專利名稱：一種從植物提取物中篩選或檢測抗菌活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然物質(zhì)的生物活性成分，具體而言涉及從植物提取物中篩 選或4企測抗菌活性物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
目前，由于人們大量濫用抗生素類藥物以及各種原因，使得菌株產(chǎn)生了 很強(qiáng)的耐藥性，抗生素的使用也受到了很大的限制。由于天然抗生素類藥較 傳統(tǒng)抗生素具有毒副性小，抗菌性高，菌林對它的耐藥性性低的優(yōu)點(diǎn)，因此， 從天然資源中尋找新的抗生素將成為尋找新的抗生素類藥物的一條出路。中 國具有用植物藥和它的各個(gè)部位來治療疾病的傳統(tǒng)，植物藥資源豐富，產(chǎn)生 的次生代謝物又多，其中有的可用來治療細(xì)菌性疾病。因此，我們可以從天 然植物中尋找新的抗細(xì)菌類藥物。由于植物資源4艮龐大，進(jìn)行篩選時(shí)比較困 難，采用傳統(tǒng)的篩選方法費(fèi)時(shí)而低效。
根據(jù)檢索結(jié)果，目前涉及從天然植物中尋求具有抗菌活性成分的專利僅
有200610023110. 5號"一種具有廣i普抗菌活性的植物揮發(fā)油及其制備方法、 用途"，該專利僅涉及某種特定的植物。迄今為止，尚無從植物提取物中篩 選或檢測抗菌活性物質(zhì)的方法的專利申請件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從植物提取物中篩選或檢測抗菌活性物質(zhì) 的方法，從而為新的抗菌性藥物的研究開發(fā)提供便利。
發(fā)明人提供的從植物提取物中篩選或檢測抗菌活性物質(zhì)的方法，關(guān)鍵的
步驟為(1)制備植物提取物，或在此基礎(chǔ)上建立提取物庫，或通過各種分 離提純手段得到的組分或成分；(2)按照不同細(xì)菌或真菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行培 養(yǎng)；(3)將每種待測樣品加入細(xì)菌或真菌培養(yǎng)液；(4)在細(xì)菌或真菌培養(yǎng) 條件下培養(yǎng)12~24小時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)；(5)在每個(gè)培養(yǎng)液中加入刃天青指示劑； (6)根據(jù)刃天青的顏色變化判斷細(xì)菌的存活，由此判斷該植物提取物組分或 成分是否有抑菌活性。
本發(fā)明所述的抗菌活性包括對細(xì)菌或真菌有抗菌作用。 上述第一步中，植物提取物可以為各種溶劑提取的，也可以是通過各種 分離純化方法得到的組分或單一成分；待測樣品可為少量或大量的篩選，若 為大量的篩選，則可采用高通量篩選技術(shù)進(jìn)行篩選，在高通量的抗菌活性篩 選中，所用的微孔板為常用的96孔板。
上述第二步至第四步中，所述的細(xì)菌培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法均為常規(guī)的細(xì) 菌培養(yǎng)方法。
上述第五步中，所述的刃天青是作為篩選具抗菌活性實(shí)驗(yàn)的指示劑，可 從市場購買，如美國Sigma^^司。
上述第六步中，孔中的細(xì)菌或真菌是活的，即樣品沒有或只有極弱的抑 菌活性，則呈粉紅色或紅色；而孔中的細(xì)菌或真菌是死的，即樣品有或有較 強(qiáng)的抑菌活性，則呈藍(lán)色。
發(fā)明人指出，以上6步驟所觀察到的抗菌結(jié)果，可進(jìn)一步通過OD咖確定 提取物的抑菌活性呈粉紅色或紅色的孔OD,在O. 10-1.00之間；呈藍(lán)色 的孔OD600在1. 00之上；該檢測結(jié)果還可通過瓊酯法加以驗(yàn)證。
驗(yàn)證方法所述的瓊酯法是常規(guī)瓊酯法，可根據(jù)不同的細(xì)菌或真菌選擇不 同的培養(yǎng)基。發(fā)明人指出，高通量篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合而形成的新的 技術(shù)體系，它以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí) 驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過程，以靈敏快速的檢測儀器采集 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，在同一時(shí)間內(nèi)對數(shù)以 千、萬計(jì)的樣品進(jìn)行檢測，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫支持整個(gè)技術(shù)體系的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。 