專利名稱：：Nipah病毒的引物和探針及一步法實時RT-PCR檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明專利屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及科研、臨斜口病毒^^亍病學監(jiān)測等工作中使用RT-PCR方法對Nipah病毒RNA的檢測和定量分析。具體是針對Nipah病毒的I物和探針及一步法實時RT-PCR檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：Nipah病毒與人類疾病Nipah病毒(NipahVirus,NiV)是近年來新出現(xiàn)的一種副粘病毒，可引起人和動物急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。Nipah病毒感染于1998~1999年在馬來西亞和新加坡首;W暴發(fā)，最a孟加拉國、泰國和印度"tkitt現(xiàn)。在人類，Nipah病毒引起熱性腦炎并伴發(fā)呼吸系統(tǒng)癥狀，死亡率高。Nipah病毒的儲存宿主被認為是果蝠，人類可通過與蝙蝠直4勤姿觸或與豬等中間宿主接觸而被感染。然而Nipah病毒的病毒學特征和其在A^中傳播的iM亍病學特點等相關(guān)問題仍不清楚。Nipah病毒的斗企測Nipah病毒的檢測方法主要有以下幾種病毒分離與鑒定、血清中和試驗(Serumneutralizationtest,SNT)、酵耳關(guān)免疫吸附檢測(Enzyme-linkedimmunosorbentassays,ELISA)、PCR檢測等。病毒分離是病44生腦炎tt^出、最重要的診斷手段。對于新發(fā)疾病病例，病毒分離是最有價值的工作，但Nipah病4^離需在生物安全4級(P4)^^牛下進行。血清中和i&瞼(Serumneutralizationtest,SNT)和酶聯(lián)免疫吸附檢測(Enzyme—linkedimmunosorbentassays,EUSA)均為免疫學才企測方法，每文感寸生高，但特異性較差，并存在一定的交叉反應(yīng)。制備單克隆抗體可以增加特異性，但成本較高。PCR檢測具有快速、準確的特點，也被廣泛用于對Nipah病毒的檢測。目前已經(jīng)建立的PCR檢測方法有1)Guillaume等6W"犯肥gZe/"e〃w.e/l，Ge"/.5^ec//7cfl^e"/cwz/ms1^//^7nW(Ta《她"人/^ra/胞Mo&，iY^/，""0,"夕-J7針對Nipah病毒N基因的Realtime—PCR(Taqman熒光探針)檢測方法，檢測靈壽能達1PFU的病毒量，該方法適合對自然感染樣品或^亍病學樣4^根全觀'J。2)Wacharapluesadee等股由，A/ei"油e《〃e鵬c力u必a,r，""p7ex加Wet/7r-ZO/brctefe"/o/oTyV/;a力72'ms1MJ/Ycwwr/ze5"/eciiWe/5"of/.P7ro/.#"力<9敘2〃斷由六MMM力:jV/r湖eA"傲"〃"建立了針對Nipah病毒N基因的D叩lcxnestRT-PCR檢測方法，用卡那霉素RNA質(zhì)粒作為內(nèi)參，同時擴增內(nèi)參和Nipah病毒N基因，有效的避免了假陰性結(jié)果，檢測限為0.37pg/ul,PCR檢測的靈敏度進一步提高。實時PCR(Real-timePCR)技術(shù)實時PCR技術(shù)是近年來^^來的一種新型的PCR技術(shù)，它是在傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系的勤出上添加了熒光染料或具有熒光標記的探針，將熒光信號強弱與PCR擴增情況結(jié)合在l,通過監(jiān)測PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號的變化來實時觀測PCR反應(yīng)進行的情況。實時PCR技術(shù)，解決了傳統(tǒng)PCR難以對擴增起始模板的量進行測定的難題，避免了傳統(tǒng)檢測技術(shù)樣本消耗量大，實驗操作繁瑣，檢測靈敏度低等缺點，并具有快速、避免交叉污染等特點，可以在基因檢測、基因表達、SNP分析等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。