專利名稱：：微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細胞的檢測方法以及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于癌診斷的、基于基因表達分析來檢測具有微衛(wèi)星不穗定性的細胞的方法。
背景技術(shù)：
：據(jù)報道通過人類基因組計劃闡明的驚人發(fā)現(xiàn)之一是人基因組中含有的基因數(shù)比預(yù)測少的多，只有25000個左右。這個基因數(shù)和更低等生物相比幾乎沒有差異，不能充分解釋人的復(fù)雜的腦系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)統(tǒng)的功能。所以認為在高等動物的復(fù)雜的生物功能中，來自l個基因的多種的表達結(jié)構(gòu)起著重要的作用。來自1個基因的mRNA以及蛋白質(zhì)的表達的多樣性主要是通過mRNA轉(zhuǎn)錄、或者RM加工階段的選擇性啟動子的利用、或者選擇性剪切進行控制的(參見非專利文獻1)。選擇性剪切是指在mRM前體中多個內(nèi)含子存在的情況下，通常通過在多種剪切部位間發(fā)生在相互鄰接的剪切部位間進行的剪切反應(yīng)，由1個mRNA前體產(chǎn)生多種成熟的niRNA(剪切變體)的機制。另一方面，選擇性啟動子是指存在控制1個基因的轉(zhuǎn)錄的選擇性的多個啟動子。在選擇性啟動子存在的情況下，由于在這個基因上存在多個轉(zhuǎn)錄啟點，結(jié)果生成了具有不同的5'末端序列的多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。最近，報道說基于寡核苷酸帽法cDNA文庫中含有的1780295種的完整長cDNA序列進行的檢索，結(jié)果令人吃驚地發(fā)現(xiàn)在美國NCBI的RefSeq數(shù)據(jù)庫(http:〃ncbi.nih.gov/RefSeq/;轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相關(guān)數(shù)椐庫)中登記的基因中有約52%的基因在選擇性啟動子的控制之下，平均每1個基因存在3.1個選擇性啟動子(參見非專利文獻2)。已知通過這樣的由1個基因進行多種表達，衍生出在進化的過程中的生物的多樣性和復(fù)雜的生物功能，另外一方面，導(dǎo)致在個體中的異常蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和蛋白質(zhì)自體缺陷，其結(jié)果有時誘發(fā)細胞癌變(參見非專利文獻3)。對于遣傳性非息肉性大腸癌(Hereditarynon-poliposiscolorectalcancer;HNPCC)，通過從1993年到1995年分離的錯配修復(fù)相關(guān)的各種基因的發(fā)現(xiàn)，對其在遺傳學(xué)上的理解取得理飛躍性的進步。錯配修復(fù)機制是指識別DNA復(fù)制和基因重組時在DNA上產(chǎn)生的異常的堿基匹配(錯配)，將其除去加以修復(fù)的機制。已知在家族性肺瘤中最具代表性的疾病之一的HNPCC中，90%以上的情況下，作為錯配修復(fù)系統(tǒng)缺陷的反映的結(jié)果，其腫瘤組織的DNA中微衛(wèi)星不穗定性(MicrosatellUeinstability;MSI)呈陽性(參見非專利文獻4)。微衛(wèi)星是指2~5個堿基對的重復(fù)單位反復(fù)重復(fù)數(shù)次到數(shù)十次的重復(fù)序列，其不穗定性是指它們的重復(fù)數(shù)變得異常地少的現(xiàn)象。MSI通常能夠通過采用PCR法的微衛(wèi)星標記(BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250等)的分析實現(xiàn)檢測，所以MSI的檢測成為在HNPCC診斷時的一個輔助(參見非專利文獻5)。此外，在1997年的MSI檢測相關(guān)國際交流會議中，將檢測出這些標記中的2個以上的不穩(wěn)定性的腫瘤定義為MSI-H(檢測出腫瘤中30%以上的MSI的狀態(tài))，判定具有臨床病理性特征，癌的基因診斷多數(shù)根據(jù)致病基因的突變解析的結(jié)果。不過作為家族性腺痛性息肉病(Familialadenomatouspolyposis;FAP)的致病基因的APC基因等是不同的，在HNPCC的情況下，已經(jīng)確定了5個(hMSH2、hMLHl、hPMSl、hPMS2、以及hMSH6)致病基因，不過在這些致病基因有突變的情況下，發(fā)病的比例(浸透率；penetrancerate)也不是100%，所以在美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)的分類中，基于上述致病基因的突變進行的HNPCC的基因診斷現(xiàn)在尚且未達到臨床水平，處于研究水平階段.也有人提出了針對hMLHl等癌相關(guān)基因進行基因組上的基因突變和甲基化檢測，以此作為指標的癌檢測方法的方案(專利文獻1以及2)。不過疾病覆蓋率不太高，此外在簡便性以及迅速性方面也有問題。所以亟需開發(fā)出用于包括HNPCC在內(nèi)的癌診斷的、簡便并且高可靠性的好的細胞檢測方法。認為如果公開發(fā)能夠判斷癌發(fā)病的基因表達水平的細胞檢測方法，因為能夠確認檢測時的細胞的基因表達狀態(tài)，所以能夠用于實時地檢測細胞的突變。不過尚未開發(fā)出這樣有用的檢測方法。專利文獻1:特開2005-304497號公報專利文獻2:特表2002-533061號公報非專利文獻1:LandryJ.R.etal.，TrendsinGenetics,(2003)19(11)p.640-648非專利文獻2:KimuraK.etal.，GenomeResearch,(2006)16:p，55-65非專利文獻3:BrinkmanB.M.,Clin.Biochem.，(2004)37(7):p.584-594非專利文獻4:LiuB.etal.，NatureMed.，(1996)2:p,169-174非專利文獻5:LaihoP.etal.，CancerResearch,(2002)62:p.1166-1170非專利文獻6:DengG.etal.，CancerResearch,(1999)59:p.2029-203
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的問趙本發(fā)明的目的是提供能夠用于癌診斷的、基于基因表達分析的細胞的檢測方法.解決問趙的方法本發(fā)明人等為了解決上述問題，反復(fù)努力研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由人MLHl基因(hMLHl基因)表達至少3種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體(變體1、變體2、變體3)，此外在顯示微衛(wèi)星不穗定性的癌細胞中，與其中主要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變體1相比，變體3的表達量相對增加，由此完成了本發(fā)明。即、本發(fā)明包含下述內(nèi)容。[1]基因表達分析方法，特征在于，測定生物試樣中的在5'末端含有序列號1所示的堿基序列的人MLH1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、以及在5'末端含有序列號2所示的堿基序列的人MLH1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達量，通過將其進行比較，檢測顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細胞。在該方法中，能夠使用實時PCR法測定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達量。