，特別是用于定量檢測臨床標(biāo)本中戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEV)滴度的熒光定量PCR檢測方法。本發(fā)明包括如下步驟病毒特異性定量PCR引物和探針設(shè)計；標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建；病毒樣本RNA的提??；樣本RNA的cDNA合成；熒光定量PCR檢測方法的建立和優(yōu)化。本發(fā)明的檢測靈敏度可達(dá)10°數(shù)量級的病毒拷貝，具有良好的穩(wěn)定性和特異性，可用于大批量的樣本檢測，并可對樣本的病毒載量進行準(zhǔn)確定量。文檔編號C12Q1/70GK101122563SQ20071007056公開日2008年2月13日申請日期2007年8月28日優(yōu)先權(quán)日2007年8月28日發(fā)明者沃恩康,艷洪,王怡婷,勇陳申請人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院