發(fā)明人還指出，刃天青指示劑一般用于檢測細(xì)菌存在與否、菌落多少的指示劑，如在鏈球菌，變形鏈球菌，乳酸桿菌，放線菌等中的運(yùn)用；而在植物 提取物抑菌活性成分的檢測或篩選中至今尚未應(yīng)用。由于刃天青指示劑顏色 變化明顯，易于用肉眼觀察，作為篩選具抗菌活性實(shí)驗(yàn)的指示劑，較其他顏 色指示劑，如曱基橙、酚酞、羅丹明B等，有自己獨(dú)特的優(yōu)勢。刃天青在該 方法中的運(yùn)用，使得該方法筒便、快速。本發(fā)明的從植物提取物中篩選或檢測抗菌活性的方法，可篩選植物提取 物，也可篩選經(jīng)分離后的組分或成分。該方法操作簡便，所需實(shí)驗(yàn)器材簡單， 工作量少；同時(shí)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也很明顯。本發(fā)明方法筒單易行，可以快速 篩選出具有抗菌活性的植物提取物，并從中快速篩選抗菌活性組分與成分， 為藥物的研究提供基礎(chǔ)，為人類的健康服務(wù)；也可用于植物抗菌活性成分的 檢測。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 163種植物提取物的篩選(l)建立提取庫取163種植物的提取物，將每種植物原料2g分別用 研缽和研棒搗碎，再加入8ml50。/。乙醇，每一種提取液要求在6號組織培養(yǎng) 皿中振搖24小時(shí)，以便從濾紙中濾過；然后將過濾液冷凍干燥16 24小時(shí) 后成粉末；通過冷凍干燥法得到的干提取物在100nl50y。乙醇液中呈懸浮狀； 建立起163種植物的提取物庫。(2)通過該方法進(jìn)行篩選，根據(jù)指示劑顏色判斷哪些提取物具有抗菌活性；① 提取物通過高通量方法對其活性進(jìn)行篩選 將每種提取液分別取加樣在96孔板中，板中含有l(wèi)OOpl TSBYE培養(yǎng)基和10 %轉(zhuǎn)糖鏈球菌U yro"/ 》和伴放線放線桿菌a<3C f 2'/7CW/Ce 的隔夜培養(yǎng)液。將板放置在厭氧條件下的培養(yǎng)皿中16~18小時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。之后，在每個(gè)孔中加入刃天青指示劑3|il,活細(xì)菌由 于新陳代謝使指示劑由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色，而死的細(xì)菌則不能；② 觀察指示結(jié)果結(jié)果顯示在163種植物提取液中，桑葉提取物具有 較強(qiáng)的抗菌活性，能抑制兩種菌的生長，指示劑呈藍(lán)色。實(shí)施例2桑葉提取物分離組分的抗菌活性篩選(1) HPLC法分離粗提物采取HPLC梯度洗脫法進(jìn)行分離，得到71個(gè)組分。(2) 通過該方法進(jìn)行篩選，根據(jù)指示劑顏色判斷哪些提取物具 有抗菌活性；① 對71個(gè)組分通過高通量方法進(jìn)行抗菌活性篩選方法同實(shí)施例一。② 顯示結(jié)果
組分4、 20、 31顯藍(lán)色，表明這3個(gè)組分具有很強(qiáng)的抗菌活性， (3 )血瓊脂板一驗(yàn)證其中組分31抗菌活性將組分31稀釋，并加入到美國Remel公司生產(chǎn)血液瓊脂平亞的血瓊脂 板上，培養(yǎng)后計(jì)算克隆數(shù)，結(jié)果為① 對放線桿菌的抑制作用組分31號板上沒有菌落；而對照平板上存在約900個(gè)菌落。說明該 組分具有100%抗口腔菌放線桿菌活性，菌落數(shù)證實(shí)了高通量篩選的數(shù)據(jù)。② 對鏈球菌的抑制作用組分31的平板上有41個(gè)菌落，而對照平板上存在約3800個(gè)菌落。這 表明它對鏈球菌的抑制率高達(dá)99%。因此，組分31號顯示很強(qiáng)抑制活性。 實(shí)施例3 86種中藥材的抗真菌活性篩選(1) 樣品庫的建立收集86種中藥材，每種100g,在45。C下烘干，采用萬能粉碎機(jī)粉碎過 40目篩，稱取粉碎后的藥材每種50g，分別置于250ml三角并瓦中，以180ml 的50%的乙醇溶液浸泡，置于200rad/min的37。C恒溫?fù)u床上，浸提12h。 得到提取物溶液和固體殘留物，將提取物溶液和固體殘留物置于 4000rad/min離心機(jī)內(nèi)，離心5分鐘，取上清液，抽濾后得到藥材的浸提液。(2) 樣品浸提液的處理將藥材的浸提液在48。C下減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，得到濃縮液，置于-2(TC冷凍 過夜，次日將冷凍好的濃縮液放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)千燥，得到粗提物。(3) 抗真菌活性高通量篩選在樣品的粗提庫建立后，采用高通量篩選的方法對86種藥材的樣品進(jìn)