使用實時PCR法的測定可以使用TaqMan(注冊商標)探針法進行。在本發(fā)明的方法中優(yōu)選使用下述的(a)以及(b)的引物對進行測定(a)引物對:其是由至少含有序列號1所示的堿基序列上的1~204位的外顯子1部分的一部分的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，以及(b)引物對其是由至少含有序列號2所示的堿基序列上的1~91位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。作為適合上述(a)以及(b)的引物對的例子可以列舉作為由序列號6所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合的引物對(a)、以及作為由序列號8所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合的引物對(b)。使用這些引物對進行測定時，在利用TaqMan(注冊商標)探針法的情況下，可以使用在一端添加了熒光物質(zhì)，另一端添加了消光物質(zhì)的序列號9所示的堿基序列構(gòu)成的探針。用上述本發(fā)明的方法檢測的顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細胞多數(shù)情況下是癌細胞.該癌可以是大腸癌。此外，這種大腸癌可以是遺傳性非息肉性大腸癌。含有下述的(a)以及(b)的引物對的、用于檢測顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細胞的基因表達量的分析用引物組(a)引物對其是由至少含有序列號1所示的堿基序列上的1~204位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，以及(b)引物對其是由至少含有序列號2所示的堿基序列上的1~91位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15-50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。含有下述的(a)以及(b)的引物對的、用于檢測顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細胞的基因表達量分析用試劑盒。(a)引物對其是由至少含有序列號1所示的堿基序列上的1~204位的外顯子1部分的一部分的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，以及(b)引物對其是由至少含有序列號2所示的堿基序列上的1~91位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。該試刑盒中含有的引物對(a)以及(b)優(yōu)選引物對(a)是由序列號6所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，引物對(b)是由序列號8所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。該試劑盒還可以含有在一端添加了熒光物質(zhì)、另一端添加了消光物質(zhì)的序列號9所示的堿基序列構(gòu)成的探針。作為該試劑盒的檢測對象的上述細胞優(yōu)選是癌細胞。特別是該試劑盒可以作為癌診斷用試劑盒使用，還可以作為大腸癌診斷用試劑盒使用，特別是作為遺傳性非息肉性大腸癌診斷用試劑盒使用。發(fā)明的效果本發(fā)明的檢測方法即使針對僅僅含有少量癌細胞的生物試樣也能夠簡便并且清楚地檢測hMLHl基因的表達狀態(tài)，能夠迅速并且簡便地檢測顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細胞(特別是、癌細胞)。圖l是表示hMLHl基因的3種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體的外顯子結(jié)構(gòu)的圖。圖2是表示在6種癌細胞林中的hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體1以及3的表達量的圖。黑色條型表示變體l、白色條型表示變體3。圖2的下半頁表示的是上半頁圖所示的各癌細胞林中變體1和變體3的表達量的比較結(jié)杲，將變體1的表達量比變體3的少表示為VI<V3，將變體1未能檢測到，僅僅檢測到變體3，表示為Vl(-)，V3(+)，將變體1的表達量比變體3多表示為VI>V3。此外，圖2的下半頁中，微衛(wèi)星不穗定性(MSI)的陽性為(+)，陰性為(-)，并且hMLHl基因的啟動子區(qū)域中確認有甲基化為(+)，未確認有為(-)。序列表序列號6~8以及10~12是引物。序列號9是探針.具體實施方式下面詳細說明本發(fā)明。人MLH1基因(hMLHl基因)是大腸桿菌(E.coli)的DNA錯配修復(fù)基因mutL的人等同物(相同體)。hMLHl基因作為識別在遺傳性非息肉性大腸癌(HNPCC)中高頻性突然突變的基因座已經(jīng)為人所知。hMLHl基因的mRNA的RefSeq序列公開在GenBank登記號NM000249中，在本說明書中為了參照該序列，表示為序列號13。該hMLHl基因的mRNA的RefSeq序列(序列號13)中含有hMLHl基因中所含有的19個外顯子部分。在本發(fā)明中，作為hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變體(variant;突變體)，除了與作為主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的上述RefSeq序列幾乎一致的變體1之外，發(fā)現(xiàn)還存在變體2以及變體3(圖1)。該變體1在其5'末端含有序列號1的堿基序列(外顯子l+2)，之后連接著hMLHl基因的外顯子3~19部分(與序列號13的第268~2524位堿基相當(dāng))。變體2具有與變體1幾乎相同的外顯子結(jié)構(gòu)，但在外顯子2部分(序列號5)的5'末端缺失5個堿基。另一方面，因為變體3來自從變體1更后方的約300bp的轉(zhuǎn)錄啟點開始轉(zhuǎn)錄而得到的mRM前體，所以其5'末端含有和變體1不同的序列號2的堿基序列(外顯子l+2)，其后面連接有和變體1以及2共同的外顯子3~19部分。因為變體l的外顯子l部分中含有翻譯啟始部位ATG，所以推測變體3編碼的蛋白質(zhì)與變體1編碼的蛋白質(zhì)至少在5'末端的氨基酸序列上不同，是作為不完整的蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的或者根本不產(chǎn)生。本發(fā)明中還表現(xiàn)出了在大腸癌等的癌細胞、特別是顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細胞中，與上述的變體1的表達量相比較，變體3的表達量相對增加。因為預(yù)測在生物內(nèi)通常變體l的表達量最多，所以這樣的hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之間的表達重的比率的變化顯示生物試樣中的細胞中hMLHl基因的表達狀態(tài)的異常。所以由此認為這種異常與細胞中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性以及癌變有關(guān)。本發(fā)明的方法是基于以上發(fā)現(xiàn)的基因表達分析方法，其特征在于，測定在生物試樣中的變體1(在5'末端含有序列號1所示的堿基序列的人MLH1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)、以及變體3(在5，末端含有序列號2所示的堿基序列的人MLH1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)的表達量，通過將其進行比較檢測顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細胞。