專(zhuān)利名稱(chēng)：男性y染色體微缺失基因檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因缺失檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
全世界約有15％的夫婦被不育所困擾，其中男性因素約占一半。在排除輸精管梗阻、克氏癥和其他泌尿生殖系統(tǒng)原因后，嚴(yán)重少精癥和無(wú)精子癥最有可能的原因就是精子發(fā)生基因的異常。關(guān)于精子發(fā)生基因，特別關(guān)注Y染色體長(zhǎng)臂11間隔。Y染色體構(gòu)成人類(lèi)基因組的2％， 由短臂(Yp)和長(zhǎng)臂(Yq)組成。無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究也證實(shí)Y染色體上存在著無(wú)精子因子(azoospermia factor，AZF)，它有四個(gè)清楚的、非重疊的亞區(qū)，即AZFa、AZFb、AZFc和AZFd區(qū)。這些區(qū)域的基因微缺失可引起精子發(fā)生障礙，繼而引起男性不育。因此Y染色體微缺失現(xiàn)在被認(rèn)為是男性特發(fā)性不育最重要的遺傳學(xué)病因。隨著輔助生殖技術(shù)的進(jìn)展，卵細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術(shù)被認(rèn)為是男性不育癥治療上的一次革命。然而該技術(shù)可能將攜帶染色體畸形、缺失或基因突變的精子注入到卵胞漿內(nèi)，使卵子受精，從而將上述各種遺傳缺陷傳給下一代。因此，為了確定是否需要治療，臨床醫(yī)生建議所以精子濃度＜5×106/mL的男性都要進(jìn)行Y染色體微缺失的分子診斷。
AZF的片段較小，常規(guī)核型分析不易發(fā)現(xiàn)其缺失，故一般通過(guò)對(duì)STSs進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)獲取Y染色體微缺失信息。常用的技術(shù)有1.多重PCR電泳多重PCR是目前Y染色體微缺失檢測(cè)應(yīng)用得最廣泛的方法，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)和高通量的特點(diǎn)，是檢測(cè)AZF的理想方法，但與常規(guī)PCR相比有更高的技術(shù)要求，且缺少標(biāo)準(zhǔn)篩查方案，各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果不盡相同。
2.探針技術(shù)用特異探針進(jìn)行Southern blot或Northern blot是研究AZF微缺失與男性不育關(guān)系的有效方法，但方法過(guò)于繁瑣，難以推廣，多用于實(shí)驗(yàn)室研究。
3.其他(1)基因芯片技術(shù)個(gè)別報(bào)道用基因芯片技術(shù)同時(shí)對(duì)多個(gè)熱點(diǎn)基因進(jìn)行研究，有助于篩選和研究無(wú)精子癥相關(guān)基因，詳盡了解無(wú)精子癥的發(fā)病機(jī)制。(2)毛細(xì)管電泳技術(shù)具有高通量、高靈敏度、快速及進(jìn)樣量少的優(yōu)點(diǎn)，但需要專(zhuān)門(mén)的毛細(xì)管電泳儀。
中國(guó)專(zhuān)利200410043918.0公開(kāi)了特異性擴(kuò)增Y染色體上微缺失STS中的sY87和sY143的兩對(duì)引物序列，但作為Y染色體微缺失檢測(cè)方法，不符合歐洲生殖學(xué)會(huì)檢測(cè)至少6個(gè)STS(sY254、sY255、sY84、sY86、sY127、sY134)的最低要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)試劑盒，該試劑盒能穩(wěn)定、高效地對(duì)男性Y染色體微缺失基因進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)方法，該方法建立在多重PCR和凝膠電泳基礎(chǔ)上，提高了多重PCR的穩(wěn)定性和均一性。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa亞區(qū)sY82序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO25和SEQ ID NO26所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa亞區(qū)sY84序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa亞區(qū)sY86序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY124序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO21和SEQ ID NO22所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY127序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO17和SEQ ID NO18所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY128序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO27和SEQ ID NO28所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY133序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO29和SEQ ID NO30所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY134序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO23和SEQ ID NO24所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY143序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；
特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc亞區(qū)sY239序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO11和SEQ ID NO12所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc亞區(qū)sY242序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc亞區(qū)sY254序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc亞區(qū)sY255序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFd亞區(qū)sY145序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO19和SEQ ID NO20所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFd亞區(qū)sY152序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO13和SEQ ID NO14所示；和特異性擴(kuò)增男性特有Sry基因的引物，其堿基序列如SEQ IDNO31和SEQ ID NO32所示；上述所有序列可由其堿基互補(bǔ)序列替換。
所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增所需試劑MgCl2、甜菜堿、熱啟動(dòng)酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP和PCR反應(yīng)緩沖液。
所述MgCl2反應(yīng)終濃度為1.5mM。
所述甜菜堿反應(yīng)終濃度為1.3M。
所述dATP反應(yīng)終濃度為200μM、dCTP反應(yīng)終濃度為200μM、dGTP反應(yīng)終濃度為200μM、dUTP反應(yīng)終濃度為400μM。
一種男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)方法，包括以下步驟
1)從抗凝全血中提取人基因組DNA；2)以步驟1)所得DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述特異性擴(kuò)增Y染色體AZF的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。
所述PCR擴(kuò)增分四管進(jìn)行，第一管包括10條引物，其堿基序列如SEQ ID NO1-8和SEQ ID NO31-32所示；第二管包括8條引物，其堿基序列如SEQ ID NO9-14和SEQ ID NO31-32所示；第三管包括10條引物，其堿基序列如SEQ ID NO15-22和SEQ ID NO31-32所示；第四管包括10條引物，其堿基序列如SEQ ID NO23-30和SEQ ID NO31-32所示。
所述PCR反應(yīng)體系中含有甜菜堿，其反應(yīng)終濃度為1.3M。
所述PCR擴(kuò)增條件為 本發(fā)明設(shè)計(jì)了15對(duì)PCR引物分別特異地?cái)U(kuò)增AZF STSs序列，并同時(shí)設(shè)計(jì)1對(duì)內(nèi)控PCR引物，擴(kuò)增男性特有的SRY(sex-determiningregion of Y-chromesome)基因，以指示PCR正常進(jìn)行。為了解決多重PCR擴(kuò)增不穩(wěn)定、不均一的問(wèn)題，本發(fā)明將該15個(gè)STSs分屬到4個(gè)PCR反應(yīng)當(dāng)中，并都添加SRY PCR引物，在同一條件下進(jìn)行4個(gè)獨(dú)立的擴(kuò)增反應(yīng)，最后再一起進(jìn)行電泳分析。通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，調(diào)整各引物對(duì)濃度，使用熱啟動(dòng)酶，并在PCR反應(yīng)液里添加甜菜堿等增效劑，最終實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定和均一地?cái)U(kuò)增。本發(fā)明PCR產(chǎn)物用普通瓊脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，因此設(shè)計(jì)的各引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小必須能夠被肉眼識(shí)別。本專(zhuān)利將15個(gè)STSs分屬4個(gè)PCR反應(yīng)，在每一個(gè)反應(yīng)中各PCR產(chǎn)物片段大小必須相差至少30bp，所有片段大小不超過(guò)400bp(不包括SRY引物擴(kuò)增產(chǎn)物，SRY擴(kuò)增片段為470bp)。各引物對(duì)Tm值相差不超過(guò)2℃。因?yàn)椴捎昧藷釂?dòng)酶和UNG酶(防污染)所以在PCR程序上也作了相應(yīng)的變化。
采用本發(fā)明所述試劑盒對(duì)男性Y染色體微缺失基因進(jìn)行檢測(cè)，具有高效、低成本、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。


