專利名稱：鱗柄白鵝膏抑菌活性成份的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鱗柄白鵝膏抑菌活性成份的分離純化方法。
背景技術(shù)：
目前，鱗柄白鵝膏(^鵬/7/"W'"M )是隸屬擔(dān)子菌亞門(mén)
(Basidiomycotina )、層菌綱(Hymenomycetes )、傘菌目(Agaricales )、 鵝膏菌科(Amanitaceae)、毒傘屬(^z^/7/")的真菌。該菌毒性為極毒。 目前尚未有利用鱗柄白鵝膏菌絲體發(fā)酵液中的抑菌活性成分——酰胺類 物質(zhì)防治林木病害的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用鱗柄白鵝膏菌絲體發(fā)酵液中的抑菌 活性成分防治林木病害。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案是抑菌活性成分由兩 種酰胺類物質(zhì)構(gòu)成，分子量分別為5732.39， 7187.01,分離純化工藝為， 鱗柄白鵝膏子實(shí)體鑒別一一菌種分離、純化一一菌株鑒定一_菌絲體液 體培養(yǎng)一一抑菌活性成分提取一一抑菌活性成分分離一一抑菌活性成分 純化。
(1 )、鱗柄白鵝膏子實(shí)體鑒別子實(shí)體單生至散生，菌蓋直徑6-15cm， 圓錐形至鐘形，后平展,中央凸起，濕時(shí)表面有粘性，干時(shí)有光澤，白 色，有時(shí)中央略帶黃色，光滑，菌褶白色，離生，密集，菌柄長(zhǎng)8-14cm， 直徑1-L2cm,白色，有顯著的鱗片，近柱形，基部膨大呈球狀，菌環(huán)生 于菌柄的上部，白色，膜質(zhì)，下垂，不易脫落，菌托白色，苞狀，孢子 印白色，孢子近球形，無(wú)色，光滑，7-10]um，
(2) 、菌種分離、純化釆用組織分離法，無(wú)菌條件下，挑取菌柄 與菌蓋之間的組織接種于PDA平板培養(yǎng)基上，待組織塊上長(zhǎng)出菌絲，將 菌絲轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，PDA培養(yǎng)基配方，馬鈴薯150-250g，葡 萄糖17-20g，瓊脂17-20g，水1000ml，
(3) 、菌株鑒定釆用分子生物學(xué)鑒定方法，將子實(shí)體與分離得到
的菌絲體分別進(jìn)行rDNA ITS序列鑒定、比對(duì)，以證明分離得到的菌株來(lái)
自于所分離的子實(shí)體，
(4) 、液體發(fā)酵培養(yǎng)適于抑菌活性物質(zhì)生長(zhǎng)的最佳的培養(yǎng)基組合 為乳糖2-4%,蛋白胨O. 3-0.7%, MgS040.15%， KH2P040. 45%，適合鱗柄白 鵝膏菌絲生長(zhǎng)和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件分別為，PH5-6， 溫度在25°C-30°C，接種量為1%左右，裝液量為40-50%,搖床轉(zhuǎn)數(shù)為 120r/min-160r/min，培養(yǎng)時(shí)間是15天-20天，
(5) 、抑菌活性物質(zhì)提取將上述培養(yǎng)液超聲破碎50-60min，過(guò)濾
除菌，
(6) 、抑菌活性物質(zhì)分離釆用G-75/100葡聚糖凝膠層析法，
(7) 、抑菌活性物質(zhì)純化釆用G-25凝膠層析法。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
本發(fā)明能抑制楊樹(shù)爛皮病菌(0^ "wa c力rj^"e7vz a)菌絲生長(zhǎng) 及孢子萌發(fā)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)抑制率均達(dá)到100%。同時(shí)對(duì)樟子松 枯梢病菌(Sp力aero/^" M/7/力ea)也有顯著的抑制作用。鱗柄白鵝膏抑 菌活性物質(zhì)影響病原菌七種酶活性，降低己糖激酶的活力，提高丙酮酸 激酶、琥珀酸、乳酸脫氫酶和ATP酶活力，加快病菌的呼吸作用，產(chǎn)生 大量的活性氧自由基，使病原菌細(xì)胞生物膜受到損傷，過(guò)氧化氫酶、谷 胱甘肽過(guò)氧化物酶和總超氧岐化酶T-SOD酶三種生物體防御系統(tǒng)的酶的 含量極低，自身的清除能力低，不能及時(shí)清除呼吸作用急劇加快產(chǎn)生的 活性氧自由基，對(duì)體內(nèi)生物分子產(chǎn)生損傷作用。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 實(shí)施例1、
'(1)、根據(jù)鱗柄白鵝膏子實(shí)體特征進(jìn)行子實(shí)體鑒別，鱗柄白鵝膏子 實(shí)體單生至散生，菌蓋直徑6-15cm，圓錐形至鐘形，后平展，中央凸起，
濕時(shí)表面有粘性，干時(shí)有光澤，白色，有時(shí)中央略帶黃色，光滑。菌褶 白色，離生，密集，菌柄長(zhǎng)8-14cm,直徑l-1.2cm,白色，有顯著的鱗 片，近柱形，基部膨大呈球狀，菌環(huán)生于菌柄的上部，白色，膜質(zhì)，下 垂，不易脫落，菌托白色，苞狀，孢子印白色，孢子近球形，無(wú)色，光
