專利名稱：表皮短桿菌zjb-07021及其在制備(s)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株新的菌種——表皮短桿菌ZJB-07021( 5wv/Z)acter/wm e戸Vferm/^s ZJB-07021 )，及其在微生物制備(5)-2，2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺 中的應(yīng)用。
(二)
背景技術(shù)：
2，2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)為
外消旋2，2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺由(5>2,2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺和 (/0-2，2-二甲基環(huán)丙烷曱酰胺兩個(gè)對(duì)映體構(gòu)成。
(5>2,2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺是西司他丁合成的關(guān)鍵手性中間體。西 司他丁，化學(xué)名為(Z)-7-[(2i )-(2氨基-2-羧基乙基)硫]-[(15)-2，2-二甲基環(huán) 丙烷曱酰胺基]-2-庚烯酸，是第一個(gè)應(yīng)用臨床的腎脫氫肽酶抑制劑。西司 他丁與亞胺培南(imipenem)的復(fù)方制劑泰能(Tienam)是美國默克(Merck) 公司在1979年研制開發(fā)的一種廣譜(3-內(nèi)酰胺抗生素，于1985年在德國 首次上市。西司他丁本身無抗菌作用，對(duì)(3-內(nèi)酰胺酶也無抑制作用，作 為腎脫氫二肽酶的特異性抑制劑，它能阻斷亞胺培南在腎臟內(nèi)(被腎脫氫 二肽酶)的代謝，減輕藥物的腎毒性，從而增加泌尿道內(nèi)未經(jīng)改變的亞胺 培南的濃度，增加療效。
利用傳統(tǒng)的化學(xué)法制備光學(xué)純(5>2，2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺，需在反
應(yīng)中添加大量溶劑和昂貴并具有毒性的手性催化劑，會(huì)對(duì)環(huán)境造成^fe大危
害。而用生物催化法制備(5)-2,2-二曱基環(huán)丙烷甲酰胺具有反應(yīng)條件溫和、 產(chǎn)物單一、立體選擇性強(qiáng)、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的生物法制 備光學(xué)純(5)-2，2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺主要有以下幾種
瑞士 Lonza公司Robins等(US Patent 5273903 、 5427934) 曾報(bào)道， 從外消旋的2，2-二曱基環(huán)丙曱酰胺出發(fā)，通過含光學(xué)選擇性酰胺酶的微生 4勿Cbwa附owas ac/dovoraws A: 18(DSM No.6315)、 C"omormowas ac/(iovon3"s TG 308(DSM No.6552)、尸^z^wwo"os sp. NSAK:42(DSM No.6433)、 5acfen'ww sp.Vffl:II( DSM No.6316)的動(dòng)力學(xué)拆分，將其中的(及)-(-)-2,2-二 曱基環(huán)丙甲酰胺轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酸來制備(5)- (+)-2,2-二曱基環(huán)丙曱酰胺。浙 江工業(yè)大學(xué)鄭裕國等(Research in Microbiology, 2007， 158: 258-264)篩選到 的Z)e辨/a towra/^m^ ZJB-05174 (CCTCC M 205114)也能選擇性地降解 外消旋體中i -異構(gòu)體而制備(5)-2,2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺。韓國Lim等報(bào) 道先將外消旋的2,2-二曱基環(huán)丙曱酸衍生化為對(duì)應(yīng)的乙酯，通過光學(xué)選擇 性脂酶選擇性水解其中的(5>2,2-二曱基環(huán)丙曱酸乙酯為對(duì)應(yīng)的酸和乙 醇，再通過(5)-2,2-二曱基環(huán)丙曱酸的加氨來制備S-酰胺(WO2004/005241 Al)。
