專利名稱：一種雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES、雙歧桿菌-ETEC CFA/I重組載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體PBES以及由其 構(gòu)建的雙歧桿菌-ETEC CFA I重組載體、口服活疫苗及其用途。
技術(shù)背景 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenic五"/2en'c/n'a co//， ETEC)是發(fā) 展中國家引起急性腹瀉的主要病原菌之一，在發(fā)展中國家的旅行者腹瀉中，約 40%至70%由ETEC所致。在我國，二十世紀(jì)九十年代僅對廣州地區(qū)的感染性腹 瀉病人的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 一年中由ETEC引起的腹瀉就有202%。。其中5歲 以下兒童為319%。， ETEC已知至少有兩種明確的毒力因子，即定居因子抗原 (colonization factor antigen, CFA)，[又稱為粘附素(adhesin)]和腸毒素。依靠 定居因子粘附在小腸粘膜細(xì)胞表面是ETEC致病的先決條件，然后才產(chǎn)生腸毒 素發(fā)揮作用，引起類似霍亂樣的急性腹瀉綜合癥。實驗證明，ETEC若失去產(chǎn)生 CF的能力，進(jìn)入動物或人腸道的ETEC由于不能定居不會引起腹瀉?？梢?，如 果發(fā)明針對ETEC定居因子的疫苗，免疫后的抗定居因子抗體就可以阻斷ETEC 對小腸粘膜的吸附和定居，進(jìn)而就能阻斷ETEC引發(fā)腹瀉性疾病。
已有幾種方法制造死菌苗，其中包括由純化定居因子(如CFA I等)組成的 菌苗、由LT或LT-ST類毒素組成的菌苗和表達(dá)霍亂毒素B亞單位的食用轉(zhuǎn)基因 植物菌苗。由瑞典哥德堡大學(xué)研究人員研制的最成功的菌苗是將霍亂毒素rBS 與能表達(dá)在發(fā)展中國家具有最大流行病學(xué)重要性的定居因子(CFAI、 CFAII和 CFAIV)的5株福馬林滅活ETEC相結(jié)合。美國馬里蘭大學(xué)疫苗開發(fā)中心研究 人員正在進(jìn)行活菌苗研制。其菌苗研制策略是利用減毒活志賀菌作為ETEC菌 毛抗原和LT抗原表達(dá)的載體。因此，這種構(gòu)建物既可預(yù)防志賀菌又可預(yù)防ETEC。但無論哪種疫苗，均存在不同程度的副作用。經(jīng)專利查新證實，國內(nèi)目 前關(guān)于人用ETEC定居因子I疫苗的專利未見公布
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種雙歧桿菌-大腸
桿菌穿梭表達(dá)載體pBES以及由其構(gòu)建的雙歧桿菌-ETEC CFA I重組載體、雙歧
桿菌-ETEC CFA/I重組載體口服活疫苗及其用途。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 一種雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES，其特征在于所述的pBES載體
是由GenBank號為U13856的pGEX-5x-l為骨架改造而來。 該載體的構(gòu)建步驟如下
第一步，用卡那霉素抗性基因替換pGEX-5x-l質(zhì)粒1344-2220 nt的 Ampicillin抗性基因的序列區(qū)，即(a)先用PCR方法從GenBank號為EU233623 的質(zhì)粒pEASY-Tl上擴(kuò)增1203-2114 nt片段，得到卡那霉素抗性基因，正向PCR 引物為agtagacgtcctggtaag gttgggaag ，位置在1203-1219 nt， 5'端添加酶切 位點(下劃線，下文標(biāo)示相同)，反向引物為acgtcagtggctgcaattcagaag aactcgtc， 位置在2114-2085 nt, 5'端添加J/wNl酶切位點；PCR擴(kuò)增條件為95°C 4 min， 經(jīng)95。C 40Sec、 55°C 30Sec、 72°C lmin循環(huán)擴(kuò)增25次；(b)將上述PCR純化 產(chǎn)物和pGEX-5x-l質(zhì)粒分別用JWII和AwNl雙酶切，回收酶切后的PCR產(chǎn)物 和pGEX-5x-l大片段按l: 2混合連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取在卡那霉素
抗性平板上生長陽性單克隆，再一次在卡那霉素抗性平板上劃線純化，同時在 青霉素平板上劃線培養(yǎng)而不能生長的單菌落一定是陽性菌落，然后測序確認(rèn)。
第二步，以第一步所得到陽性菌落中的質(zhì)粒為模板，用高保真TaqDNA聚 合酶通過PCR擴(kuò)增，以四環(huán)素tetO啟動子替換pGEX-5x-l質(zhì)粒183-932上的
Ptac啟動子，同時刪除pGEX-5x-l質(zhì)粒上3301-4420nt的Laclq片段，引物pFl 為pGEX-5x-l上的多克隆位點序列，pRl為LacIq上游序列，引物序列如下 pF 1: attaggatccccgaattcccg， 5，端添加萬譜HI酶切位點5 pRl: tcgaccgcggattcaccacc ctgaattgac， 5'端添加酶切位點，PCR擴(kuò)增條件為95°C 4 min,經(jīng)95。C 40 Sec、 52°C 30Sec、 72°C 1 min循環(huán)擴(kuò)增30次，PCR產(chǎn)物用5amHI和雙 酶切備用。
同時，用5awHI和5WcI1酶切切取由上海生物工程技術(shù)公司合成的tetO啟 動子序歹!j， 其序列如下tcgaccgcggactggccgtcgttttactccctatcagtg atag agattgacatc cctatcagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacctgaggagggatccctag， 其中ctggcc gtcgtttta為M13測序引物序列；然后將i5a/wHI和SwII酶切后的質(zhì)粒與tetO啟 動子的PCR酶切產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化，在卡那霉素抗性平板上挑取單克隆，電泳鑒定 后，測序確認(rèn)后，同時制備A^II酶切產(chǎn)物備用。