在本發(fā)明中，生物試樣可以是從人受試者回收到的任意的組織、細胞或者體液。這樣的生物試樣可以是例如皮膚、粘膜組織、消化道組織等，也可以是血液、淋巴液、唾液、精液等。更優(yōu)選的生物試樣特別是腫瘤、癌組織、或者癌變疑似組織。生物試樣也可以是建立品系的培養(yǎng)細胞。特別優(yōu)選的生物試樣是來自大腸癌的組織或者細胞、或者也可以大腸癌(并非是限定，例如、遺傳性非息肉性大腸癌)的疑似大腸組織或者細胞等。本發(fā)明中用語"轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物"包含從某些基因轉(zhuǎn)錄得到的mRM前體、該邁RNA前體的修飾物(通過加帽結(jié)構(gòu)添加或者多聚腺苷酸化進行量修飾的產(chǎn)物等)、成熟mRNA、以及從成熟RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA。作為轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，當(dāng)指的是RNA的情況下，為了指定該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而將各序列號等所示的堿基序列中的"T(胸腺嘧啶)"換成"U(尿嘧啶)"。本發(fā)明中"轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(變體)的表達量"指的是生物試樣中的由該基因表達得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在量。生物試樣中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體1以及變體3的表達量的測定可以使用本
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內(nèi)公知的方法，對這樣的表達量的測定沒有限定，可以使用例如實時PCR法、半定量的RT-PCR法、使用毛細管電泳裝置的竟爭的PCR法、使用DNA芯片或者微陣列的基因表達量測定法、Northern印記法等測定從生物試樣中制備得到的核酸試樣(例如RNA、cDM)中的各轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在量。從生物試樣制備核酸試樣可以按照常規(guī)方法進行，也可以在分析前進行純化。本發(fā)明中實施的基因組DNA或RNA的制備可以按照J.Sambrooketal.(Eds.)，MolecularCloning,3nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,(2001)等的分子生物學(xué)領(lǐng)域的標準的試驗書進行。變體1以及變體3的表達量的測定只要能區(qū)分開不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，進行定量，可以使用任何方法。本發(fā)明中分別檢測例如、變體1和變體3間具有很大差別的外顯子1部分，進行定量的方法很方便。作為一個例子。對使用實時PCR法的表達量測定進行詳細的說明。實時PCR法是實時地監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物的增加，進行解析的技術(shù)。通常使用熱循環(huán)儀和分光熒光光度計一體化的實時PCR儀進行。實時PCR和以往的PCR法相比，不需要進行電泳，所以能夠迅速并且簡便地解析，而且對DNA和RM的定量性優(yōu)良。通過實時PCR法進行定量的原理如下所示。首先，將梯度稀釋的已知量的DNA作為標準試樣，一邊進行PCR，一邊進行PCR產(chǎn)物量的監(jiān)測，讀取針對各稀釋樣在指數(shù)級擴增區(qū)域達到的一定的擴增產(chǎn)物量的循環(huán)數(shù)(thresholdcycle;Ct值)，將其作為橫軸坐標，然后將標準試樣的初期模板量作為縱軸坐標，制作標準曲線。對于含有未知濃度的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的待測核酸試樣，一邊進行和標準試樣相同的條件下的PCR反應(yīng)，一邊進行監(jiān)測，求出達到與上述相同的擴增產(chǎn)物量的循環(huán)數(shù)(Ct值)。待測核酸試樣得到的Ct值與上述制作的標準曲線擬合，能夠算出待測核酸試樣中含有的初期模板量。這個初期模板量相當(dāng)于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達量。對實時PCR中的PCR產(chǎn)物量的監(jiān)測(檢測)沒有限定，優(yōu)選能夠使用熒光物質(zhì)來進行。作為這種熒光監(jiān)測法沒有限定，可以使用例如intercalater、TaqMan(注冊商標)探針法等公知的技術(shù)。intercalater法是通過將與雙鏈DNA結(jié)合的發(fā)出熒光的物質(zhì)(intercalater法)SYBR(注冊商標)GreenI添加到實時PCR反應(yīng)系中的方法。在該方法中，intercalater結(jié)合到PCR反應(yīng)合成的雙鏈DNA上，經(jīng)過激發(fā)光的照射發(fā)出熒光，通過測定其熒光強度，能夠監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物的生成量。這種intercalater法，不需要制備用于任意的雙鏈DNA檢測的針對每個基因的檢測用探針，試驗成本低廉，反應(yīng)體系構(gòu)建也很容易，不過檢測特異性不那么高。而另外一方面，TaqMan(注冊商標)探針法是通常用將熒光物質(zhì)(FAM等)標記了5'末端，消光物質(zhì)(TAMRA等)標記(添加)了3'末端的寡核苷酸探針(TaqMan(注冊商標)探針)添加到實時PCR反應(yīng)系的方法。這種方法中，TaqMan(注冊商標)探針在退火步稞與模板DNA特異性地雜交，此時，因為在探針上共存有熒光物質(zhì)和消光物質(zhì)，所以，即使激發(fā)光照射熒光物質(zhì)，也能抑制熒光的發(fā)生。不過在后續(xù)的延伸步驟中，通過TaqDNA聚合酶具有的5'—3'核酸外切酶活性將與模板雜交的TaqMan(注冊商標)探針依次分解，將熒光物質(zhì)從探針上釋放,解除了消光物質(zhì)的抑制，發(fā)出熒光。通過測定該熒光強度能夠監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物的生成量。這種TaqMan(注冊商標)探針法試驗成本高，不過，檢測特異悻高，定量性也特別優(yōu)良。在本發(fā)明的方法中，為了測定各變體的表達量，可以適當(dāng)選用基于上述的實時PCR法的定量法。這種情況下，對PCR擴增產(chǎn)物的監(jiān)測沒有限定，可以適當(dāng)使用TaqMan(注冊商標)探針法。在TaqMan(注冊商標)探針法中，使用在多聚核苷酸的一端添加(一般在5'末端)熒光物質(zhì)，另一端(一般在3'末端)添加消光物質(zhì)的TaqMan(注冊商標)探針。這種探針是設(shè)計用于在實時PCR中生成的PCR擴增產(chǎn)物退火的。作為添加到這種探針上的熒光物質(zhì)可以使用FAM、VIC，作為消光物質(zhì)可以使用TAMRA等。對于實時PCR的反應(yīng)條件，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以適當(dāng)加以設(shè)定，也可以參照后述的實施例中記栽的反應(yīng)條件。在本發(fā)明的方法中，為了各變體的表達量的測定，分別使用用于變體1的特異性PCR擴增的下述引物對(a)、和用于變體3特異性PCR擴增的下述引物對(b)，能夠擴增各變體。