中國科學(xué)院化學(xué)研究所王梅祥等(Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2002, 18: 267-272)曾報(bào)道以外消旋的2,2-二曱基環(huán)丙曱腈為 底物，以/^c^ococcws sp. AJ270為催化劑來制備及-(-)-2,2-二曱基環(huán)丙烷 f酰胺和(5)-(+)-2，2-二曱基環(huán)丙烷曱酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了提供一林可用于制備光學(xué)純(5)-2，2-二曱基環(huán)丙烷曱酰 胺的新菌種--表皮短桿菌ZJB-07021 ( 5rev/6acten'Mm e/ /cfe 7wVfo ZJB-07021 ),及其在微生物制備(5)-2,2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺中的應(yīng)用。 本發(fā)明釆用的技術(shù)方案是
表皮短才干菌ZJB-07021 ( 5rev/6flcfen'wm ZJB-07021 ), <呆
藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期
2007年6月8日，保藏編號(hào)CCTCC NO: M 207076。 該新菌抹的特征如下
菌落形態(tài)30。C培養(yǎng)40h,在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)上的菌落呈圓 形，直徑1毫米，隆起形狀為凸鏡狀，淡黃色，邊緣整齊，光滑。菌落隨 時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，數(shù)天后直徑可達(dá)5mm以上。
細(xì)胞形態(tài)20 h培養(yǎng)物的細(xì)胞呈桿狀，0.6 1.2拜xi.5 3.0 |im。無 芽孢形成，不運(yùn)動(dòng)。培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌體逐步變短，老培養(yǎng)物變成球狀。
生理生化特征革蘭氏陽性，接觸酶陽性，硝酸鹽還原弱陽性，其他 陽性項(xiàng)目是吐溫40、吐溫80、 L-樹膠醛糖、D-阿拉伯糖、D-果糖、七 葉苷，甘露醇、甘露糖、D-洛酮糖、松二糖、D-木糖、羥基丁酸、琥珀 酸甲酯、丙酮酸曱酯、丙三醇利用；全部陰性的項(xiàng)目是菊糖、(3-葡糖醛 酸酶、a-葡萄糖苷酶、N-乙?；?D-葡萄糖、海藻糖、山梨醇、木糖醇、 松三糖、甘露醇、水楊苷、脲酶、葡萄糖、核糖、乳糖、蔗糖、肝糖原產(chǎn) 酸、明膠液化、水蘇糖、麥芽糖、丙二酸鹽利用。
綜合上述結(jié)果，該菌林被鑒定為表皮短桿菌&evA"cfen'ww
通過Plackett-Burman考察了碳源、氮源、誘導(dǎo)劑與金屬離子等培養(yǎng) 基組分對(duì)表皮短桿菌CCTCC M.207076菌抹酶活的影響；同時(shí)采用旋轉(zhuǎn) 中心組合設(shè)計(jì)法對(duì)葡萄糖、酵母粉和乙酰胺等3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，得到表 皮短桿菌CCTCC M.207076的培養(yǎng)基組成為(終濃度)葡萄糖10.0 20.0
g/L，酵母粉13.0~18.0 g/L, KH2PO40.5 2.0 g/L, K2HPO40.5~2.0 g/L, NaCl 1 3g/L，乙酰胺5-11.0 g/L。
表皮短桿菌CCTCCM.207076的培養(yǎng)條件為起始pH 6.0-8.5，裝液 量5 30%,培養(yǎng)溫度20-35 。C,搖床轉(zhuǎn)速100~300 rpm,培養(yǎng)時(shí)間48~72 小時(shí)。
本發(fā)明所涉及的微生物是通過以下的程序篩選得到的 1 )將由全國各地采回的土樣和污水樣接種到富集培養(yǎng)基中，在30 °C, 150 rpm的搖床上培養(yǎng)4天，待培養(yǎng)基變混濁后，取1 ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新 鮮的富集培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)4天。如此重復(fù)4 5個(gè)循環(huán)。富集培養(yǎng)基的 配方如下(終濃度)2,2-二甲基環(huán)丙烷曱酰胺1 ~ 2.5 g/L ， K2HP04.12H20: 1.0 ~ 2.5 g/L， KH2P04: 1.0 ~ 2.0 g/L， MgS04.7H20: 0.2~0.5g/L， FeS04'7H20 : 0.01 ~ 0.05 g/L， CaCl2: 0.01 ~ 0.06 g/L, k乂 自來水配制，用1.0mol/L的鹽酸或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值6.0 8.0。