第三步，合成GenBank號為AF139129的長雙歧桿菌KJ36質(zhì)粒的復(fù)制蛋白B 序列及其復(fù)制起始位點，其蛋白編碼序列位置在4-1018nt，序列如下
g^^g^gtacttagtacaaaaggggagcgaacttagtacaaaaggggagcgaacttagtacaaaagg
cacctggacgtgctcatggcgatcgcttcaagggtgagggagaagggcacggccacggtggagttctc
ttcgcgctgttcacgaagttcgtcaccgacccgcaggaggcgactctcgcggttggggtcaacgagga gttcgcgttcctgctcaacgacctgaccagccagttcacgcgcttcgagctggccgagttcgccgacc tcaagagcaagtacgccaaggagttctacaggcgcgccaagcagtaccgcagctcgggaatctggaag gaacagggtcgtgctgaagacgatcgccgaagagtgtgggcctctccttggcctgaagatcgagcgcc
tggaggccggg肪atgccgtttcctgcgcgtttgacgcgcgcaaccgcgaacatcatgacgtc;其中 下劃線部分是合成時在兩端添加AatII酶切位點，序列片段由上海生工合成，測 序確認(rèn)無誤；用PCR大量擴(kuò)增該序列，正向引物為pRl: gcgacgtcgtacttagtacaa aagggga， 5'端添力口 Aat II酶切位點，反向弓l物為pR2: gcgacgtcatgatgttcgcggttgc g ， 5'端添加AatII酶切位點，PCR擴(kuò)增條件為95°C 3 min,再經(jīng)95。C 50 Sec、 54°C 40Sec、 72°C lmin的30次循環(huán)擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物經(jīng)Aat II酶切后連接到第 二步所得的質(zhì)粒對應(yīng)的AatII酶切位點，連接轉(zhuǎn)化，在卡那霉素抗性平板上挑取 單克隆，質(zhì)粒用電泳檢測后測序確認(rèn),并選擇KJ36片段按順時針方向連接的為標(biāo) 準(zhǔn)序列報道的載體，其全序列如下ccgcggactggccgtcgttttactccctatcagtga tagagattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacctgaggag ggatccccgaattcccgggtcgactcgagcggccgcatcgtgactgactgacgatctgcctcgcgcgt
ggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagcca
tttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcgtacttagtacaaaaggggagcga ac 11 agt acaaaaggggagc g肪c 11 agt acaaaaggggagc gaac 11 ag t acaaaaggggagc gaac
cagttcacgcgcttcgagctggccgagttcgccgacctcaagagcaagtacgccaaggagttctacag gcgcgccaagcagtaccgcagctcgggaatctggaagatcagccgcgatgagttctgccgactgcttg
gttcacgttcgcccgcgagacccctccggtgatcgacgccaggcccgtggaggcgaggaagacggacg gcgacggc幼gggccattggacgagcgtggcggggtacggcgaggtgttcacgaccacggagctgttc
ttgacgcgcgcaaccgcgaacatcatgacgtcctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactgga tggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgagga
ggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcggg aagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatcccaccttgctcctgccg
gaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcagga
ccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggc cgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggc
ccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcgg tcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagata
gcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagt
cctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaat。 至此，pBES載體構(gòu)建成功，全長3016bp。
該穿梭表達(dá)載體具有如下特征(1)以SacII酶切位點序列(ccgcgg)的 第一個C為起始核苷酸，該載體有3016bp; (2) 7-103bp為M13測序引物和tetO 啟動子序列區(qū)。(3) 104-150bp為多克隆位點，依次含有^a/zHI， fcoRI， 5feal， 5^7I，