(a)引物對由至少含有序列號1所示的堿基序列上的、1~204位的外顯子1部分的一部分(優(yōu)選10個堿基以上長度、例如、10~30個堿基長度)的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，以及(b)引物對由至少含有序列號2所示的堿基序列上的、1~91位的外顯子l部分的一部分(例如、10~30個堿基長度)的連續(xù)15~50個堿基的械基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。這些引物對(a)以及(b)之中，優(yōu)選的具體例如下所述。引物對(a):由序列號6所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合、引物對(b):由序列號8所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。使用由這些序列號6~8的序列構(gòu)成的引物的組合，基于TaqMan(注冊商標)探針法，通過實時RNA測定上述變體1以及3的表達量的情況下，作為TaqMan(注冊商標)探針，特別優(yōu)選由一端添加(一般在5'末端)了熒光物質(zhì)、另一端添加(一般在3'末端)了消光物質(zhì)的序列號9所示的堿基序列構(gòu)成的探針。使用這些引物以及探針進行變體的表達量測定，例如、通過含有下述步驟進行'使用序列號6所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物，由來自生物試樣的cDNA進行變體1的擴增反應(yīng)的步驟、使用序列號8所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物，由來自生物試樣的cDNA進行變體3的擴增反應(yīng)的步槺、'監(jiān)測各個擴增反應(yīng)中PCR擴增產(chǎn)物量，由此計算出生物試樣中的變體1和變體3的初期含有重的步驟。并且，在該監(jiān)測步驟中通過向各個擴增反應(yīng)系中添加TaqMan(注冊商標)探針，能夠從得到的熒光強度測定出PCR擴增產(chǎn)物量。在本發(fā)明的方法中，進行如上所述的變體1以及變體3的表達量的測定后，通過將其進行比較，能夠檢測顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細胞。具體而言，比較變體1和變體3，當(dāng)與變體1的表達量的測定值相比，變體3的表達量的測定值高的情況下，表示所研究的生物試樣中含有顯示微衛(wèi)星不穗定性細胞的可能性高。并且如果檢測不到變體l，僅僅檢測到變體3的情況下，由于變體3的表達量為多，也能判斷含有顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細胞。這樣，在本發(fā)明的方法中，能夠針對來自受試者回收的生物試樣進行顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細胞的存在的檢測。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是基因組上的2~5個堿基的重復(fù)單位(微衛(wèi)星)的重復(fù)數(shù)異常少的現(xiàn)象。高度的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在全部大腸癌中有12~16%、在遣傳性非息肉性大腸癌中有90%以上。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性實際上在子宮癌、胃癌、食道癌、多重癌、淋巴系統(tǒng)腫瘤、扁平上皮癌等各種癌中被觀測到，與癌的相關(guān)性強。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是由于DNA修復(fù)機制的缺陷造成的，所以推測顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的情況具有癌多發(fā)傾向性和預(yù)后不良。所以通過本發(fā)明的方法檢測到顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細胞的情況下，可以判斷該細胞是癌細胞的可能性高。這樣檢測的顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細胞可以是癌細胞，具體的而言，例如大腸癌、遣傳性非息肉性大腸癌、子宮癌、胃癌、食道癌、多重癌、淋巴系統(tǒng)腫瘤、扁平上皮癌、子宮內(nèi)膜癌、胰癌，優(yōu)選大腸癌，特別是遺傳性非息肉性大煬癌。這樣以來本發(fā)明涉及測定生物試樣中hMLHl基因的變體1和變體3的表達量，通過將其進行比較，進行癌細胞的檢測的方法。此外，本發(fā)明涉及在上述方法中優(yōu)選使用的含有引物對(a)、(b)的引物組，即，該引物組是用于檢測顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細胞的基因表達量分析用的、下述(a)以及(b)所示的各引物的組合。(a)引物對由至少含有序列號1所示的堿基序列上的、1~204位的外顯子1部分的一部分(例如、10~30個堿基長度)的連續(xù)15~50個堿基的械基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合、以及(b)引物對由至少含有序列號2所示的堿基序列上的、1~91位的外顯子1部分的一部分的(例如、10~30個堿基長度)的連續(xù)15~50個械基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。作為這些引物組的具體例子，可以列舉:含有序列號6所示的堿基序列構(gòu)成的引物、序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號8所示的械基序列構(gòu)成的引物的組合。這些引物可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的寡核苷酸合成技術(shù)或者以序列號1或者2等上述hMLHl基因變體1以及3內(nèi)的序列作為模板通過PCR法等容易地進行制備。并且本發(fā)明中的"引物"只要能用于PCR等中，可以標記適合檢測用的標記就行。例如，本發(fā)明涉及的引物可以是在5'末端或者y末端添加了熒光色素、酶、蛋白質(zhì)、放射性同位體、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、生物素等的標記的多聚核苷酸。在本發(fā)明中，通過向多聚核苷酸添加而用于檢測用等的寡核苷酸(例如、用于突變檢測的invader法中的與模板無關(guān)的序列"flap"等)也包含在"標記"中。此夕卜，本發(fā)明涉及含有上迷引物對(a)以及(b)的、用于檢測顯示微衛(wèi)星不穗定性的細胞的基因表達量分析用試劑盒。該試劑盒中還可以含有一端添加了熒光物質(zhì)、另一端添加了消光物質(zhì)的序列號9所示的堿基序列構(gòu)成的探針的TaqMan(注冊商標)探針。該試劑盒的檢測對象優(yōu)選是癌細胞，特別是可以用于顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的癌細胞的檢測用。所以，本試刑盒可以用作癌診斷用試劑盒。此外，本試劑盒可以用作大腸癌診斷用試刑盒、特別是遺傳性非息肉性大腸癌診斷用試劑盒。實施例下面使用實施例對本發(fā)明進一步具體地加以說明。不過，本發(fā)明的技術(shù)的范圍不局限于這些實施例中。