而TaqMan探針的采用，更增加了檢測的特異性和結(jié)果的可靠性，是一種方便、快捷、經(jīng)濟的檢測方法，尤其適用于科研、臨斜口病毒流行病學監(jiān)測等工作。但是，由于實時PCR技術(shù)具有很好的敏感性和特異性，因此容易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，所以實際應(yīng)用時需要設(shè)置參照(Control)。通常的做法是檢測目的基因的同時檢測樣;^fe種基因組中表達穩(wěn)定的看家基因，如GAPDH、(3-actin、16或18SrRNA等。這樣^t4在幾個問題1、由于不同物種的看家基因序列存在差異，所以檢測不同物種目的基因時，需要對每一種物種設(shè)計看家基因的引物和探針，缺乏通用性，且增加實驗操作的繁瑣性和成本；2、對目的基因和看家基因分兩管并行檢測時，增加了試劑和人力的成本，也增加了交叉污染機會。如^同一管檢測則會因為兩套引物和探針之間的相互作用而降低PCR反應(yīng)效率，并增加了弓1物和探針的設(shè)計難度。本發(fā)明設(shè)計一組引物及探針及相應(yīng)的試劑盒，其中包括一對可以同時檢測Nipah病毒和參照基因的引物和兩條針對Nipah病毒和參照基因的TaqMan探針，使PCR反應(yīng)體系中的引物和探針數(shù)量由通常的6條減少到4條，從而可以實現(xiàn)Nipah病毒和參照基因在同一管進行高效率的擴增，減少了實—g&式劑成本和操作步驟，并減少了PCR實—3她常需要避免的污染機會，很好的避免了上述問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的提僻十對Nipah病毒的51物和探針及一步法實時RT-PCR檢測試劑盒。采用所述試劑盒，運用一步法實時RT-PCR并結(jié)合TaqMan探針技術(shù)，適用于檢測多種不同制備方法得到的、不同物種的RNA樣本(如總RNA、mRNA、病毒粒等)，對Nipah病毒RNA進行特異性檢測和定量分析。本發(fā)明提供的用于檢測Nipah病毒RNA的一步法實時RT-PCR檢測試劑盒。其原理為由固LV來源的反轉(zhuǎn)錄酶腦LVRTase將Nipah病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后^^]熱啟動TaqDNA聚合酶擴增cDNA。衫p反應(yīng)在同一反應(yīng)體系中一步完成，反應(yīng)過程無需開蓋4喿作。熱啟動TaqDNA聚合酶有效避免了非特異擴增，同時結(jié)合TaqMan探針法，對Nipah病毒進行簡單快速的高靈敏度、高特異性實時檢測。本發(fā)明中含有Nipah病毒檢測用的FAM標記探針，同時還含有Nipah內(nèi)參RNA和內(nèi)參RNA檢測用HEX標記探針，可以進行兩色熒光雙通道同時實時檢測，反應(yīng)過程無須開蓋，反應(yīng)結(jié)束無須電泳，檢測快速，并極大減少了PCR產(chǎn)物污染所產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。Nipah內(nèi)參RNA的加入與檢測可以排除因樣品純度等問題造成的假陰性結(jié)果。使用Nipah標準品RNA制作標準曲線，可以對Nipah病毒進行定量分析。為實現(xiàn)上述目的而采用的技術(shù)方案之一是提供一組針對Nipah病毒的引物和探針，包括以下序列(1)Nipah病毒的上游引物，其序列為SEQIDN01;(2)Nipah病毒的下游引物，其序列為SEQIDN02;(3)Nipah病毒的TaqMan探針，其序列為SEQIDN03;(4)內(nèi)參RNA的TaqMan探針，其序列為SEQIDN04;或者包含上述序列SEQIDN01~SEQIDN04的向5，端或/和3'端延長的序列；或者與上*列SEQIDN01-SEQIDN04同源性大于85%的序列；或者上述序列SEQIDN01~SEQIDN04的磁基互補序列。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種含有上述31物和探針序列的Nipah病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其組成包括OneSt印RT-PCRMasterMix、標準品RNA、內(nèi)參RNA、Primer&ProbeMix、逆轉(zhuǎn)錄酶和水；其中所述的Primer&ProbeMix包括序列為SEQIDN01~SEQIDN04的〉^勿。