和#"1五個單酶切位點。(4) 548-1400bp為長雙歧桿菌的R印B(復(fù)制蛋白 B)的編碼序列。(5) 1541-2336bp為卡那霉素抗性基因的編碼序列。因此，該載 體與現(xiàn)有的雙歧桿菌表達(dá)載體相比，具有下列優(yōu)勢(1)由于含有雙歧桿菌本 身的復(fù)制蛋白及其上游的復(fù)制起始位點，使其更適合在雙歧桿菌中自主復(fù)制和 穩(wěn)定存在；(2)該表達(dá)載體刪除了氨芐青霉素抗性基因，而選擇了副作用小、 臨床使用率很低的卡那霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記，使得PBES具有更大的安全 性，而現(xiàn)有的表達(dá)載體中含有氨芐青霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記，而根據(jù)美國FDA的規(guī)定，在基因工程疫苗生產(chǎn)中不能使用青霉素(Penicillin)或其它P-內(nèi)酰胺類的抗生素作篩選， 一方面，因為這些抗生素的使用是造成潛在痕量過 敏反應(yīng)發(fā)生的重要來源，另一方面，含抗藥基因的質(zhì)粒會導(dǎo)致氨芐青霉素抗藥 性在臨床致病菌中散播，對公共衛(wèi)生安全具有潛在的隱患。
上述雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES的用途，其特征在于所述的 雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES用于以雙歧桿菌為受體菌的所有外源基 因的表達(dá)。
作為雙歧桿菌的通用表達(dá)載體，pBES用于在雙歧桿菌中表達(dá)所有有價值的 外源基因，這類基因即可以使口服疫苗的候選抗原基因，也可以是基因治療的 基因如P53基因、各種細(xì)胞因子基因、前體藥物降解基因如TK基因等等。
用上述雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES構(gòu)建的雙歧桿菌-ETEC CFA I 重組載體，其特征在于將ETEC CFAI基因連接到雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表 達(dá)載體pBES中，其構(gòu)建方法如下
a)將產(chǎn)腸毒素大腸桿菌H10407中的CFAI基因，縮寫為ETEC CFAI，經(jīng)PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增并經(jīng)測序證明無誤后用Sa/1和A^I雙酶切后連接到雙歧 桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES的和雙酶切位點上，構(gòu)建成轉(zhuǎn)化載 體pBES-ETEC CFA I; PCR正向引物為tgggagctcaggaggaaatatgca ，反向引物為: tggcgcggccgctagagtgtttgact; PCR擴(kuò)增條件為95°C 5 min,再經(jīng)95°C 50 Sec、 56°C 30Sec、 72°C 5 min的25次循環(huán)擴(kuò)增。
b)以大腸桿菌DH5a為受體菌，用電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體菌中；轉(zhuǎn)化條 件為13KV、 200Q、 25pF;所述的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌由中國典型培養(yǎng)物保藏中心 保藏，保藏號為CCTCCNo: M206117的大腸桿菌DH5a-pBES-CFAI。
優(yōu)選的，所述的ETEC CFA/I為人的ETEC CFAI。
上述雙歧桿菌-ETEC CFAI重組載體構(gòu)建的口服活疫苗，其特征在于按以 下步驟構(gòu)建-
a)從保藏號為CCTCC No: M206117的大腸桿菌DH5a-pBES-CFA I中提取 和純化pBES-CFAI質(zhì)粒。
b) 將雙歧桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期即OD6。。為0.6-0.7時，經(jīng)去離子水配制的 滅菌10%甘油處理后，以雙歧桿菌為受體菌，用電轉(zhuǎn)化法將純化的pBES-CFAI 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到受體菌中；轉(zhuǎn)化條件為15KV、 200Q、 25pF;所述的雙歧桿菌 為受體菌為由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC No: M203050 的兩歧雙歧桿菌SHQ006。
c) 再將轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌先在無抗菌素的MRS液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇 60-120 min，然后在含50|iig/ml卡那霉素的MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選擇抗性 菌落，從而獲得轉(zhuǎn)ETEC CFA/I基因的雙歧桿菌，PCR和SDS-PAGE鑒定后的 陽性克隆即為ETEC CFA/I重組載體的種子菌。
d) 將上述經(jīng)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌復(fù)蘇后，涂布于含卡那霉素的抗 性MRS培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)48小時，然后挑取單一的抗性菌落于抗性MRS液體 培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，經(jīng)PCR證實CFA I陽性的雙歧桿菌單菌落再次涂布接種于 含卡那霉素的抗性MRS培養(yǎng)基平板上厭氧培養(yǎng)48小時；然后再挑取單一菌落 于常規(guī)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如此反復(fù)接種培養(yǎng)至繼代培養(yǎng)不低于15代時，經(jīng)PCR 檢測證實CFA/I仍然陽性的克隆，可以作為種子菌用于大規(guī)模液體接種擴(kuò)增培 養(yǎng)，培養(yǎng)物經(jīng)離心濃縮，進(jìn)一步制備成轉(zhuǎn)ETEC CFAI基因的雙歧桿菌-ETEC CFA I重組載體口服活疫苗制劑。
該疫苗的優(yōu)點是服用方便，口服的雙歧桿菌進(jìn)入腸道后首先結(jié)合在小腸粘 膜上皮的雙歧桿菌特異性受體上繁殖，有利于CFAI蛋白表達(dá)后被上皮細(xì)胞及時 和有效地吸收提呈，增加抗原的生物利用效率。同時，雙歧桿菌的大量繁殖， 有利于改善腸道微生態(tài)，抵抗病源菌的定居和繁殖，加速腹瀉等癥狀的愈好。