2) 最后一次富集培養(yǎng)液稀釋后涂布到平板培養(yǎng)基上，挑取單菌落至 斜面保藏。平板培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基中加入1.5%~2.0°/。的瓊脂。
3) 挑取的單菌落接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，組份如下(終濃度)葡萄糖 10.0 — 20.0 g/L,酵母膏5.0 ~ 10.0 g/L，蛋白胨2.0 ~ 5.0 g/L, NaCll.O — 3.0g/L, K2HPO41.0~2.0g/L， KH2P04 1.0 ~ 2.0 g/L, MgSO40.2 ~ 0.5 g/L， FeS04 0.01 ~ 0.05 g/L, CaCl2 0.05 ~ 0.1 g/L,乙酰胺2.0 ~ 5.0 g/L, pH自 然(121。C下，滅菌20min); 25 45 。C下，搖瓶轉(zhuǎn)速100~300 rpm，培養(yǎng) 48 h~72 h;離心后懸浮于磷酸緩沖體系中。然后根據(jù)浙江工業(yè)大學(xué)鄭裕 國等(Applied Microbiology and Biotechnology. 2007， 74: 256-262)所述的立 體選擇性酰胺酶的篩選方法進(jìn)行產(chǎn)及-酰胺酶菌抹的篩選。
4) 對(duì)通過上述方法篩選到的產(chǎn)及-酰胺酶菌抹，通過水解轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)
行復(fù)嬸。按照上述方法培養(yǎng)得到的菌體，離心后懸浮于嶙酸緩沖體系中，
加入2，2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺作為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化；用手性氣相色譜法分 析產(chǎn)物和底物的含量及光學(xué)純度。
手性色鐠法的具體操作條件為日本島津GC-14C氣相色譜爿f義，GC Solution色語工作站；瑞士 BGB-175手性毛細(xì)管氣相色鐠柱；載氣為高 純氦氣，流量為1.5mL/min;進(jìn)樣量0.8 分流比為40:1;檢測(cè)器及進(jìn) 樣口溫度均為220 。C。分離底物2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺及產(chǎn)物2，2-二曱 基環(huán)丙烷曱酸時(shí)，柱溫分別為170。C和130。C。
本發(fā)明還涉及所述的表皮短桿菌ZJB-07021在孩i生物發(fā)酵制備 (5>2,2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺中的應(yīng)用。
具體的，所述的應(yīng)用為以外消旋2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺為底物， 加入表皮短桿菌ZJB-07021濕菌體細(xì)胞，25-45 。C下、于pH 6.5-9.0的緩 沖液中反應(yīng)1~4小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到(6)-2,2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺。
優(yōu)選的，所述反應(yīng)在pH 6.5~7.8的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行?；蛘?，所 述反應(yīng)在pH 7.4~9.0的Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行。
優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系中還可添加有體積為緩沖液體積3~10%的共 溶劑，可以顯著提高反應(yīng)的活力和光學(xué)選擇性。所述共溶劑包括但不限于 下列之一①曱醇、②乙醇、③乙酸乙酯、④丙酮、 正丙醇、 異丙醇、 ⑦乙腈等。 ..
