專利名稱：甘露聚糖肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘露聚糖肽的一種制備方法。
背景技術(shù)：
甘露聚糖肽是從a-溶血鏈球菌(Str印tococcus hemolyticus-a -Hemolysis) H,S_33號(hào)菌經(jīng)深層發(fā)酵、分離提取的糖肽類物質(zhì)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi) 能提升外周白細(xì)胞，增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能，活化吞噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞， 誘導(dǎo)胸腺淋巴細(xì)胞產(chǎn)生活性物質(zhì)，改善和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和應(yīng)激能力。臨床 上主要用于惡性腫瘤放、化療中改善免疫功能低下的輔助治療。
甘露聚糖肽是一種高分子生物聚合物，其聚合程度和鏈長(zhǎng)的不同使得其分 子大小也不相同，通常a-溶血鏈球菌HtS-33號(hào)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，甘露聚糖肽 的重均分子量分布在1萬至100萬之間。研究表明，甘露聚糖肽的重均分子量 太小，其免疫活性較低，太大則作為外源性生物大分子異物，能引起機(jī)體產(chǎn)生 過敏等諸多不良反應(yīng)。因此，作為藥用甘露聚糖肽，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定甘露 聚糖肽原料藥的重均分子量應(yīng)為40000 90000，注射用甘露聚糖肽用的重均分 子量應(yīng)為40000 65000。以此在確保療效的前提下，保證其異常毒性、過敏試 驗(yàn)、細(xì)菌內(nèi)毒素等指標(biāo)符合規(guī)定，確保用藥安全。
.中國(guó)專利CN1172952C公開了一種"甘露聚糖肽組合物及其制備工藝和用 途"，在其說明書3 4頁(yè)公開了甘露聚糖肽的制備方法，該方法的缺點(diǎn)是成本 高、勞動(dòng)強(qiáng)度大，收率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種甘露聚糖肽的制備方法，該方法成 本低、收率高。
本發(fā)明甘露聚糖肽的制備方法包括如下步驟-
(1)制備發(fā)酵產(chǎn)物a-溶血鏈球菌H,S-33號(hào)菌的深層發(fā)酵液，經(jīng)滅活、濃 縮、乙醇沉淀得到含有甘露聚糖肽的發(fā)酵產(chǎn)物； .(2)提取、除雜質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)物加3 10倍量(W/V)的純化水，在攪拌下進(jìn) 行提取，然后用三氯乙酸調(diào)節(jié)pH1.5 3.5，靜置、除去雜質(zhì)得到清液；(3) 乙醇分級(jí)沉淀將清液在攪拌下加濃度90%以上乙醇至20% 40%乙醇濃 度，靜置4 24小時(shí)，分離沉淀，得一次沉淀物；清液繼續(xù)加濃度90%
以上乙醇至50% 80%乙醇濃度，靜置4 24小時(shí)，分離沉淀，得二次
沉淀物；
(4) 一次沉淀物的水解將一次沉淀物用溶菌酶、淀粉酶和纖維素酶中任意 一種或者用鹽酸、磷酸、乙酸和氫氟酸中任意一種進(jìn)行水解。
上述步驟(4)中酶水解的步驟如下 一次沉淀物用5 20倍量(W/V)的 純化水溶解，調(diào)整pH6.0 8.0，按500 100000U/g的量加入所述溶菌酶、淀粉 酶和纖維素酶中任意一種，20 6(TC保溫4 20小時(shí)，加熱至沸，冷卻至室溫， 調(diào)整pH2.0 3.0，濾過，得甘露聚糖肽水溶液。
上述步驟(4)中酸水解的步驟如下 一次沉淀物用5 20倍量(W/V)濃 度0.5 5%鹽酸、磷酸、乙酸和氫氟酸中任意一種溶液溶解，加熱60 105'C并 保溫1 8小時(shí)，冷卻，調(diào)整pH值中性，得甘露聚糖肽水溶液。
口服用甘露聚糖肽原料的精制，將二次沉淀物溶于經(jīng)過水解的一次沉淀物 中，過濾至清，取樣測(cè)定重均分子量和分布寬度，合格者用濃度50 80%乙醇 沉淀，靜置、離心或?yàn)V過分離沉淀物，干燥得甘露聚糖肽原料；不合格者，用 超濾的方法去除小分子和大分子甘露聚糖肽，再用乙醇沉淀，靜置、離心或?yàn)V 過分離沉淀物，干燥得口服用甘露聚糖肽原料。