試劑盒中所述OneStepRT-PCRMasterMix為含RT-PCR緩沖液、Mgcl,，dNTPs、DNA聚合酶和無RNA酶水的混合液。其中DNA聚合酶為熱啟動TaqDNA聚合酶。所述標準品RNA序列為SEQIDN05。所述內(nèi)參RNA序列為SEQIDN06。所述水為無RNA酶水。試劑盒中各組分試劑應(yīng)保存于-20°C;盡量減少反復凍融。本發(fā)明應(yīng)用實時RT-PCR技術(shù)對樣本中的Nipah病毒RNA進行檢測，解決了傳統(tǒng)檢測技術(shù)樣本消耗量大，實驗操作繁瑣，檢測靈敏度低等缺點；TaqMan探針的采用，更增加了檢測的特異性和結(jié)果的可靠性，是一種方便、快捷、經(jīng)濟的檢測方法，尤其適用于科研、臨床和病毒流行病學監(jiān)測等工作。本發(fā)明設(shè)計一組引物及探針及相應(yīng)的試劑盒，其中包括一對可以同時檢測Nipah病毒和參照基因的31物和兩條針對Nipah病毒和參照基因的TaqMan探針，使PCR反應(yīng)體系中的引物和探針數(shù)量由通常的6條減少到4條，從而可以實現(xiàn)Nipah病毒和參照基因在同一管進行高效率的擴增，減少了實驗試劑成本和操作步驟，并減少了PCR實—^if常需要避免的污染機會。圖1是;^發(fā)明采用的TaqMan探針圖例。圖2是RiboGreen方法的RNA定量標準曲線。圖3是Nipah病毒RNAOneSt印RT-PCR擴增曲線。圖4是Nipah病毒RNAOneSt印RT-PCR標準曲線。圖5是內(nèi)參RNAOneSt印RT-PCR擴增曲線。M實施方式下面結(jié)合M實例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。此外，應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講述的內(nèi)容以后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣屬于本申請所附k利要求書所限定的范圍。下列實例中未注明M^^牛的實驗方法，通常按照常規(guī)^^牛，如分子克隆操作手冊，或按照制造廠商所建議的條件。所用無才;i^學試劑和有才力容劑均符合分子生物學實驗的要求。引物和探針由上海生工公司合成，pBS-T載體購自北京TIANGEN公司，謹LV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Stratagene公司、TaqDNA聚合酶購自美國ABI公司，DNaseI、RNaseH和T7RNA多聚酶購自大連寶生物/^司，T3RNA多聚酶購自美國Promega/>司，RiboGreen和RNA定量試劑盒購自美國Invitrogen乂^司。熒光PCR儀MX3000P為美國Stratagene公司產(chǎn)品，熒光PCR儀Rotorgene3000為澳大利亞CorbettResearch/>司產(chǎn)品。1.引物和探針的設(shè)計根據(jù)GeneBank公布的Nipahvirus序列(AccessionNumber:AF212302)設(shè)計引物和探針。01igo6.O軟件在Nipah病毒基因序列第113nt-1711nt(N基因)中設(shè)計和優(yōu)選引物與探針，并進行質(zhì)量分析。所設(shè)計的引物和探針經(jīng)BlasU全索能檢測出所有現(xiàn)有已知的Nipah病毒抹，不與Hendra病毒4朱產(chǎn)生陽性結(jié)果。(1)Nipah病毒的上游引物，其序列為SEQIDN01:5'-AAACATCAGCAGGAAGGC-3,(2)Nipah病毒的下游引物，其序列為SEQIDN02:5'-CCACTCTGTTCTATAGGTTCTT-3，(3)Nipah病毒的TaqMan探針，其序列為SEQIDN035，-FAM-AAATTTGCTGCAGGAGGTGTGCTCAT-DABCYL-3，(4)內(nèi)參RNA的TaqMan探針，其序列為SEQIDN04:5,-HEX-CTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTC-BHQ1-3，探針設(shè)計原理如圖l,其中FAM、HEX為熒iti艮告基團，DABCYL、BHQ1為焚光淬M團。