上述雙歧桿菌-ETEC CFAI重組載體口服活疫苗的應(yīng)用，其特征在于制 成發(fā)酵乳制劑、片劑和膠囊制劑的雙歧桿菌-ETECCFAI重組載體口服活疫苗， 用于預(yù)防和治療ETEC引發(fā)腹瀉性疾病。
發(fā)酵乳制劑制作簡便、服用方便、活菌數(shù)量大、菌體活性高，可以隨時制 備和使用，但缺點是運輸困難、存放時間短、需要冷鏈運輸和存放，不便于大 規(guī)模、長時間儲存。片劑和膠囊劑型可以進(jìn)行微囊化處理、服用方便、運輸和 存放簡單，不需要冷鏈運輸和存放，便于大規(guī)模生產(chǎn)、較長時間儲存，是企業(yè) 化生產(chǎn)和流通的主要劑型。相對于發(fā)酵乳劑型，片劑和膠囊中的活菌數(shù)量要低、 菌體活性也有所下降，這是他的弱點。但無論哪種劑型，其生產(chǎn)流程簡便，發(fā) 酵后不需要對抗原蛋白進(jìn)行繁瑣復(fù)雜的純化，即使是片劑和膠囊也只作離心、 洗滌等簡單處理即可收集菌體成型，有利于簡化生產(chǎn)環(huán)節(jié)和節(jié)約生產(chǎn)成本。
本發(fā)明就是運用基因工程方法將ETEC的CFA I基因連接到發(fā)明人自己構(gòu) 建的雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES中，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法把ETEC的 CFAI基因?qū)氲饺梭w益生菌-雙歧桿菌中制成雙歧桿菌(5zy^o6acfen^w平)為 受體菌的ETECCFAI重組載體口服活疫苗，即雙歧桿菌-ETECCFAI重組載體 口服活疫苗。
雙歧桿菌屬于革蘭氏陽性菌，是人類腸道的正常微生物菌群，能通過細(xì)胞 表面的磷壁酸吸附在小腸上皮細(xì)胞表面的受體上，近年來被廣泛用于腸道疾病 的輔助治療(如麗珠腸樂等)和乳制品生產(chǎn)，非常適宜在腸粘膜上原位表達(dá)腸 道病原菌的中和抗原，菌體本身可以起到免疫增強(qiáng)劑的作用，是構(gòu)建腸道病原
菌口服亞單位活疫苗的理想受體菌。因此，本發(fā)明可以通過基因工程手段讓雙
歧桿菌替代傳統(tǒng)的ETEC疫苗中CFAI的受體菌，既解決了活疫苗構(gòu)建的載體系
統(tǒng)的安全性問題，又發(fā)揮了雙歧桿菌抑制腸道病原菌的微生態(tài)效應(yīng)。


圖1是本發(fā)明的大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體pBES的結(jié)構(gòu)示
意其中，(1) PtetO是四環(huán)素tetO啟動子序列區(qū)。(2)MCS是多克隆位點 序列區(qū)，依次含有BamHI,EcoRI,SmaI,SalI,XhoI和NotI五個單酶切位點。(3) R印B(序列位置548-1400bp)為長雙歧桿菌的復(fù)制蛋白編碼序列。(4) kanR (序 列位置1541-2336bp)為卡那霉素抗性基因的編碼序列。
圖2是本發(fā)明pBES載體連接了綠色熒光蛋白基因(EGFP)后在 雙歧桿菌中的表達(dá)的情況在488mn的熒光顯微鏡的圖像；
圖3是本發(fā)明pBES-CFA/I及其PCR產(chǎn)物的電泳圖； 圖中的M泳道DNAMarker(lKb ladder); 泳道1: pBES-CFA/I質(zhì)粒；泳 道2-3 :從pBES-CFA/I質(zhì)粒上用PCR擴(kuò)增的CFAI片段(5014bp)，說明CFAI
被連接到載體上。
圖4是本發(fā)明pBES-CFA/I及其表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖； 其中，泳道1:蛋白質(zhì)Marker; 泳道2-4 : pBES-CFA/I在雙歧桿菌中表 達(dá)的CFAI蛋白(依次為接種后4小時、8小時、IO小時的表達(dá)量)；泳道5: pBES空質(zhì)粒在雙歧桿菌中表達(dá)情況；泳道6:無質(zhì)粒的雙歧桿菌中表達(dá)情況。 說明CFA I成功地在雙歧桿菌中實現(xiàn)了表達(dá)，并且確定了 8-10小時為表達(dá)的高 峰期。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實施例l
一種雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES，其特征在于所述的pBES載體 是由GenBank號為U13856的pGEX-5x-l為骨架改造而來。
該載體的構(gòu)建步驟如下
第一步，用卡那霉素抗性基因替換pGEX-5x-l質(zhì)粒1344-2220 nt的 Ampicillin抗性基因的序列區(qū)，即(a)先用PCR方法從GenBank號為EU233623 的質(zhì)粒pEASY-Tl上擴(kuò)增1203-2114 nt片段，得到卡那霉素抗性基因，正向PCR 引物為agtagacgtcctggtaag gttgggaag ，位置在1203-1219 nt, 5'端添加4artl酶切 位點，反向引物為acgt^^gigg^gcaattcagaag aactcgtc，位置在2114-2085 nt， 5，端 添加J/wNl酶切位點；PCR擴(kuò)增條件為95°C 4min,經(jīng)95。C 40 Sec、 55°C 30Sec、 72°C 1 min循環(huán)擴(kuò)增25次；(b)將上述PCR純化產(chǎn)物和pGEX-5x-l質(zhì) 粒分別用A^II和J/wNl雙酶切，回收酶切后的PCR產(chǎn)物和pGEX-5x-l大片段 按l: 2混合連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ot，挑取在卡那霉素抗性平板上生長陽性 單克隆，再一次在卡那霉素抗性平板上劃線純化，伺時在青霉素平板上劃線培 養(yǎng)而不能生長的單菌落一定是陽性菌落，然后測序確認(rèn)。
第二步，以第一步所得到陽性菌落中的質(zhì)粒為模板，用高保真T叫DNA聚 合酶通過PCR擴(kuò)增，以四環(huán)素tetO啟動子替換pGEX-5x-l質(zhì)粒183-932上的 Ptac啟動子，同時刪除pGEX-5x-l質(zhì)粒上3301-4420nt的Laclq片段，引物pFl 為pGEX-5x-l上的多克隆位點序列，pRl為LacIq上游序列，引物序列如下 pFl: attaggatccccgaattcccg， 5'端添力Q 5amHI酶切位點；pRl: tcgaccgcggattcaccacc ctgaattgac， 5，端添加SacII酶切位點，PCR擴(kuò)增條件為95。C 4min,經(jīng)95。C 40 Sec、 52°C 30Sec、 72°C 1 min循環(huán)擴(kuò)增30次，PCR產(chǎn)物用B"wHI和雙 酶切備用。
同時，用^mHI和酶切切取由上海生物工程技術(shù)公司合成的tetO啟
動子序歹!l ，其序歹!J如下tcgagggggga|ctggccgtcgtttta|ctccctatcagtg atag agattgacatc
cctatcagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacctgaggagggg^ctag ，其中ctggccg
tcgtttta為M13測序引物序列(方框所示)；然后將^w;HI和SflcII酶切后的質(zhì)粒 與tetO啟動子的PCR酶切產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化，在卡那霉素抗性平板上挑取單克隆， 電泳鑒定后，測序確認(rèn)后，同時制備^^II酶切產(chǎn)物備用。
第三步，合成GenBank號為AF139129的長雙歧桿菌KJ36質(zhì)粒的復(fù)制蛋白 B序列，其蛋白編碼序列位置在4-1018nt，合成時在兩端添加AatII酶切位點， 序列片段由上海生工合成，測序確認(rèn)無誤；用PCR大量擴(kuò)增該序列，正向引物 為pRl: gcgg^gtacttagtacaaaagggga， 5'端添加Aat II酶切位點，反向引物為 pR2: gc^g^atgatgttcgcggttgcg ， 5'端添加Aat II酶切位點，PCR擴(kuò)增條件為 95°C 3min,再經(jīng)95。C 50 Sec、 54°C 40Sec、 72°C lmin的30次循環(huán)擴(kuò)增；PCR 產(chǎn)物經(jīng)Aat II酶切后連接到第二步所得的質(zhì)粒對應(yīng)的Aat II酶切位點，連接轉(zhuǎn)化， 在卡那霉素抗性平板上挑取單克隆，質(zhì)粒用電泳檢測后測序確認(rèn),并選擇KJ36 片段按順時針方向連接的為標(biāo)準(zhǔn)序列報道的載體，至此，PBES載體構(gòu)建成功， 全長3016bp。載體結(jié)構(gòu)見說明書附圖l。 實施例2
雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES的用途，其特征在于所述的雙歧 桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES用于以雙歧桿菌為受體菌的所有外源基因的 表達(dá)。
以綠色熒光蛋白(EGFP)基因在pBES中的表達(dá)為例說明如下 a)從pEGFP-Nl質(zhì)粒上將EGCFP基因用如下引物擴(kuò)增，pEGFPf: aattggatc gatggtgagcaagggcgaggagc， 5，端設(shè)計Bam HI酶切位點，pEGFPr: tgggcggccgc ttacttgtacagctcgtc， 5'端設(shè)計Not I酶切位點。
b)用Bam HI和Not I分別酶切EGFP的PCR產(chǎn)物和pBES質(zhì)粒，按2: 1 比例混合后連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在卡那霉素抗性平板上挑取單克隆，用 EGFP引物進(jìn)行PCR檢測陽性克隆，該陽性克隆記作pBES-EGFP，提取 pBES-EGFP質(zhì)粒備用。
c) 將雙歧桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期即OD6。。為0.6-0.7時，經(jīng)去離子水配制的 滅菌10%甘油處理后，以雙歧桿菌為受體菌，用電轉(zhuǎn)化法將純化的pBES-EGFP 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到受體菌中；轉(zhuǎn)化條件為15KV、 200Q、 25pF;所述的雙歧桿菌 為受體菌為由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC No: M203050 的兩歧雙歧桿菌SHQ006。
d) 再將轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌先在無抗菌素的MRS液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇 60-120 min，然后在含50|ig/ ml卡那霉素的MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選擇抗性 菌落，從而獲得轉(zhuǎn)EGFP基因的雙歧桿菌，在488nm熒光顯微鏡下可以明顯見 到發(fā)綠色熒光的菌體。表達(dá)效果見說明書附圖2。
實施例3
雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES構(gòu)建的雙歧桿菌-ETEC CFAI重組載 體，將ETECCFAI基因連接到雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES中，其構(gòu) 建方法如下
將產(chǎn)腸毒素大腸桿菌H10407中的CFAI基因，縮寫為ETEC CFAI，經(jīng)PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增并經(jīng)測序證明無誤后用和A^I雙酶切后連接到雙歧 桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES的&/I和I雙酶切位點上，構(gòu)建成轉(zhuǎn)化載 體pBES-ETEC CFA/I; PCR正向引物為tgggagctcaggaggaaatatgca ，反向引物為 tggcgcggccgctagagtgtttgact; PCR擴(kuò)增條件為95°C 5 min，再經(jīng)95°C 50 Sec、 56°C 30Sec、 72°C 5 min的25次循環(huán)擴(kuò)增。