所述反應(yīng)體系中，表皮短桿菌ZJB-07021濕菌體細(xì)胞的初始濃度為 80~300 g/L,底物外消旋2,2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺的初始濃度為5~15 g/L。
所述表皮短桿菌ZJB-07021濕菌體細(xì)胞可由如下方法制備得到培養(yǎng)
基終濃度組成葡萄糖10.0 20.0g/L,酵母粉13.0 18.0 g/L,KH2PO40.5 2.0 g/L, K2HPO40.5~2.0g/L, NaCl 1 3 g/L,乙酰胺5~11.0 g/L， pH6.0 8.5; 接種表皮短桿菌ZJB-07021 ， 20 35°C 、 100-300 rpm振蕩培養(yǎng)48~72小時(shí)， 將菌體離心經(jīng)生理鹽水洗滌，收集得濕菌體細(xì)胞。
具體的，所述應(yīng)用如下
(1 )培養(yǎng)基終濃度組成葡萄糖15 g/L，酵母粉14.5 g/L, KH2P04 1.0 g/L, K2HP04 1.0 g/L， NaCl 1.0 g/L，乙酰胺5.6 g/L， pH 6.0 8.5; 搖瓶裝液量30%,接種表皮短桿菌ZJB-07021,于20 。C 、 100 300 rpm振蕩培養(yǎng)72h，將菌體離心經(jīng)生理鹽水洗滌，收集得濕菌體 細(xì)胞；
(2 )取50 mMpH 7.8的磷酸鹽緩沖液，加入步驟(1 )所得濕菌體細(xì) 胞至細(xì)胞濃度為200 g/L，并加入底物外消旋2，2-二甲基環(huán)丙烷 曱酰胺至底物濃度為10g/L, 35 t恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)2小 時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液離心，取上清液，加入等體積的乙酸
乙酯萃取，得5H+)-2,2-二甲基環(huán)丙甲酰胺。 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種具有立體選擇性、可制備 光學(xué)純(5)-2,2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺的新菌種，通過該菌種可制備高光學(xué) 純度的CS)-2,2-二甲基環(huán)丙烷曱酰胺；本發(fā)明通過篩選得到不同于以往研 究的新菌種，從而為考察在手性拆分方面的微生物菌種的多樣性、進(jìn)而比 較不同菌種在轉(zhuǎn)化途輝及反應(yīng)機(jī)理上的差異提供了 &出。 . 具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不^f又限于此
實(shí)施例1:菌^f朱的分離
產(chǎn)i -酰胺酶產(chǎn)生菌的分離在9mL 0.85%的生理lt水中加入1 g 土樣、 適量玻璃珠，搖勻，使成均勻的土壤懸液；吸取0.5mL的土壤懸液接種 到裝有30mL富集培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，置于30。C， 150rpm的 搖床培養(yǎng)4天，等富集液出現(xiàn)渾濁后，再吸取0.5 mL轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng) 基中，繼續(xù)培養(yǎng)4天；如此重復(fù)4 5個(gè)循環(huán)后，將富集液稀釋多個(gè)梯度， 涂布到分離平板上，獲得單菌落；
富集培養(yǎng)基以2，2-二曱基環(huán)丙曱酰胺為唯一氮源，組成如下(終濃 度)K2HP04.12H20: 2.5 g/L， KH2P04: 2 g/L， MgS04'7H20: 0.5 g/L, FeS04.7H20: 0.01 g/L， CaCl2: 0.06 g/L, 2,2-二甲基環(huán)丙烷曱酰胺1.5 g/L, 用自來水配制，pH調(diào)為7.0;
挑取的單菌落接種到富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h、 72h后取樣，用手性 氣相色鐠法檢測(cè)產(chǎn)物S-(+)-2,2-二曱基環(huán)丙曱酰胺的對(duì)應(yīng)體過量值(e.e. 值)，e.e.值超過98。/。的，即為所述的微生物表皮短桿菌ZJB-07021。
實(shí)施例2:菌林的培養(yǎng)
斜面培養(yǎng)基組成(終濃度)牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L,NaC15g/L, 瓊脂18g/L,用自來水配制；
于平板上挑取CCTCCM.207076的單菌落，接種至斜面，于30。C恒 溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，放入4 。C水箱內(nèi)保藏備用。
實(shí)施例3:濕菌體細(xì)胞的獲得