滑，7-10降
(2) 、菌種分離、純化釆用組織分離法，無(wú)菌條件下，挑取菌柄 與菌蓋之間的組織接種于PDA平板培養(yǎng)基上，待組織塊上長(zhǎng)出菌絲，將 菌絲轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上。PDA培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g,葡萄糖 20g,瓊脂20g，水1000ml，
(3) 、菌株鑒定釆用分子生物學(xué)鑒定方法，將子實(shí)體與分離得到 的菌絲體分別進(jìn)行rDNA ITS序列鑒定、比對(duì)，以證明分離得到的菌株來(lái)
自于所分離的子實(shí)體，
(4) 、液體發(fā)酵培養(yǎng)釆用液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，培 養(yǎng)基配方，乳糖2%，蛋白胨O. 5%， MgS(U. 15%, KH2P040. 45%,培養(yǎng)條件 為pH5.5，溫度在25'C,接種量為1.5%,裝液量為40%，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為 120r/min，培養(yǎng)時(shí)間16d,
(5 )、抑菌活性物質(zhì)提取將上述培養(yǎng)液超聲破碎60min,過(guò)濾除菌，
(6) 、抑菌活性物質(zhì)分離釆用G-75/100葡聚糖凝膠層析法，
(7) 、抑菌活性物質(zhì)純化釆用G-25凝膠層析法。 實(shí)施例2:
(1) 、根據(jù)鱗柄白鵝膏子實(shí)體特征進(jìn)行子實(shí)體鑒別，子實(shí)體單生至 散生，菌蓋直徑6-15c邁，圓錐形至鐘形，后平展，中央凸起，濕時(shí)表面 有粘性，干時(shí)有光澤，白色，有時(shí)中央略帶黃色，光滑。菌褶白色，離 生，密集，菌柄長(zhǎng)8-14cm,直徑1-1.2cm,白色，有顯著的鱗片，近柱 形，基部膨大呈球狀，菌環(huán)生于菌柄的上部，白色，膜質(zhì)，下垂，不易 脫落，菌托白色，苞狀，孢子印白色，孢子近球形，無(wú)色，光滑，7-10 M m，
(2) 、菌種分離、純化采用組織分離法，無(wú)菌條件下，挑取菌柄 與菌蓋之間的組織接種于PDA平板培養(yǎng)基上，待組織塊上長(zhǎng)出菌絲，將 菌絲轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，PDA培養(yǎng)基配方，馬鈴薯180g，葡萄糖 20g，瓊脂18g，水1000ral，
(3) 、菌株鑒定釆用分子生物學(xué)鑒定方法。將子實(shí)體與分離得到 的菌絲體分別進(jìn)行rDNA ITS序列鑒定、比對(duì)，以證明分離得到的菌株來(lái)
自于所分離的子實(shí)體，
(4) 、液體發(fā)酵培養(yǎng)釆用液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，培
養(yǎng)基配方，乳糖3%，蛋白胨O. 6%， MgS040. 15%, KH2PO4 0. 45%，培界條件 為pH6，溫度在26X:，接種量為1%，裝液量為"％，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為H0r/min， 培養(yǎng)時(shí)間20d，
(5 )、抑菌活性物質(zhì)提取將上述培養(yǎng)液超聲破碎55min，過(guò)濾除菌，
(6) 、抑菌活性物質(zhì)分離釆用G-75/100葡聚糖凝膠層析法，
(7) 、抑菌活性物質(zhì)純化釆用G-25凝膠層析法。 實(shí)施例3、
(1) 、根據(jù)鱗柄白鵝膏子實(shí)體特征進(jìn)行子實(shí)體鑒別，子實(shí)體單生至 散生，菌蓋直徑6-15cm，圓錐形至鐘形，后平展，中央凸起，濕時(shí)表面 有粘性，干時(shí)有光澤，白色，有時(shí)中央略帶黃色，光滑，菌褶白色，離 生，密集，菌柄長(zhǎng)8-14cm,直徑l-1.2cm,白色，有顯著的鱗片，近柱 形，基部膨大呈球狀，菌環(huán)生于菌柄的上部，白色，膜質(zhì)，下垂，不易 脫落，菌托白色，苞狀。孢子印白色，孢子近球形，無(wú)色，光滑，7-10 ILim，
(2) 、菌種分離、純化釆用組織分離法，無(wú)菌條件下，挑取菌柄 與菌蓋之間的組織接種于PDA平板培養(yǎng)基上，待組織塊上長(zhǎng)出菌絲，將 菌絲轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，PDA培養(yǎng)基配方，馬鈴薯210g，葡萄糖 17g，瓊脂17g，水1000ml，
(3) 、菌株鑒定釆用分子生物學(xué)鑒定方法，將子實(shí)體與分離得到 的菌絲體分別進(jìn)行rDNA ITS序列鑒定、比對(duì)，以證明分離得到的菌株來(lái)