[實施例1]hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體的探索本發(fā)明人等為了研究hMLHl基因通過利用選擇性剪切或者選擇性啟動子而作為多個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體(突變體)進行表達的可能性，進行了下述試驗，如非專利文獻2所記栽的基于使用寡核苷酸帽法構(gòu)建的cDNA文庫(SuzukiandSugano(2003)MethodsMol.Biol.221:p.73-91)得到人基因完全長cDNA，闡明含有5'末端的人完全長cDM的堿基序列信息有大約1800000種。這些序列信息登記于GenBank中，一般都是公開的.本發(fā)明人等從GenBank收集這些序列信息，進行multi-FASTA-format化，針對這樣得到的序列數(shù)據(jù)，將hMLHlmRNA的RefSeq序列(NCBIReferenceSequence)(GenBank登記號NM_000249;序列號13)作為query序列，用blastn程序進行同源性檢索，將選中的序列中的E-value在101。以下的序列作為hMLHl相關(guān)cDNA序列。然后提取GenBank的人基因組序列數(shù)據(jù)的Build35的3號染色體中與hMLHl基因相當(dāng)?shù)膮^(qū)域的堿基序列，將該hMLHl基因的基因組序列和上述那樣選擇出的每個hMLHl相關(guān)cDM序列用BLAST程序的bUseq進行處理，得到分別比對的結(jié)果。從這樣得到的hMLHl基因組序列與各hMLHl相關(guān)cDM序列的比對中，選擇出被認為能與上迷的hMLHlRefSeq序列上的2位的外顯子部分(畫—000249的第177~267位堿基序列)更靠前面的區(qū)域內(nèi)也能很好地比對(alignment)的部分，并且比對部分中一致率達到98%以上的基因。解析選擇的比對序列時，發(fā)現(xiàn)hMLHl相關(guān)cDNA序列和hMLHl基因組序列的對應(yīng)關(guān)系有3種模式。即，判斷在hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中存在至少3種變體(變體1~3)。這3種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5'末端側(cè)的結(jié)構(gòu)如圖1所示。在圖1中僅僅表示了各轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中所舍的19個外顯子區(qū)域中的最初的3個。如圖1所示，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變體1從5'末端側(cè)開始依次連接著外顯子1部分、外顯子2部分、外顯子3部分，在外顯子1部分中含有翻譯啟始部位(ATG)。通過該解析可知作為hMLHl基因的RefSeq序列的NM000249堿基序列，在該變體1的外顯子l部分的5'末端存在少量的缺失。與此相對，變體2具有和變體1幾乎相同的外顯子結(jié)構(gòu)，不過外顯子2部分和變體1的外顯子2部分相比，在5'側(cè)短了5個堿基，是選擇性剪切變體，此外，在變體3中，外顯子2部分以及外顯子3部分與變體1相同，不過，外顯子1部分是與變體1以及2不完全相同的序列。由此可知hMLHl基因通過選擇性啟動子受到控制，變體3的結(jié)果是在比變體1靠近后面約325bp的轉(zhuǎn)錄啟點開始轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過剪切后生成的。在上迷解析中表現(xiàn)出，在所選擇的hMLHl相關(guān)cDNA序列中，變體1是141個(75%)、變體2是14個(7.4%)、變體3是33個(17.6%)，變體1是最主要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。分類為各變體的hMLHl相關(guān)cDNA序列表示在表1中。表1中，各hMLHl相關(guān)cDM序列如GenBank登記號所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本實施例中發(fā)現(xiàn)的變體1以及3的外顯子1~2部分的堿基序列如表2所示，表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>[實施例2]通過實施例1的解析可知作為hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在3種的變體。雖然到目前為止已知hMLHl基因是細胞癌變相關(guān)的基因，不過這次為首次闡明存在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體，推測這些變體和癌之間具有相關(guān)性。所以然后著眼于變體1以及3，通過實時PCR測定其細胞內(nèi)表達量，將癌細胞和正常細胞進行比較。作為待測材料，從ATCC(AmericanTypeCultureCollection)以及財團法人人類科學(xué)振興財團研究資源銀行購買的培養(yǎng)細胞林LoVo、COLO320、C0L0201、SW48、RKO、HCT116(全部是來自人大腸癌細胞)。將各細胞在添加了10%FBS(Invitrogen公司)的AdvancedDMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中培養(yǎng)。從培養(yǎng)后的細胞中使用QIAGEN公司的RNeasyTissueKit提取總RNA。將提取的總RNA在后述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及實時PCR中作為待測試樣使用。此外，設(shè)計在實時PCR中使用的引物以及探針。引物以及探針的設(shè)計可以使用實時PCR儀ABIPRISM7900HT(AppliedBiosystems公司)附帶的PrimerExpress軟件進行。從輸入各種條件得到的引物以及探針的檢索結(jié)果中選擇出分值高的最前面的IO組，用這些進行實際的實時PCR來進行評價的時候，因為都得到很好的結(jié)果，所以使用最高分值的引物以及探針的組合進行下述的試驗。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(cDNA合成反應(yīng))中使用SuperscriptIIIReverseTranscripUse(Invitrogen公司)。首先向管中加入2.Ojil的寡聚(dT)2。引物(50fiM)、2.Ojig的總RNA、4.Ojil的dNTPs(5mM)，加入DEPC處理水，使總量達到26jil。然后將該混合物在65"C下溫育5分鐘后，迅速移到冰上，加入5xFirstStrandBuffer(8.Opl)、0.1MDTT(2.0|il)、Superscript"IIIReverseTranscriptase(2.Ojil)、DEPC處理水(2.Ojil)，使總量達到40pl。將其用渦旋器混合后，進行離心，將溶液收集到管子的底部，在50t:溫育60分鐘。然后，通過在？ox:溫育15分鐘終止反應(yīng)。然后，用上述得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，使用ABIPRISM7900HT(AppliedBiosystems社)，通過實時PCR，嘗試對來自各細胞的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中含有的變體l、變體3分別進行定量。為了進行變體1的PCR擴增，混合作為模板DNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物l.Opl、lxmaster-混合物lOjil、5.OjiM正義引物(5'-CAGCGGCCAGCTAATGCTAT-3';序列號6)3.5pl、5.OjiM反義引物(5'-CCATTGTCTTGATCTGAATCAACTTC-3';序列號7)3.5pl、5.OjiMTaqMan(注冊商標)探針(5'-CAAGTATTCAAGTGATTGTTAAAGAGGGAGGCC-3';序列號9)5.Opl、超純水1.Ojil，制備總量為20>il的反應(yīng)液。