培養(yǎng)基配制葡萄糖10.0g，酵母粉13.0g， KH2PO40.5g, K2HP040.5g, NaCllg,乙酰胺5g,自來水補(bǔ)足至1L， pH6.5;
250 ml搖瓶裝液量30。/。，接種一環(huán)表皮短桿菌CCTCC M.207076， 于20。C、 300 rpm振蕩培養(yǎng)72 h;培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液離心并用生理鹽水 洗滌兩次，收集濕菌體細(xì)胞，懸浮于50mM、 pH 7.8的磷酸鹽緩沖溶液 中，得濕菌體細(xì)胞含量為0.5g/mL的菌懸液，備用。
實(shí)施例4:濕菌體細(xì)胞的獲得
培養(yǎng)基配制葡萄糖20.0g,酵母粉18.0 g, KH2PO42.0g， K2HPO42.0 g， NaC13g，乙酰胺11.0g，自來水補(bǔ)足至1L, pH8.0;
250 ml搖lf瓦裝液量30。/。，接種一環(huán)表皮短桿菌CCTCC M.207076， 于35。C、 100 rpm振蕩培養(yǎng)48 h;培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液離心并用生理鹽水 洗滌兩次，收集濕菌體細(xì)胞，懸浮于50mM、 pH 7.8的磷酸鹽緩沖溶液 中，得濕菌體細(xì)胞含量為0.5g/mL的菌懸液，備用。
實(shí)施例5:
在10mL、 50mM的磷酸鹽緩沖溶液中(pH7.8),加入4mL實(shí)施例 3所得菌懸液；加入100 mg外消旋2，2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺作為底物。 于35 。C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液，經(jīng)等體 積的乙酸乙酯萃取，產(chǎn)物5*-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙甲酰胺的光學(xué)純度98.5% e.e.,轉(zhuǎn)化率52%。
實(shí)施例6:
在10ml、 50 mM的磷酸鹽緩沖溶液中(pH7.8)，加入1.6mL實(shí)施 例3所得菌懸液；加入100mg外消旋2,2-二甲基環(huán)丙烷曱酰胺作為底物。
于35。C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液，經(jīng)等體 積的乙酸乙酯萃取，產(chǎn)物S-(+)-2,2-二曱基環(huán)丙曱酰胺的光學(xué)純度95.6% e.e.，轉(zhuǎn)化率41%。
實(shí)施例7:
在10 ml、 50 mM的磷酸鹽緩沖溶液中(pH 7.8 )，加入6mL實(shí)施例 4所得菌懸液；加入100 mg外消旋2，2-二曱基環(huán)丙烷甲酰胺作為底物。 于35 。C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液，經(jīng)等體 積的乙酸乙酯萃取，產(chǎn)物5"-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙曱酰胺的光學(xué)純度99% e.e.,轉(zhuǎn)化率54%。
實(shí)施例8:
在10ml、 50mM的磷酸鹽緩沖溶液中(pH7.8),加入4mL實(shí)施例 3所得菌懸液；加入50 mg ( 0.5%)外消旋2，2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺作為 底物。于35 。C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液， 經(jīng)等體積的乙酸乙酯萃取，產(chǎn)物S-(+)-2，2-二曱基環(huán)丙曱酰胺的光學(xué)純度 98.3%e.e.，轉(zhuǎn)化率52%。
實(shí)施例9:
在10 ml、 50 mM的磷酸鹽緩沖溶液中(pH 7.8 )，加入4mL實(shí)施例 4所得菌懸液「加入150 mg外消旋2，2-二曱基環(huán)丙烷甲酰胺作為底物。 于35。C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液萃取，產(chǎn) 物5K+)-2,2-二曱基環(huán)丙曱酰胺的光學(xué)純度97.9% e.e.,轉(zhuǎn)化率48%。
實(shí)施例10:
在10ml、 50mM的磷酸鹽緩沖溶液中(pH6.5),加入4mL實(shí)施例 3所得菌懸液；加入IOO mg外消旋2,2-二甲基環(huán)丙烷曱酰胺作為底物。 于25。C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)4.5小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清液萃取， 產(chǎn)物5K+)-2，2-二曱基環(huán)丙甲酰胺的光學(xué)純度98.9% e.e.，轉(zhuǎn)化率52%。