圖1是正常男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)結(jié)果。
圖2是非正常男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)結(jié)果。
附圖標(biāo)號(hào)說(shuō)明I、第一管PCR；II、第二管PCR；III、第三管PCR；IV、第四管PCR；1，5，9，13正常對(duì)照；2，6，10，14樣品1；3，7，11，15樣品2；4，8，12，16陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一、材料1.儀器PCR儀、離心機(jī)2.引物設(shè)計(jì)本發(fā)明設(shè)計(jì)了15對(duì)PCR引物分別特異地?cái)U(kuò)增AZFSTSs序列，并同時(shí)設(shè)計(jì)1對(duì)內(nèi)控PCR引物，擴(kuò)增男性特有的Sry(sex-determining region of Y-chromesome)基因，以指示PCR正常進(jìn)行。
表1 引物列表


3、試劑1 XPCR buffer50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH9.0，25℃)和0.1％TritonX-100MgCl2、甜菜堿、熱啟動(dòng)酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP二、方法1、基因組DNA的獲取用常規(guī)分子生物學(xué)方法或市售試劑盒從抗凝全血中提取人基因組DNA。分別提取三名男子基因組DNA和一名女子基因組DNA。
2、PCR擴(kuò)增取PCR反應(yīng)管，在管壁上做好標(biāo)記，而后分別加入已提取的樣本gDNA 4μL(含基因組DNA200-500ng)、引物及PCR反應(yīng)試劑，最后加入無(wú)菌水至25μl反應(yīng)總體系。該過(guò)程需在冰上操作，每個(gè)樣品同時(shí)做4個(gè)PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)，且每次檢測(cè)都應(yīng)同時(shí)設(shè)立一組陽(yáng)性對(duì)照(正常男性基因組DNA)及陰性對(duì)照(女性基因組DNA)，PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。
表2 PCR反應(yīng)體系