b)以大腸桿菌DH5a為受體菌，用電轉(zhuǎn)化法將pBES-ETEC CFA I質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 到受體菌中；轉(zhuǎn)化條件為13KV、 200Q、 25pF;所述的被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌由中
國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC No: M206117的大腸桿菌 DH5a-pBES-CFAI;驗證結(jié)果見說明書附圖3。
所述的ETEC CFA/I為人的ETEC CFAI。 實施例4
權(quán)利要求3所述的雙歧桿菌-ETEC CFA I重組載體構(gòu)建的口服活疫苗，其 特征在于按以下步驟構(gòu)建-
a)從保藏號為CCTCC No: M206117的大腸桿菌DH5oc-pBES-CFA I中提取 和純化pBES-CFAI質(zhì)粒。
b) 將雙歧桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期即OD6。Q為0.6-0.7時，經(jīng)去離子水配制的 滅菌10%甘油處理后，以雙歧桿菌為受體菌，用電轉(zhuǎn)化法將純化的pBES-CFAI 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到受體菌中；轉(zhuǎn)化條件為15KV、 200Q、 25pF;所述的雙歧桿菌 為受體菌為由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC No: M203050 的兩歧雙歧桿菌SHQ006。
c) 再將轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌先在無抗菌素的MRS液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇 60-120 min，然后在含50|ng/ ml卡那霉素的MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選擇抗性 菌落，從而獲得轉(zhuǎn)ETEC CFAI基因的雙歧桿菌，PCR和SDS-PAGE鑒定后的 陽性克隆即為ETEC CFAI重組載體的種子菌。
d) 將上述經(jīng)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌復(fù)蘇后，涂布于含卡那霉素的抗 性MRS培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)48小時，然后挑取單一的抗性菌落于抗性MRS液體 培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，經(jīng)PCR證實CFA I陽性的雙歧桿菌單菌落再次涂布接種于 含卡那霉素的抗性MRS培養(yǎng)基平板上厭氧培養(yǎng)48小時；然后再挑取單一菌落 于常規(guī)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如此反復(fù)接種培養(yǎng)至繼代培養(yǎng)不低于15代時，經(jīng)PCR 檢測證實CFA I仍然陽性的克隆，可以作為種子菌用于大規(guī)模液體接種擴(kuò)增培
養(yǎng)，驗證結(jié)果見說明書附圖3。
e)將作為種子菌的雙歧桿菌-ETECCFAI接種在含卡那霉素的抗性MRS液 體培養(yǎng)中，在接種后第4、 8、 IO小時分別取樣，培養(yǎng)物經(jīng)離心濃縮后，進(jìn)一步 經(jīng)SDS-PAGE檢測CFA I蛋白的表達(dá)情況，確證重組載體口服活疫苗能夠表達(dá) CFAI，結(jié)果見說明書附圖4。 實施例5
所述雙歧桿菌-ETEC CFAI重組載體口服活疫苗的應(yīng)用，其特征在于制 成雙歧桿菌發(fā)酵乳制劑、膠囊等劑型的雙歧桿菌-ETEC CFA I重組載體口服活 疫苗，用于預(yù)防和治療ETEC引發(fā)腹瀉性疾病。
雙歧桿菌發(fā)酵乳制劑的制作方法如下
a) 配方鮮牛奶 52%、白砂糖7.8%、磷酸二氫鈉0.2%、水 40°/。、卡
那霉素0.005%;操作時先用熱水溶解白糖和磷酸二氫鈉，攪拌均勻，隨后與 鮮奶混合，通過雙聯(lián)過濾器進(jìn)入離心凈乳機(jī)，除去雜質(zhì)。
b) 12(TC瞬時殺菌，時間10秒，為最大限度地保持牛奶的養(yǎng)分，物料進(jìn)入 平衡缸，經(jīng)離心式衛(wèi)生泵送人板式熱交換器，經(jīng)過預(yù)熱、高溫殺菌、保溫、冷 卻，達(dá)到殺菌的目的。
c) 在高壓均質(zhì)機(jī)中進(jìn)行均質(zhì)，兩次均質(zhì)均采用兩段均質(zhì)。 一段均質(zhì)壓力為 70kgf / cm2， 二段均質(zhì)壓力為30kgf / cm2。
d) 接種及發(fā)酵首先接種5%轉(zhuǎn)化雙歧桿菌發(fā)酵菌種液，37'C培養(yǎng)9小時 左右，終止酸度為804。
e) 罐裝按5mL規(guī)格進(jìn)行玻璃安培罐裝，真空封口， 4'C保藏。
f)微生物指標(biāo)活性雙歧桿菌數(shù)》l(^cfu / mL，大腸菌群數(shù)〈30cfii / 100mL， 致病菌不得檢出。
實施例6
雙歧桿菌膠囊制劑的制作方法如下
a) MRS液體培養(yǎng)基配方蛋白胨1.0% 、葡萄糖0.1% 、酵母汁0.1%、 牛肉膏1.0%、 K2HPO4 0.2%、 L-半胱氨酸鹽酸鹽0.02% 、卡那霉素0.005%、 蒸餾水1000ml， pH值調(diào)至7.0，攪拌混合均勻，隨后通過雙聯(lián)過濾器進(jìn)入離心 凈乳機(jī)，除去雜質(zhì)。
b) 120'C瞬時殺菌，時間10秒，為最大限度地保持培養(yǎng)基的養(yǎng)分，物料進(jìn) 入平衡缸，經(jīng)離心式衛(wèi)生泵送人板式熱交換器，經(jīng)過預(yù)熱、高溫殺菌、保溫、 冷卻，達(dá)到殺菌的目的。
c) 在高壓均質(zhì)機(jī)中進(jìn)行均質(zhì)，兩次均質(zhì)均采用兩段均質(zhì)。 一段均質(zhì)壓力為 70kgf / cm2， 二段均質(zhì)壓力為30kgf / cm2。