為了變體3的PCR擴增用，同樣地，混合作為棋板DM的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物l.Ojil、"master-混合物lOjil、5.OnM正義引物(5'-GGGTTGTTTGGAGTTTTAGATGCA-3';序列號8)3.5pl、5.OjiM反義引物(5'-CCATTGTCTTGGATCTGAATCAACTTC-3';序列號7)3.5|il、5.0jiMTaqMan(注冊商標)探針(5'-CAAGTATTCAAGTGATTGTTAAAGAGGGAGGCC-3。序列號9)5.0jU、超純水l.Onl,制備總量為20jil的反應(yīng)液。此處使用的TaqMan(注冊商標)探針是能夠在變體1以及3共同檢測中使用的探針，是由AppliedBiosystemsJapan株式會社制備的在5'末端標記FAM(熒光物質(zhì))、在3'末端標記TAMRA(消光物質(zhì))的形態(tài)的探針。制備的反應(yīng)液供給ABIPRISM7900HT(AppliedBiosystems公司)，在95C反應(yīng)IO分鐘后，在95X:下15秒，以及在60t:下l分鐘，進行40個循環(huán)的反應(yīng)，然后測定熒光強度，還有，為了制作可以從實時PCR中測定得到的熒光強度計算出試樣中的DNA量的標準曲線，在進行實時PCR前，由來自COLO320細胞株的上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物如下所述那樣預(yù)先制備PCR產(chǎn)物。首先，為了變體1的PCR擴增用，混合作為模板DNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0jil、10xPCR緩沖液5.Ojil、dNTP混合物(各2.5mM)4.Opl、5.OjiM正義引物(5'-CTGGACGAGACAGTGGTGAAC-3';序列號10)3.5pl、5.OjiM反義引物(5'-ATACTGGCTAAATCCTCAAAGGACTG-3';序列號11)3.5pl、ExTaq聚合酶0.25|il、超純水37nl，制備得到總量為50pl的反應(yīng)液。為了變體3的PCR擴增用，除了變更正義引物為序列號12(5/-TTTCTTTACCGCTCTCCCCCG-3')所示的序列之外，按照與上述變體1的PCR擴增用相同的組成制備反應(yīng)液。制備的各反應(yīng)液在951C下反應(yīng)IO分鐘后，在95匸下30秒、在63匸下1分鐘、在72匸下1分鐘，進行35個循環(huán)的反應(yīng)，最后在721C反應(yīng)IO分鐘。對于這樣得到的來自COLO320細胞林的PCR產(chǎn)物測定DNA量后，進行梯度稀釋，將其作為模板DNA與在上述的實時PCR中其他的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一樣地進行擴增。并且，進行與上述相同的熒光強度的測定，根據(jù)得到的值，按照常規(guī)方法制作標準曲線。根據(jù)由上述測定的熒光強度得到的Ct(ThresholdCycle)值、和上述制成的標準曲線，計算出從各細胞提取到的總RNA中含有的初期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的變體1以及3的量。該各變體量的測定值即相當(dāng)于各自的表達量.以上那樣定量的6種大脈癌培養(yǎng)細胞中的變體1以及3的表達量結(jié)果如圖2所示.如圖2所示，對于變體1，在LoVo、HCT116、C0腦0、以及C0L0201細胞中檢測到了表達，在RKO以及SW48細胞中未檢測到表達(檢測限以下)。這些結(jié)果和目前的報道(非專利文獻5)是一致的。另一方面，本發(fā)明人等首次闡明的變體3的表達模式和變體1的表達模式是明顯不同的，在目前的報道未檢測到hMLHl的變體1的表達的RK0細胞和SW48細胞中檢測到了變體3的表達。此外，變體3在LoVo細胞以及HCT116細胞中，與變體l相比，表達量顯著多。該結(jié)果與在實施例1的解析中變體1是hMLHl基因的主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，變體3的表達量少的預(yù)測相反。速樣，變體3比變體1多表達的LoVo以及HCT116細胞、以及檢測到變體3但是檢測不到變體1的RK0細胞以及SW48細胞在使用文獻信息進行分析時，發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)呈現(xiàn)陽性(圖2、非專利文獻5)。此外，根據(jù)非專利文獻5的記栽研究左右hMLHl基因的表達量、同基因的啟動子區(qū)域的曱基化程度的時候，只有檢測到變體3但未檢測到變體l的RK0細胞以及SW48細胞在hMLHl基因的啟動子區(qū)域中檢測到了甲基化。即可以認為hMLHl基因的啟動子區(qū)域中的甲基化抑制變體l的表達，不抑制變體3的表達。如果考慮到已知hMLHl基因與遺傳性非息肉性大腸癌(HNPCC)相在內(nèi)的各種癌中高頻率地出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性陽性，可以認為相對于hMLHl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體l，變體3的表達量的相對增加，和癌中MSI陽性以及啟動子區(qū)域的甲基化有關(guān)。對于變體3的表達條件和其表達所影響的癌癥發(fā)病的具體作用并不清楚。認為與其說是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體3自體的MSI，進一步對癌發(fā)病帶來惡劣影響，不如說變體1的表達量的低下或者喪失可能是造成誘發(fā)MSI的重要原因。不過，不論如何對這些機制進行推測，可以明確與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體1相比較，變體3的量的表現(xiàn)相對增加的情況表示存在伴隨MSI的癌細胞。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的檢測方法能夠在很早期的癌檢測樣本等中，簡便并且清楚地檢測到大煬癌等的癌細胞的存在。本方法得到的檢測結(jié)果在以HNPCC代表的伴隨微衛(wèi)星不穗定性的癌癥的早期診斷中可以作為有用的判斷材料。序列表<110>日立公司<120〉微衛(wèi)星不穩(wěn)定性細胞的檢測方法以及試劑盒<130〉H600399<160〉14<歸PatentlnVer.2.1<210>1<211〉295<212>DNA<213〉智人(Homosapiens)<220><223>發(fā)明人高橋亮介；永井啟一<400>1幼gaacgtgagcacgaggcactgaggtgattggctg幼ggcacttccgttgagcatctag60acgtttccttggctcttctggcgccaaaatgtcgttcgtggcaggggttattcggcggct120ggacgagacagtggtg咖cgcatxgcggcgggggaagttatccagcggccagctaatgc180tatcaaagagsttgattgaLgaactgtttagatgcaaaatccacaagtattcaagtgattgt240taaagagggaggcctgaagttgattC3gatccaagacaatggcaccgggsitc鄉(xiāng)295〈210〉2〈211>213<212〉DNA<213>智人<400>2gcatgcccacaacggcggaggccgccgggtttccgcagaccgtgtgtttctttaccgctcgttttagatgcaaaatccacaagtattcaaattcagatccaagacaatggcaccgggatctccctgacgtgccagtcaggccttctcctt60tcccccgagaccttttaagggttgtttgga120gtgattgttaaagagggaggcctgaagttg180agg213<210>3<211>204〈212>DNA<213>智人<400〉3aagaacgtgagcacgaggcactgaggtgatacgtttccttggctcttctggcgccaaaatggacgagacagtggtgaaccgcatcgcggctatc幼卿gatg3ttg3gssctgtggctgaaggcacttccgttgagcatctag60gtcgttcgtggc鄉(xiāng)ggttattcggcggct120gggggaagttatccagcggccagctaatgc180204<210>4〈211>122<212>醒<213>智人<400〉4gcatgcccacaacggcggaggccgccgggttccctgacgtgccagtcaggccttctcctt60ttccgcagaccgtgtgtUcUtaccgctctcccccg柳ccttUaagggttgtttgga120gt122<210>5<211〉91<212>DNA<213>智人<400〉5tttagatgcaaaatccacaagtattcaagtgattgUaaagagggaggcctg肌gttgat60tcagatccaagacaatggcaccgggatcagg91<210>6<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述引物<6cagcggccagctaatgctat<210〉7<211>26<212>腿<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述引物<400>7ccattgtcttgatctgaatcaacttc26<210〉8<211〉24<212〉腿<213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述引物<400>8gggttgtttggsgttUagatgca24<210>9<211>33<212>腿〈213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針<400>9caagtattcaagtgattgttaaagagggaggcc33<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物■>10ctggacgagacagtggtgaac21<210>11<211>26<212〉DNA〈213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物■>11atactggctaaatcctcaaaggactg26<210>12<211>21<212>腿<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述引物〈400>12tttctttaccgctctcccccg21〈210>13<211>2524〈212>腿<213>智人<220><221>CDS<222>(61)..(2331)<柳>13attggctgaaggcacttccgttgagcatctagacgtttccttggctcttctggcgccaaa60atgtcgttcgtggcaggggttatteggeggMetSerPheValAlaGlyVallieArgArg1510ctggacgagacagtggtg108LeuAspGluThrValVal15aaccgcategcggcgggggaagttatecagAsnArglieAlaAlaGlyGluVallieGin2025eggccagetaatgetate156ArgProAlaAsnAlalie30aaagagatgattgagaactgtttagatgcaaaatecacaagtattcaa204LysGluMetlieGluAsnCysLeuAspAlaLysSerThrSerlieGin354045gtgattgttaaagagggaggcctgaagUgattcagatecaagacaat252VallieValLysGluGlyGlyLeuLysLeulieGinlieGinAspAsn505560ggcsecggg3tcagg咖g幼gatctggstattgtstgtgasaggttc300GlyThrGlylieArgLysGluAspLeuAsplieValCysGluArgPhe65707580actactagtaaactgcagtectttgaggatttagccagtatttctacc348ThrThrSerLysLeuGinSerPheGluAspLeuAlaSerlieSerThr859095tatggctttcgaggtgaggetttggccageataagecatgtggetcat396TyrGlyPheArgGlyGluAlaLeuAlaSerlieSerHisValAlaHis100105110gttactattacaacgaaaacagetgatggaaagtgtgcatacagagca444ValThrlieThrThrLysThrAlaAspGlyLysCysAlaTyrArgAla115120125agttacteagatggaaaactgaaagcccctcctaaaccatgtgetggc492SerTyrSerAspGlyLysLeuLysAlaProProLysProCysAlaGly130135140aatcaagggacccagateacggtggaggaccttttttacaacatagcc540AsnGinGlyThrGinlieThrValGluAspLeuPheTyrAsnlieAla145150155160acgaggagaaaagetttaaaaaatccaagtgaagaatatgggaaaatt588ThrArgArgLysAlaLeuLysAsnProSerGluGluTyrGlyLyslie165170175ttggaagttgttggcaggtatteagtacacaatgcaggcattagtttc636UuGluValValGlyArgTyrSerValHisAsnAlaGlylieSerPhe180185190teagttaaaaaacaaggagagacagtagetgatgttaggacaetaccc684SerValLysLysGinGlyGluThrValAlaAspValArgThrLeuPro195200205aatgccteaaccgtggacaatattcgctecatetttggaaatgetgtt732AsnAlaSerThrValAspAsnlieArgSerliePheGlyAsnAlaVal210215220agtcgagaactgatagaaattggatgtgaggataaaaccetagccttc780SerArgGluLeulieGluIle'GlyCysGluAspLysThrLeuAlaPhe225230235240aaaatgaatggttacatatecaatgcaaactacteagtgaagaagtgc828LysMetAsnGlyTyrlieSerAsnAlaAsnTyrSerValLysLysCys245250255atettcttaetcttcateaaccatcgtctggtaga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GinAlaMetArgMet490ValAsnAsplieAsp235TyrValTyrSerHis315GluThrThrTyrAla395lieGinLysSerGlu475ThrAlaValPhe220LysSerGluLeuPro300PheSerLeuThrAla380PheValAspAsnGlu460AspAlaGlyArg205GlyThrValSerPro285GinLeuLysLeuSer365HisLeuThrGluGin445LysSerAlaLeuSerLeuArgGluMetLeu525lie190ThrAsnLeuLysThr270LysAsnHisLeuPro350LeuGinGinGluGlu430SerArgAspCysGin510HisSerLeuAlaAlaLys255SerAsnValGluLeu335GlyThrMetProAsp415MetLeuGlyValThr495GluPheProValPhe240CysLeuThrAspGlu320GlyLeuSerValLeu400LysLeuGluProGlu480ProGluAsnHisSerPhe530ThrLys545TyrGinSerGluProGluGluTyr610TyrPhe625LeuLeulieLeuPheGluGinTyr690ProGly705TyrLysAspGlyPheGluValLeulieProSer595lieSerlieArgSer675lieSerGlyCysTyrLeuLeulie565AlaPro580GlyTrpValGluLeuGluAspAsn645LeuAla660LeuSerSerGlulieProAlaLeuArg725AsnlieLeu740ArgCys755ValAsnProGinTrpAlaLeuAlaGinHisGin535540LeuAsnThrThrLysLeuSerGluGluLeuPhe550555560TyrAspPheAlaAsnPheGlyValLeuArgLeu570575LeuPheAspLeuAlaMetLeuAlaLeuAspSer585590ThrGluGluAspGlyProLysGluGlyLeuAla600605PheLeuLysLysLysAlaGluMetLeuAlaAsp615620lieAspGluGluGlyAsnLeulieGlyLeuPro630635640TyrValProProLeuGluGlyLeuProliePhe650655ThrGluValAsnTrpAspGluGluLysGluCys665670LysGluCysAlaMetPheTyrSerlieArgLys680685GluSerThrLeuSerGlyGinGinSerGluVal695700AsnSerTrpLysTrpThrValGluHislieVal710715720SerHislieLeuProProLysHisPheThrGlu730735GinLeuAlaAsnLeuProAspLeuTyrLysVal745750權(quán)利要求1.基因表達分析方法，其特征在于，測定生物試樣中的在5′末端含有序列號1所示的堿基序列的人MLH1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、以及在5′末端含有序列號2所示的堿基序列的人MLH1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達量，通過將其進行比較，檢測顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細胞。2.權(quán)利要求1記栽的方法，其使用實時PCR法測定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達量。3.權(quán)利要求2記栽的方法，其通過使用TaqMan(注冊商標)探針法進行使用實時PCR法的測定.4.權(quán)利要求1~3的任一項記栽的方法，其中，使用下述的(a)以及(b)的引物對進行測定(a)引物對其是由至少含有序列號1所示的堿基序列上的1~204位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，以及(b)引物對其是由至少含有序列號2所示的堿基序列上的1~91位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。5.權(quán)利要求4記栽的方法，其中，引物對(a)是由序列號6所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，引物對(b)是由序列號8所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。6.權(quán)利要求5記栽的方法，其中，在TaqMan(注冊商標)探針法中，使用一端添加了熒光物質(zhì)、另一端添加了消光物質(zhì)的序列號9所示的堿基序列構(gòu)成的探針。7.權(quán)利要求1~6的任一項記栽的方法，其中，顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細胞是癌細胞.8.權(quán)利要求7記栽的方法，其中，癌是大腸癌。9.權(quán)利要求8記栽的方法，其中，大腸癌是遺傳性非息肉性大腸癌。10.基因表達量分析用引物組，其用于檢測顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細胞，其中含有下述的(a)以及(b)的引物對(a)引物對其是由至少含有序列號1所示的堿基序列上的1~204位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，以及(b)引物對其是由至少含有序列號2所示的堿基序列上的1~91位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。11.基因表達量分析用試劑盒，其用于檢測顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細胞，其中含有下述的(a)以及(b)的引物對(a)引物對其是由至少含有序列號1所示的堿基序列上的1~204位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合，以及(b)引物對其是由至少含有序列號2所示的堿基序列上的1~91位的外顯子l部分的一部分的連續(xù)15~50個堿基的堿基序列構(gòu)成的引物、和與序列號5所示的外顯子2部分的堿基序列上的連續(xù)15~50個堿基的序列互補的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。12.權(quán)利要求ll記栽的試劑盒，其中，引物對(a)是由序列號6所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合；引物對(b)是由序列號8所示的堿基序列構(gòu)成的引物、和序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的引物的組合。13.權(quán)利要求12記栽的試劑盒，其中，還含有一端添加了熒光物質(zhì)另一端添加了消光物質(zhì)的序列號9所示的堿基序列構(gòu)成的探針。14.權(quán)利要求11~13的任一項記栽的試劑盒，其中，上述細胞是癌15.權(quán)利要求14記栽的試劑盒，其是癌診斷用試劑盒。16.權(quán)利要求15記栽的試劑盒，其是大腸癌診斷用試劑盒.17.權(quán)利要求16記載的試劑盒，其是遺傳性非息肉性大腸癌診斷用試劑盒。全文摘要本發(fā)明提供用于癌診斷的、基于基因表達分析的異常的細胞的檢測方法。本發(fā)明的解決方法是提供一種基因表達分析方法，其特征在于，通過測定生物試樣中的在5′末端含有序列號1所示的堿基序列的人MLH1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、以及在5′末端含有序列號2所示的堿基序列的人MLH1基因的測定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達量，將其進行比較，檢測顯示微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的細胞。文檔編號C12Q1/68GK101130819SQ20071008509公開日2008年2月27日申請日期2007年2月28日優(yōu)先權(quán)日2006年8月23日發(fā)明者永井啟一,高橋亮介申請人:株式會社日立制作所