實(shí)施例11:
在10 ml、 50 mM的Tris-HCl緩沖溶液中(pH 9.0 ),加入4 mL實(shí)施 例3所得菌懸液；加入100 mg ( 1.0%)外消旋2，2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺 作為底物。于45。C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上清 液，經(jīng)等體積的乙酸乙酯萃取，產(chǎn)物S-(+)-2，2-二曱基環(huán)丙甲酰胺的光學(xué) 純度99% e.e.，轉(zhuǎn)化率55%。
實(shí)施例12:
在10 ml、 50 mM的磷酸緩沖溶液中(pH 7.8 )，加入4mL實(shí)施例4 所得菌懸液；加入100 mg外消旋2,2-二甲基環(huán)丙烷曱酰胺作為底物和0.3 mL甲醇。于35 。C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)1.5小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上 清液，經(jīng)等體積的乙酸乙酯萃取，產(chǎn)物S-(+)-2，2-二曱基環(huán)丙曱酰胺的光 學(xué)純度99.3% e.e.,轉(zhuǎn)化率51%。
實(shí)施例13:
在10 ml、 50 mM的磷酸緩沖溶液中(pH 7.8 )，加入4mL實(shí)施例4 所得菌懸液；加入IOO mg外消旋2,2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺作為底物和1 mL曱醇。于35 。C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)1.8小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上
清液，經(jīng)等體積的乙酸乙酯萃取，產(chǎn)物5H+)-2，2-二曱基環(huán)丙曱酰胺的光 學(xué)純度99.5% e.e.,轉(zhuǎn)化率53%。
實(shí)施例14:
在10 ml、 50 mM的Tris-HCl緩沖溶液中(pH 7.4 )，加入4 mL實(shí)施 例3所得菌懸液；加入IOO mg外消旋2,2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺和0.6mL 乙酸乙酯。于40 。C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)2.5小時(shí)。反應(yīng)液離心，取上 清液，經(jīng)等體積的乙酸乙酯萃取，產(chǎn)物5H+)-2,2-二曱基環(huán)丙曱酰胺的光 學(xué)純度99.2% e.e.，轉(zhuǎn)化率52%。
權(quán)利要求
1.表皮短桿菌ZJB-07021(Brevibacterium epidermidis ZJB-07021)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2007年6月8日，保藏編號(hào)CCTCC M.207076。
2. 如權(quán)利要求1所述的表皮短桿菌ZJB-07021,其特征在于所述表皮短桿 菌ZJB-07021菌落特征如下30。C培養(yǎng)40h,在牛肉膏蛋白胨平板培 養(yǎng)上的菌落呈圓形，直徑1毫米，隆起形狀為凸鏡狀，淡黃色，邊緣 整齊，光滑，菌落隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，數(shù)天后直徑可達(dá)5mm以上； 20 h培養(yǎng)物的細(xì)胞呈桿狀，0.6 1.2 nmxl.5 3.0 nm;無芽孢形成，不 運(yùn)動(dòng)；培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌體逐步變短，老培養(yǎng)物變成球狀；革蘭氏陽 性，接觸酶陽性，硝酸鹽還原弱陽性，吐溫40、吐溫80、 L-樹膠醛糖、 D-阿拉伯糖、D-果糖、七葉苷、甘露醇、甘露糖、D-洛酮糖、松二糖、 D-木糖、羥基丁酸、琥珀酸曱酯、丙酮酸曱酯、丙三醇利用為陽性； 菊糖、J3-葡糖醛酸酶、a-葡萄糖苷酶、N-乙酰基-D-葡萄糖、海藻糖、 山梨醇、木糖醇、松三糖、甘露醇、水楊苷、脲酶、葡萄糖、核糖、 乳糖、蔗糖、肝糖原產(chǎn)酸、明膠液化、水蘇糖、麥芽糖、丙二酸鹽利 用為陰性。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的表皮短桿菌ZJB-07021在微生物制備(5)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求.3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為以外消旋2，2-二甲基環(huán)丙烷曱酰胺為底物，加入表皮短桿菌ZJB-07021濕菌體細(xì)胞， 25 45。C下、于pH6.5-9.0的緩沖液中反應(yīng)1~4小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)分離純 化得到(5)-2,2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)在pH 6.5 7.8的磷酸 鹽緩沖液中進(jìn)行。
6. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)在pH 7.4~9.0的 Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行。
7. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)體系中還添加有體 積為緩沖液體積3 10%的共溶劑，所述共溶劑為下列之一①甲醇、 ②乙醇、③乙酸乙酯、④丙酮、⑤正丙醇、 異丙醇、⑦乙腈。
8. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)體系中，表皮短桿 菌ZJB-07021濕菌體細(xì)胞的初始濃度為80~300 g/L，底物外消旋2,2-二曱基環(huán)丙烷曱酰胺的初始濃度為5~15g/L。
9. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述表皮短桿菌ZJB-07021濕 菌體細(xì)胞由如下方法制備得到培養(yǎng)基終濃度組成葡萄糖 10.0 20.0g/L,酵母粉13.0~18.0 g/L， KH2P04 0.5~2.0 g/L， K2HP04 0.5~2.0 g/L， NaCl 1~3 g/L，乙酰胺5~11.0 g/L, pH 6.0 8.5;接種表皮 短桿菌ZJB-07021, 20~35°C、 100-300 rpm振蕩培養(yǎng)48~72小時(shí)，將 菌體離心經(jīng)生理鹽水洗滌，收集得濕菌體細(xì)胞。
10. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用如下(1 )培養(yǎng)基終濃度組成葡萄糖15 g/L,酵母粉14.5 g/L, KH2P04 1.0 g/L, K2HP04 1.0 g/L， NaCl 1.0 g/L，乙酰胺5.6 g/L, pH 6.0 8.5; 搖瓶裝液量30°/。，接種表皮短桿菌ZJB-07021 ，于20 。C、 100-300 rpm振蕩培養(yǎng)72h，將菌體離心經(jīng)生理鹽水洗滌，收集得濕菌體 細(xì)胞； (2 )取50 mM pH 7.8的磷酸鹽緩沖液，加入步驟(1 )所得濕菌體細(xì) 胞至細(xì)胞濃度為200g/L,并加入底物外消旋2，2-二曱基環(huán)丙烷曱 酰胺至底物濃度為10g/L, 35 。C恒溫水浴搖床振蕩反應(yīng)2小時(shí)， 反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液離心，取上清液，加入等體積的乙酸乙酯萃 取，得S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙曱酰胺。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株新的菌種——表皮短桿菌ZJB-07021(Brevibacterium epidermidis ZJB-07021)，及其在微生物制備(S)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種具有立體選擇性、可制備光學(xué)純(S)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺的新菌種，通過該菌種可制備高光學(xué)純度的(S)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺；本發(fā)明通過篩選得到不同于以往研究的新菌種，從而為考察在手性拆分方面的微生物菌種的多樣性、進(jìn)而比較不同菌種在轉(zhuǎn)化途徑及反應(yīng)機(jī)理上的差異提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101182480SQ20071007075
公開日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月10日
發(fā)明者沈寅初, 王寶峰, 王遠(yuǎn)山, 鄭仁朝, 鄭裕國, 金少軍 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)