2.Nipah病毒標準品RNA及內(nèi)參RNA的制備和標定應(yīng)用PCR方法從出^;粒(含Nipah病毒N基因)擴增一l餅列，其中含有前述弓1物和探針結(jié)合序列；將PCR產(chǎn)物純化后連接pBS-T載體，測序正確后線性化載體，使用T7或T3RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄，所得到產(chǎn)物用DNaseI和RNaseH消化后使用RNA純化試劑盒純化，加入適量無RNA酶水，即為標準品RNA,放-80°C冰箱備用。使用RiboGreen方法和RNA定量試劑盒(Invitrogen)制作標準曲線，將得到的標準品RNA定量，并換算成拷貝數(shù)/ul。內(nèi)參RNA的制備和標定同Nipah病毒標準品RNA。用RiboGreen方法和RNA定量試劑盒制作的標準曲線如圖2。標準品RNA序列為SEQIDN05:5'-GCGAAUUGGGUACCGGGCCCCCCCUCGAGGUCGACGGUAUCGAUAAGCUUGAUUACCAUGCUGGAGGAAUUGAUCAGAACAUGGCAAAUAGACUGGGACUAAGUUCAGAUCAAGUUGCAGAACUCGCUGCUGCAGUUCAGGAAACAUCAGCAGGAAGGCAAGAGAGUAAUGUUCAGGCUAGAGAGGCAAAAUUUGCUGCAGGAGGUGUGCUCAUUGGAGGCAGUGAUCAAG皿UCGAUGAAGGGGAAGAACCUAUAGAACAGAGUGGCAGACAGUCAGUUACCUUCAAAAGGGAGAUGAGUAUUUCAUCCCUUGCUAACAGUGUGCCGAGCAGUUCUGUGAGCACAUCCGGUGGGACCAGAUUGACUAAUUCAUUACUAAACCUCAGAUCAAGACUGGCUGCAAAAGCAGCAAAAGAAGCCGCCUCAUCCAAUGCAACAGAUGAUCCAGCAAUCAGCAACAGAACUCAAAUCGAAUUCCUGCAGCCCGGGGGAUCCACUAGUUCUAGAGCGGCCGCCACCGCGGUGGAGCUCCAGC而UUGUUCCCUUUAGUGAGGGUUAAUUUCGAGCUUGGCGUAAUCAUGGUCAUAGCUGUUUC-3，內(nèi)參RNA序列為SEQIDN06:5，-GGAACAAAAGCUGGAGCUCCACCGCGGUGGCGGCCGCUCUAGAACUAGUGGAUCCCCCGGGCUGCAGGAAUUCGAUUAGAAAACAUCAGCAGGAAGGCAAGCCGGUCUUGUCGAUCAGGAUGAUCUGGACGAAGAGCAUCAGGGGCUCGCGCCAGCCGAACUGUUCGCCAGGCUCAAGGCGAGCAUGCCCGACGGCGAGGAUCUCGUCGUGACCCAUGGCGAUGCCUGCUUGCCGAAUAUCAUGGUAAGAACCUAUAGAACAGAGUGGUCUAAUCAAGCUCGCCGUCGACCUCGAGGGGGGGCCCGGUACCCAAUUCGCCCUAUAGUGAGUCGUAUUACAAUUCACUGGCCGUCGUUUUACAA-:3,3.OneSt印RT-PCR反應(yīng)將裝有2x0neSt印RT—PCRMasterMix、5xprimers&probesMix、RNA樣品或標準品RNA、內(nèi)參RNA、MMLV和無RNA酶水的離心管從-20。C冰箱中取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，jl^l短暫離心，用移液器按下表中的說明在冰盒上配制OneSt印RT-PCR反應(yīng)體系(參錄l)。表lOneSt印RT-PCR反應(yīng)體系的配制<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>^g^應(yīng)^^牛42°C30minutes,1個循環(huán);95°C15minutes,1個循環(huán)；95°C12seconds,55。