自于所分離的子實(shí)體，
(4) 、液體發(fā)酵培養(yǎng)采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，培 養(yǎng)基配方，乳糖4%，蛋白胨0.3%, MgS04 0.15°/。， KH2P04 0.45%,培養(yǎng) 條件為PH5，溫度在28°C，接種量為0.8%，裝液量為50%，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為 160r/min，培養(yǎng)時(shí)間18d，
(5 )、抑菌活'性物質(zhì)提取將上述培養(yǎng)液超聲破碎50min，過(guò)濾除菌，
(6) 、抑菌活性物質(zhì)分離采用G-75/100葡聚糖凝膠層析法，
(7) 抑菌活性物質(zhì)純化釆用G-25凝膠層析法。
權(quán)利要求
1. 一種鱗柄白鵝膏抑菌活性成份的分離純化方法，其特征在于:抑菌活性成分由兩種酰胺類物質(zhì)構(gòu)成，分子量分別為5732.39，7187.01，分離純化工藝為，鱗柄白鵝膏子實(shí)體鑒別——菌種分離、純化——菌株鑒定——菌絲體液體培養(yǎng)——抑菌活性成分提取——抑菌活性成分分離——抑菌活性成分純化。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鱗柄白鵝膏抑菌活性成份的分離純化方法，其 特征在于U)、鱗柄白鵝膏子實(shí)體鑒別子實(shí)體單生至散生，菌蓋直徑6-15cm， 圓錐形至鐘形，后平展，中央凸起，濕時(shí)表面有粘性，干時(shí)有光澤，白 色，有時(shí)中央略帶黃色，光滑，菌褶白色，離生，密集，菌柄長(zhǎng)8-14cm， 直徑l-1.2cm，白色，有顯著的鱗片，近柱形，基部膨大呈球狀，菌環(huán)生 于菌柄的上部，白色，膜質(zhì)，下垂，不易脫落，菌托白色，苞狀，孢子 印白色，孢子近球形，無(wú)色，光滑，7-10nm，(2) 、菌種分離、純化釆用組織分離法，無(wú)菌條件下，挑取菌柄 與菌蓋之間的組織接種于PDA平板培養(yǎng)基上，待組織塊上長(zhǎng)出菌絲，將 菌絲轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，PDA培養(yǎng)基配方，馬鈴薯150-250g,葡 萄糖17-20g，瓊脂17-20g,水1000ml，(3) 、菌株鑒定釆用分子生物學(xué)鑒定方法，將子實(shí)體與分離得到 的菌絲體分別進(jìn)行rDNA ITS序列鑒定、比對(duì)，以證明分離得到的菌株來(lái)自于所分離的子實(shí)體，(4) 、液體發(fā)酵培養(yǎng)適于抑菌活性物質(zhì)生長(zhǎng)的最佳的培養(yǎng)基組合 為乳糖2-4%,蛋白胨O. 3-0. 7%， MgSO40. 15%, KH2P040. 45%,適合鱗柄白 鵝膏菌絲生長(zhǎng)和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件分別為，PH5-6， 溫度在25。C-3(TC，接種量為1%左右，裝液量為40-50%，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為 120r/min-160r/min，培養(yǎng)時(shí)間是15天-20天,(5) 、抑菌活性物質(zhì)提取將上述培養(yǎng)液超聲破碎50-60min,過(guò)濾除菌，(6) 、抑菌活性物質(zhì)分離釆用G-75/100葡聚糖凝膠層析法，(7) 、抑菌活性物質(zhì)純化釆用G-25凝膠層析法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鱗柄白鵝膏抑菌活性成份的分離純化方法，抑菌活性成分由兩種酰胺類物質(zhì)構(gòu)成，分子量分別為5732.39，7187.01，分離純化工藝為，鱗柄白鵝膏子實(shí)體鑒別——菌種分離、純化——菌株鑒定——菌絲體液體培養(yǎng)——抑菌活性成分提取——抑菌活性成分分離——抑菌活性成分純化。本發(fā)明能抑制楊樹(shù)爛皮病菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)抑制率均達(dá)到100％。同時(shí)對(duì)樟子松枯梢病菌也有顯著的抑制作用。鱗柄白鵝膏抑菌活性物質(zhì)影響病原菌七種酶活性，降低己糖激酶的活力，提高丙酮酸激酶、琥珀酸、乳酸脫氫酶和ATP酶活力，加快病菌的呼吸作用。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101376894SQ200710072708
公開(kāi)日2009年3月4日 申請(qǐng)日期2007年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月28日
發(fā)明者冀瑞卿, 宋瑞清 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué);宋瑞清;冀瑞卿