行了微生物的抗菌活性篩選。菌抹為白假絲酵母菌(真菌)。具體方法如下 培養(yǎng)得到白^f艮絲酵母菌菌液，將高通量篩選樣品庫中的樣品用無菌水配 制成100mg/ml的樣品'溶液待用。各取100ul的菌液;改于微孔板的80個(gè)孔中。 另取10111100%氯己定尿酸鹽溶液((PerioGard ))放入一個(gè)空孔中作為陽 性對照，10ul無菌水放入一個(gè)空孔中作為陰性對照。然后向每一個(gè)孔內(nèi)加入 10ul的樣品溶液。將整個(gè)平板放在適宜的環(huán)境下培養(yǎng)16-18小時(shí)，整個(gè)樣吏孔 板在合適的條件下培養(yǎng)過夜后，分別取3ul的刃天青染料溶液(Sigma， MO) 加到每一個(gè)供試孔中。培養(yǎng)時(shí)間如下S. mutans培養(yǎng)l小時(shí)，C. albicans 培養(yǎng)2小時(shí)，P. gingivalis培養(yǎng)24小時(shí)。根據(jù)顏色從青藍(lán)——紅紫——^分 紅的變化情況，可以判定孔中的真菌是否被樣品抑制。結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)了 5種中藥材具有抗真菌活性,其中有2種藥材活性較強(qiáng)。
權(quán)利要求
1一種從植物提取物中篩選或檢測抗菌活性物質(zhì)的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)制備植物提取物，或在此基礎(chǔ)上建立提取物庫，或通過各種分離提純手段得到的組分或成分；(2)按照不同細(xì)菌或真菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)；(3)將每種待測樣品加入細(xì)菌或真菌培養(yǎng)液；(4)在細(xì)菌或真菌培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12～24小時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)；(5)在每個(gè)培養(yǎng)液中加入刃天青指示劑；(6)根據(jù)刃天青的顏色變化判斷細(xì)菌的存活，由此判斷該植物提取物組分或成分是否有抑菌活性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從植物提取物中篩選或檢測抗菌活性物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟(1)制備植物提取物，或在此基礎(chǔ)上建立提取物庫，或通過分離提純得到的組分或成分；(2)按照不同細(xì)菌或真菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)；(3)將每種待測樣品加入細(xì)菌或真菌培養(yǎng)液；(4)在細(xì)菌或真菌培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12～24小時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)；(5)在每個(gè)培養(yǎng)液中加入刃天青指示劑；(6)根據(jù)刃天青的顏色變化判斷細(xì)菌的存活，由此判斷該植物提取物組分或成分是否有抑菌活性。本方法操作簡便，所需實(shí)驗(yàn)器材簡單，工作量少，得到的結(jié)果很明顯；可以快速篩選出具有抗菌活性的植物提取物，并從中快速篩選抗菌活性組分與成分，為藥物的研究提供基礎(chǔ)；也可用于植物抗菌活性成分的檢測。
文檔編號C12Q1/18GK101161821SQ20071007789
公開日2008年4月16日 申請日期2007年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月16日
發(fā)明者英 周, 錢利安, 黃赤夫 申請人:貴州大學(xué)