d) 接種及發(fā)酵首先接種5Q/^轉(zhuǎn)化雙歧桿菌發(fā)酵菌種液，37"C培養(yǎng)9小時 左右，終止酸度為80G丁。
f) 將上述雙歧桿菌發(fā)酵液離心(3500 g， 15min， 4'C)收集菌體，洗滌，重 新懸浮在生理鹽水中，調(diào)整菌體最終濃度》1.0X 101Q個/ ml。
g) 將上述濃縮菌液與海藻酸鈉溶液混合均勻后加入植物油中，在攪拌器上 攪拌至形成一個無明顯水相的均勻混濁乳狀液。然后快速地加入CaCl2水溶液， 直至w / O乳狀液被破壞，形成海藻酸鈣膠粒。膠粒通過輕柔地離心(400 g， 10min) 收集，洗滌，真空冷凍干燥。
h) 裝填到膠囊殼中，鋁塑薄膜厭氧密封，4'C保存。
i) 微生物指標(biāo)活性雙歧桿菌數(shù)》109cfU / g，大腸菌群數(shù)〈30cfU / 100mL，致病菌不得檢出。
權(quán)利要求
1、一種雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES，其特征在于所述的pBES載體是由GenBank號為U13856的pGEX-5x-1為骨架改造而來；該載體的構(gòu)建步驟如下第一步，用卡那霉素抗性基因替換pGEX-5x-1質(zhì)粒1344-2220nt的Ampicillin抗性基因的序列區(qū)，即(a)先用PCR方法從GenBank號為EU233623的質(zhì)粒pEASY-T1上擴(kuò)增1203-2114nt片段，得到卡那霉素抗性基因，正向PCR引物為agtagacgtcctggtaag gttgggaag，位置在1203-1219nt，5’端添加AatII酶切位點，反向引物為acgtcagtggctgcaattcagaag aactcgtc，位置在2114-2085nt，5’端添加AlwN1酶切位點；PCR擴(kuò)增條件為95℃ 4min，經(jīng)95℃ 40Sec、55℃30Sec、72℃ 1min循環(huán)擴(kuò)增25次；(b)將上述PCR純化產(chǎn)物和pGEX-5x-1質(zhì)粒分別用AatII和AlwN1雙酶切，回收酶切后的PCR產(chǎn)物和pGEX-5x-1大片段按1∶2混合連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取在卡那霉素抗性平板上生長陽性單克隆，再一次在卡那霉素抗性平板上劃線純化，同時在青霉素平板上劃線培養(yǎng)而不能生長的單菌落一定是陽性菌落，然后測序確認(rèn)；第二步，以第一步所得到陽性菌落中的質(zhì)粒為模板，用高保真Taq DNA聚合酶通過PCR擴(kuò)增，以四環(huán)素tetO啟動子替換pGEX-5x-1質(zhì)粒183-932上的Ptac啟動子，同時刪除pGEX-5x-1質(zhì)粒上3301-4420nt的LacIq片段，引物pF1為pGEX-5x-1上的多克隆位點序列，pR1為LacIq上游序列，引物序列如下pF1attaggatccccgaattcccg，5’端添加BamHI酶切位點；pR1tcgaccgcggattcaccaccctg aattgac，5’端添加SacII酶切位點，PCR擴(kuò)增條件為95℃ 4min，經(jīng)95℃ 40Sec、52℃ 30Sec、72℃ 1min循環(huán)擴(kuò)增30次，PCR產(chǎn)物用BamHI和SacII雙酶切備用；同時，用BamHI和SacII酶切切取由上海生物工程技術(shù)公司合成的tetO啟動子序列，其序列如下tcgaccgcggactggccgtcgttttactccctatcagtg atag agattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacctgaggagggatccctag，其中ctggccgtcgtttta為M13測序引物序列；然后將BamHI和SacII酶切后的質(zhì)粒與tetO啟動子的PCR酶切產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化，在卡那霉素抗性平板上挑取單克隆，電泳鑒定后，測序確認(rèn)后，同時制備Aat II酶切產(chǎn)物備用；第三步，合成GenBank號為AF139129的長雙歧桿菌KJ36質(zhì)粒的復(fù)制蛋白B序列，其蛋白編碼序列位置在4-1018nt，合成時在兩端添加Aat II酶切位點，序列片段由上海生工合成，測序確認(rèn)無誤；用PCR大量擴(kuò)增該序列，正向引物為pR1gcgacgtcgtacttagtacaaaagggga，5’端添加Aat II酶切位點，反向引物為pR2gcgacgtcatgatgttcgcggttgcg，5’端添加Aat II酶切位點，PCR擴(kuò)增條件為95℃ 3min，再經(jīng)95℃ 50Sec、54C 40Sec、72℃ 1min的30次循環(huán)擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物經(jīng)Aat II酶切后連接到第二步所得的質(zhì)粒對應(yīng)的Aat II酶切位點，連接轉(zhuǎn)化，在卡那霉素抗性平板上挑取單克隆，質(zhì)粒用電泳檢測后測序確認(rèn)，并選擇KJ36片段按順時針方向連接的為標(biāo)準(zhǔn)序列報道的載體；至此，pBES載體構(gòu)建成功，全長3016bp。
2、權(quán)利要求1所述雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES的用途，其特征 在于所述的雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES用于以雙歧桿菌為受體菌 的所有外源基因的表達(dá)。