C20秒，72。C20秒，40個循環(huán)。4.敏感性和特異性連續(xù)10倍稀釋Nipah標準品RNA進行敏感性分析。在2Ou1RT-PCR反應(yīng)體系中按3中的^S^^牛進行OneSt印RT-PCR反應(yīng)，由軟件自動產(chǎn)生Nipah病毒OneSt印RT-PCR擴增曲線、標準曲線，見圖3、4。標準曲線的線性范圍為1.7xl07~1.7xl02copies/ul。內(nèi)參RNA擴增曲線見圖5。陰性對照(用無RNA酶水代替RNA樣品)無F雄熒光信號擴增，有HEX熒光信號擴增，見圖3、5。5.操作中防止假陰性和假陽性現(xiàn)象的措施。(1)無論是進行陰性對照、陽'1^于照實驗，還是實際樣品4僉測時，反應(yīng)體系中都務(wù)必添加內(nèi)參RNA，防止出現(xiàn)假陰性。(2)同時進行陰'l^t照實驗，防止出現(xiàn)假陽性。(3)同時進行陽'1^十照實驗，防止出現(xiàn)假陰性。6.結(jié)果判定①陰'^^j"照實驗在配制實時RT-PCR反應(yīng)液時，用無RNA酶水替代檢測樣品。對各種實驗結(jié)果的判定情況說明見表2。表2陰4&于照實驗結(jié)果判定<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>制作標準曲線時，用Nipah標準品RNA的各濃度梯度稀釋液替4^全測樣品。對各種實驗結(jié)果的判定情況說明見表3。表3陽性對照實驗結(jié)果判定<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>對各種實驗結(jié)果的判定情況說明見表4。表4實驗樣品的檢測結(jié)果判定<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</table>7.注意事項A、RNA實—3封喿作注意事項本試劑盒是利用RT-PCR反應(yīng)對病毒或內(nèi)參RNA樣品進行擴增。RNA的純度和完整性會影響實驗結(jié)果，而制備RNA的關(guān)4^^要抑制細胞中的RNA分解酶和防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。因此，在實驗中必須采取以下措施戴一次性干凈手套；使用RNA操作專用實驗臺；在操作過程中避免講話等。通過以上辦法可以防止實驗者的汗液、唾液中的RNA酶污染。盡量使用一次性塑料器亞，若用玻璃器皿，應(yīng)在使用前按下列方法進行處理用0.1%DEPC(焦碳S吏二乙酯)水溶液在37。C下浸泡12小時；然后在12(TC下高壓滅菌30分鐘以除去殘留的DEPC。RNA實驗用的器具建議專門使用，不要用于其它實-驗。用于RNA實驗的試劑，須使用干熱滅菌(18(TC，60min.)或使用上述方法進行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝(也可以4賴RNA實驗用的一次性塑料容器)，使用的無菌7K須用0.1%的DEPC處理后再進行高溫高壓滅菌。RNA實驗用的試劑和無菌7jc都應(yīng)專用，避免混用后交叉污染。使用簡單的RNA純化方法即可獲得滿足于RT-PCR^^應(yīng)的RNA(只需少量的RNA便可進行RT-PCR反應(yīng))。但為了保證實驗的成功率，建議^^]GTC法(異硫氰酸胍法)制備高純度RNA。為了防止RNA分解，RNA樣品應(yīng)盡量避免反復凍融，并盡可能4錄于-80。C環(huán)境。B、生物樣本實驗操作注意事項生物樣;^"潛在危險，樣品的采集、處理、保存、運輸、檢測實驗均應(yīng)遵循國家相應(yīng)的管理規(guī)定和生物安全條例。必須做好相關(guān)的保護措施，以確保實驗人員安全。本試劑盒所使用的NipahPositiveControlRNA是通過人工合成DNA后，再經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄得到的。使用安全，無感染性。C、PCR實驗注意事項本試劑盒檢測靈每嫂高，為了防止污染，實驗^區(qū)操作①第一區(qū)反應(yīng)液配制區(qū)。②第二區(qū)樣品制備區(qū)。③第三區(qū)樣品添加區(qū)^^應(yīng)檢測區(qū)。