PCR按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增

3、電泳檢測(cè)取10μL PCR產(chǎn)物加2μL 6×上樣緩沖液，(10uLPCR產(chǎn)物是針對(duì)1mm×3mm上樣孔，可根據(jù)上樣孔的大小作適當(dāng)調(diào)整)混和均勻后經(jīng)2.0％瓊脂糖電泳，先用電壓8V/cm電泳約3分鐘使DNA遷移出上樣孔，降低電壓至4v/cm至溴酚藍(lán)遷移出2-3厘米，即可在紫外燈下觀察結(jié)果，如條帶不能充分區(qū)分，可繼續(xù)電泳至能區(qū)分為止。凝膠質(zhì)量對(duì)條帶的區(qū)分十分關(guān)鍵，推薦使用Promega或Biowest等進(jìn)口瓊脂糖，大多數(shù)國(guó)產(chǎn)的瓊脂糖無(wú)法獲得理想效果，并建議使用凝膠成像系統(tǒng)。
三、結(jié)果分析(1)陰性對(duì)照以女性基因組DNA為模板的反應(yīng)管內(nèi)，應(yīng)無(wú)任何特異性產(chǎn)物擴(kuò)增(2)陽(yáng)性對(duì)照以正常男性基因組DNA為模板的反應(yīng)管內(nèi)應(yīng)擴(kuò)出以下條帶

其中男性樣品都應(yīng)擴(kuò)出內(nèi)控帶。若待測(cè)男性樣品中無(wú)此帶，說(shuō)明其基因組DNA未抽提成功，應(yīng)重新抽提DNA。
從圖1可以看出，該樣品擴(kuò)增出了以正常男性基因組DNA為模板應(yīng)該擴(kuò)增出的全部條帶，說(shuō)明該樣品正常，該男子Y染色體無(wú)微基因缺失。
從圖2可以看出，樣品1未擴(kuò)增出sY84序列，樣品2未擴(kuò)增出sY254、sY242、sY239、sY152和sY128序列，說(shuō)明樣品1部分A座位缺失，樣品2C座位和部分B、D座位聯(lián)合缺失。
Y染色體微缺失的檢測(cè)應(yīng)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有如下功能(1)通過(guò)對(duì)無(wú)精子癥或少精子癥患者進(jìn)行缺失篩查，指導(dǎo)臨床診斷及治療措施的選擇，從而避免不必要的藥物及手術(shù)治療。
(2)單精子胞漿內(nèi)注射技術(shù)(int ra2cytoplasmic sperminjection，ICSI)使許多少精癥甚至是無(wú)精癥患者可以生育下一代，但這種技術(shù)也可能將生殖缺陷人為地傳給后代，導(dǎo)致子代男性生殖力下降或不育，通過(guò)術(shù)前篩查可以避免這種傳遞并指導(dǎo)ICSI后代的生育。
SEQUENCE LISTING<110>亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司<120>男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法<130>11<160>32<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1gggtgtgacc ataaggca 18<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2accagtatct agccaaagca gc 22<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3gcaggataga gaagggtag 19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列
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1.男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa亞區(qū)sY82序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO25和SEQ ID NO26所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa亞區(qū)sY84序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFa亞區(qū)sY86序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY124序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO21和SEQ ID NO22所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY127序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO17和SEQ ID NO18所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY128序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO2 7和SEQ ID NO28所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY133序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO29和SEQ ID NO30所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY134序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO23和SEQ ID NO24所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFb亞區(qū)sY143序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc亞區(qū)sY239序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO11和SEQ ID NO12所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc亞區(qū)sY242序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc亞區(qū)sY254序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFc亞區(qū)sY255序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFd亞區(qū)sY145序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO19和SEQ ID NO20所示；特異性擴(kuò)增Y染色體AZFd亞區(qū)sY152序列的引物，其堿基序列如SEQ ID NO13和SEQ ID NO14所示；和特異性擴(kuò)增男性特有Sry基因的引物，其堿基序列如SEQ ID NO31和SEQ ID NO32所示；上述所有序列可由其堿基互補(bǔ)序列替換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增所需試劑MgCl2、甜菜堿、熱啟動(dòng)酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP和PCR反應(yīng)緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述MgCl2反應(yīng)終濃度為1.5mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述甜菜堿反應(yīng)終濃度為1.3M。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述dATP反應(yīng)終濃度為200μM、dCTP反應(yīng)終濃度為200μM、dGTP反應(yīng)終濃度為200μM、dUTP反應(yīng)終濃度為400μM。
6.男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)方法，包括以下步驟1)從抗凝全血中提取人基因組DNA；2)以步驟1)所得DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述特異性擴(kuò)增Y染色體AZF的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增分四管進(jìn)行，第一管包括10條引物，其堿基序列如SEQ ID NO1-8和SEQ ID NO31-32所示；第二管包括8條引物，其堿基序列如SEQ ID NO9-14和SEQ ID NO31-32所示；第三管包括10條引物，其堿基序列如SEQ ID NO15-22和SEQ ID NO31-32所示；第四管包括10條引物，其堿基序列如SEQ ID NO23-30和SEQ ID NO31-32所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系中含有甜菜堿，其反應(yīng)終濃度為1.3M。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因缺失檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種男性Y染色體微缺失基因檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。該試劑盒包括特異性擴(kuò)增Y染色體AZF的30條引物，和特異性擴(kuò)增男性特有Sry基因的2條引物。采用本發(fā)明所述試劑盒對(duì)男性Y染色體微缺失基因進(jìn)行檢測(cè)，具有高效、低成本、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101092648SQ20071007431
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2007年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月10日
發(fā)明者田潔, 任維, 向筑, 廖生赟, 鄒耀東 申請(qǐng)人:亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司