3、權(quán)利要求1所述雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES構(gòu)建的雙歧桿菌 -ETEC CFA/I重組載體，其特征在于將ETEC CFA/I基因連接到雙歧桿菌-大 腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES中，其構(gòu)建方法如下a)、將產(chǎn)腸毒素大腸桿菌H10407中的CFA/I基因，縮寫為ETEC CFM，經(jīng) PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增并經(jīng)測序證明無誤后用6^/1和WW I雙酶切后連接到 雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES的S"ZI和油f I雙酶切位點上，構(gòu)建成轉(zhuǎn) 化載體pBES-ETECCFA/I; PCR正向引物為tgggagctcaggaggaaatatgca，反向引 物為tggcgcggccgctagagtgtttgact; PCR擴(kuò)增條件為95°C 5 min，再經(jīng)95°C 50 Sec、 56°C 30Sec、 72°C 5 min的25次循環(huán)擴(kuò)增;b)以大腸桿菌DH5oc為受體菌，用電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體菌中；轉(zhuǎn)化條 件為13KV、 200Q、 25pF;所述的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌由中國典型培養(yǎng)物保藏中心 保藏，保藏號為CCTCC No: M206117的大腸桿菌DH5a-pBES-CFAI 。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙歧桿菌-ETEC CFA/I重組載體，其特征在于 所述的ETEC CFA/I為人的ETEC CFA/1。
5、 權(quán)利要求3所述的雙歧桿菌-ETEC CFA/I重組載體構(gòu)建的口服活疫苗，其特征在于按以下步驟構(gòu)建a)、從保藏號為CCTCC No: M206117的大腸桿菌DH5a-pBES-CFA I中提 取和純化pBES-CFA I質(zhì)粒；b) 、將雙歧桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期即OD6oo為0.6-0.7時，經(jīng)去離子水配制 的滅菌10%甘油處理后，以雙歧桿菌為受體菌，用電轉(zhuǎn)化法將純化的pBES-CFA I質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到受體菌中；轉(zhuǎn)化條件為15KV、 200Q、 25pF;所述的雙歧桿 菌為受體菌為由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNo: M203050 的兩歧雙歧桿菌SHQ006;c) 、再將轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌先在無抗菌素的MRS液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇 60-120 min，然后在含50ng/ml卡那霉素的MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選擇抗性 菌落，從而獲得轉(zhuǎn)ETEC CFA/I基因的雙歧桿菌，PCR和SDS-PAGE鑒定后的 陽性克隆即為ETEC CFA/I重組載體的種子菌；d) 將上述經(jīng)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌復(fù)蘇后，涂布于含卡那霉素的抗 性MRS培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)48-72小時，然后挑取單一的抗性菌落于抗性MRS 液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，經(jīng)PCR證實CFA/I陽性的雙歧桿菌單菌落再次涂布接 種于含卡那霉素的抗性MRS培養(yǎng)基平板上厭氧培養(yǎng)48-72小時；然后再挑取單 一菌落于常規(guī)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如此反復(fù)接種培養(yǎng)至繼代培養(yǎng)不低于15代時， 經(jīng)PCR檢測證實CFA/I仍然陽性的克隆，可以作為種子菌用于大規(guī)模液體接種 擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)物經(jīng)離心濃縮，進(jìn)一步制備成轉(zhuǎn)ETEC CFA/I基因的雙歧桿菌 -ETEC CFA/I重組載體口服活疫苗制劑。
6、權(quán)利要求5所述雙歧桿菌-ETEC CFA/I重組載體口服活疫苗的應(yīng)用， 其特征在于制成乳酸發(fā)酵制劑、片劑和膠囊制劑的雙歧桿菌-ETEC CFA/I重 組載體口服活疫苗，用于預(yù)防和治療ETEC引發(fā)腹瀉性疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES以及由其構(gòu)建的雙歧桿菌-ETEC CFA/I重組載體、雙歧桿菌-ETEC CFA/I重組載體口服活疫苗及其用途。所述的pBES載體是由GenBank號為U13856的pGEX-5x-1為骨架改造而來；所述的雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES用于以雙歧桿菌為受體菌的所有外源基因的表達(dá)。用上述雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES構(gòu)建的雙歧桿菌-ETEC CFA/I重組載體；所述的ETEC CFA/I為人的ETEC CFA/I。上述雙歧桿菌-ETEC CFA/I重組載體構(gòu)建的口服活疫苗；上述雙歧桿菌-ETEC CFA/I重組載體口服活疫苗的應(yīng)用，用于預(yù)防和治療ETEC引發(fā)腹瀉性疾病。本發(fā)明可以通過基因工程手段讓雙歧桿菌替代傳統(tǒng)的ETEC疫苗中CFA/I的受體菌，既解決了活疫苗構(gòu)建的載體系統(tǒng)的安全性問題，又發(fā)揮了雙歧桿菌抑制腸道病原菌的微生態(tài)效應(yīng)。
文檔編號C12N15/63GK101182532SQ20071009297
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月13日
發(fā)明者宋方洲, 馬永平 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)