三個區(qū)間必須進行物理性隔離，避免人為因素造成污染。PCR實驗用熒^示i^罙4十應(yīng)避光^^4。當同時需要ii^亍婆t次RealTimeOneSt印RT-PCR^^應(yīng)時，應(yīng)先配制各種試劑的';ft^液(其中包括MasterMix、無RNA酶水、Buffer、各種酶等)，然后再分裝到每個反應(yīng)管中。這樣，可使所取的試劑體積更準確，減少試劑損失，避免重復分取同一試劑。同時也可以減少實驗操作或?qū)嶒灅悠分g產(chǎn)生的誤差。反應(yīng)液的配制、分裝應(yīng)一定使用新的(無污染的)槍頭、Microtube等，盡量8.試劑盒^i^實例試劑準備(1)Nipah病毒的一步法實時RT-PCR4全測試劑盒；(2)待檢測RNA樣品操作步驟(1)根據(jù)檢測樣^l史量(N)計算所需^管數(shù)(R)，以每個樣本做3個重復為例，總反應(yīng)管數(shù)為設(shè)需要的管數(shù)為11=(N+6+l)x3+l，其中用來估議量標準曲線的標準品RNA6管，陰性對照1管。為i^免分液過程中損失，—管備用。(2)選擇20ul或50ul反應(yīng)體系，根據(jù)表1所建i義體積乘以總反應(yīng)管l仏，在1.5mlEP管中水上配制除標準品RNA或樣品RNA外的其它組分，混勻后分裝18ul或45ul反應(yīng)'/c^液至PCR管，分別加入標準品RNA或樣品RNA或無RNA酶水，蓋好蓋子，放入實時PCR儀。(3)運行PCR儀，根據(jù)表1建議的反應(yīng)^^牛進行PCR反應(yīng)。實時熒光PCR儀設(shè)置為同時采集F細和HEX熒光信號。(4)反應(yīng)結(jié)束后利用PCR儀隨機附帶分析軟件分析結(jié)果。(5)參照表2~表4對反應(yīng)結(jié)果進行判定。本發(fā)明中涉及的核酸序列SEQIDN01，Hendra病毒的上游引物:5，-TATCAAAGAGAGTACTGCACAG-3，SEQIDN02,Hendra病毒的下游引物:5，-TCCTGAGTCTGCCTGAGGG-3，SEQIDN03,Hendra病毒的TaqMan檢測探針5'-FAM-CTCATCGGAAAGAAACCCACCTAATA-DABCYL-3'SEQIDN04，內(nèi)參RNA的檢測探針5，-HEX-CTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTC-BHQl-3，SEQIDN05，標準品RNA:5，-GGAACAAAAGCUGGAGCUCCACCGCGGUGGCGGCCGCUCUAGAACUAGUGGAUCCCCCGGGCUGCAGGAAUUCGAUUUCUCUCGCAGACAGUGUCCCAAGCAGUUCAGUGAGUACAUCCGGAGGAACGAGAUUGACAAAUUCUCUAUUGAAUCUCAGAUCCAGAUUAGCUGCAAAGGCUAUCAAAGAGAGUACUGCACAGAGCUCAUCGGAAAGAAACCCACCUAAUAACCGCCCUCAGGCAGACUCAGGAAGGAAAGAUGACCAGGAACCCAAACCUGCCCAAAAUGAUUUGGACUUUGUUAGAGCAGACGUGUGACGC■AUCAGAAACUCAUAUAAGCUCCAAAUCAUUCUCUAUGACACACUCUUAUAAAUGAAUUCGAAGCAAUCAAGCUUAUCGAUACCGUCGACCUCGACGGGGGGGCCCGGUACCCAAUUCGCCCUAUAGUGAGUCGUAUUACAAUUCACUGGCCG酬UUUACAA-3，SEQIDN06:,內(nèi)參RNA:5'-GCGAAUUGGGUACCGGGCCCCCCCUCGAGGUCGACGGUAUCGAUAAGCUUGAUUAGAUAUCAAAGAGAGUACUGCACAGAAGCCGGUCUUGUCGAUCAGGAUGAUCUGGACGAAGAGCAUCAGGGGCUCGCGCCAGCCGAACUGUUCGCCAGGCUCAAGGCGAGCAUGCCCGACGGCGAGGAUCUCGUCGUGACCCAUGGCGAUGCCUGCUUGCCGAAUAUCAUGGUCCCUCAGGCAGACUCAGGAUCUAAUCGAAUUCCUGCAGCCCGGGGGAUCCACUAGUUCUAGAGCGGCCGCCACCGCGGUGGAGCUCCAGCUUUUGUUCCCUUUAGUGAGGGUUAAUUUCGAGCUUGGCGUAAUCAUGGUCAUAGCUGUUUCC-3'權(quán)利要求1.一組針對Nipah病毒的引物和探針，包括以下序列(1)Nipah病毒的上游引物，其序列為SEQIDNO1；(2)Nipah病毒的下游引物，其序列為SEQIDNO2；(3)Nipah病毒的TaqMan探針，其序列為SEQIDNO3；(4)內(nèi)參RNA的TaqMan探針，其序列為SEQIDNO4；或者包含上述序列SEQIDNO1～SEQIDNO4的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列SEQIDNO1～SEQIDNO4同源性大于85％的序列；或者上述序列SEQIDNO1～SEQIDNO4的堿基互補序列。2.—種Nipah病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其組成包括OneSt印RT-PCRMasterMix、標準品RNA、內(nèi)參RNA、Primer&ProbeMix、逆轉(zhuǎn)錄酶和水；其中所述的Primer&ProbeMix序列為SEQIDN01~SEQIDN04的混合物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種Nipah病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其特;[正在于，所述OneSt印RT-PCRMasterMix為含RT-PCR緩沖液、Mgch，dNTPs、DNA聚合酶和無RNA酶水的混合液。其中DNA聚合酶為熱啟動TaqDNA聚合酶。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種Nipah病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述標準品RNA序列為SEQIDN05。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種Nipah病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其特4正在于，所述內(nèi)參RNA序列為SEQIDN06。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種Nipah病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其特^E在于，所述水為無RNA酶水。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種Nipah病毒一步法實時RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中各組分的量為2xOneSt印RT-PCRMasterMix1.25ml/管、標準品RNA凍干管(濃度梯度)共6管、內(nèi)參RNA凍干管l管、5xPdmer&ProbeMix1.Oml/管、逆轉(zhuǎn)錄酶薩LV80ul/管和無RNA酶水1Qml/瓶。全文摘要本發(fā)明涉及一組引物及探針及相應(yīng)的試劑盒，其中包括一對可以同時檢測Nipah病毒和參照基因的引物和兩條針對Nipah病毒和參照基因的TaqMan探針，使PCR反應(yīng)體系中的引物和探針數(shù)量由通常的6條減少到4條，從而可以實現(xiàn)Nipah病毒和參照基因在同一管進行高效率的擴增，能夠?qū)崿F(xiàn)對不同物種目的基因的檢測，通用性強，減少了引物和探針的數(shù)量及實驗試劑成本和操作步驟，并減少了PCR實驗通常需要避免的污染機會。本發(fā)明試劑盒適用于科研或臨床中Nipah病毒的檢測，尤其適用病毒性疾病預(yù)防控制工作中對Nipah病毒的監(jiān)測。文檔編號C12N15/11GK101195846SQ20071009278公開日2008年6月11日申請日期2007年9月29日優(yōu)先權(quán)日2007年9月29日發(fā)明者徐鳴明,曾志磊,鵬謝申請人:謝鵬;曾志磊