注射用甘露聚糖肽原料的精制，將二次沉淀物溶于經(jīng)過水解的一次沉淀物 中，用5 20倍量(W/V)的蒸餾水溶解，按O. 1 5% (重量)的比例加入活性 炭，70 1(XTC保溫10 60分鐘，冷卻、濾過，清液用50 80%乙醇沉淀，靜置、 離心或?yàn)V過分離沉淀物，無水乙醇或丙酮脫水后干燥得注射用甘露聚糖肽原料。 本發(fā)明是以a -溶血鏈球菌H,S-33號(hào)菌的深層發(fā)酵產(chǎn)物為基礎(chǔ)，用純化水 i攪拌下進(jìn)行提取，用三氯乙酸沉除溶于水的蛋白雜質(zhì)后，再用乙醇分級(jí)沉淀 的方法將符合與超過藥用分子量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的甘露聚糖肽分離出來，大分子甘露 聚糖肽部分經(jīng)酶解或酸解后，與分子量符合規(guī)定的甘露聚糖肽部分合并，用超 濾的方法控制其重均分子量的分布寬度，再經(jīng)活性炭吸附、乙醇沉淀、脫水干 燥，得到符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的甘露聚糖肽。
本發(fā)明的制備方法實(shí)用性強(qiáng)，工藝技術(shù)簡(jiǎn)單易掌握、由于對(duì)大分子甘露聚 糖肽的水解利用，生產(chǎn)成本降低、產(chǎn)品收率提高，與中國(guó)專利CN1172952C中的 方法比較產(chǎn)品收率可增加60%以上，有利于在工業(yè)化生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。 下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，見中國(guó)專利CN1172952C說明書第3 4 頁(yè)所公開的內(nèi)容，即a-溶血鏈球菌H,S-33號(hào)菌的深層發(fā)酵液經(jīng)過滅活、濃縮、 乙醇沉淀得到含有甘露聚糖肽的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)物1000g加8000ml的純化水， 在攪拌下進(jìn)行提取，然后用三氯乙酸調(diào)節(jié)pH2.0，靜置、離心或?yàn)V過除去雜質(zhì)， 清液在攪拌下加濃度95%乙醇至40%乙醇濃度，靜置16小時(shí)，離心或?yàn)V過分離 沉淀，得一次沉淀物，重均分子量100000以上；清液在攪拌下繼續(xù)加乙醇至 75%乙醇濃度，靜置16小時(shí)，離心或?yàn)V過分離沉淀得二次沉淀物，重均分子量 為70000左右。將一次沉淀物加15倍量(W/V)的純化水溶解，調(diào)整pH值7. 5 8.0，按10000U/g的量加入溶菌酶，混勻，40。C保溫水解4小時(shí)左右，測(cè)定重 均分子量在50000至80000之間，加熱煮沸10分鐘，冷卻，調(diào)節(jié)pH值3.0左 右，將上述二次沉淀物溶于其中，過濾至清，加乙醇至75%乙醇濃度，靜置， ,心分離沉淀，沉淀物用無水乙醇或丙酮脫水后干燥即得口服用甘露聚糖肽原 料。甘露聚糖肽得量在105 120g，按發(fā)酵產(chǎn)物計(jì)收率為10.5 12.0°/0。
實(shí)施例2
發(fā)酵產(chǎn)物的制備同實(shí)施例1。發(fā)酵產(chǎn)物1000g加10000ml的純化水，在攪 拌下進(jìn)行提取，然后用三氯乙酸調(diào)節(jié)pH3.5，靜置、離心或?yàn)V過除去雜質(zhì)，清 液在攪拌下加濃度90%乙醇至20%乙醇濃度，靜置20小時(shí)，離心或?yàn)V過分離沉 淀，得一次沉淀物，重均分子量150000以上；清液在攪拌下繼續(xù)加濃度90%乙 醇至50%乙醇濃度，靜置20小時(shí)，離心或?yàn)V過分離沉淀得二次沉淀物，重均分 子量為80000左右。將一次沉淀物加20倍量(W/V)的濃度5%鹽酸溶解，加熱 至105t:并保溫水解5小時(shí)左右，冷卻，調(diào)節(jié)pH值7.0左右，將上述二次沉淀 物溶于其中，用20倍量(W/V)的蒸餾水溶解，按重量5%的比例加入活性炭， 1'0(TC保溫60分鐘，冷卻、濾過，清液用50%乙醇沉淀，靜置、離心或?yàn)V過分 離沉淀物，無水乙醇或丙酮脫水后干燥得注射用甘露聚糖肽原料。甘露聚糖肽 按發(fā)酵產(chǎn)物計(jì)收率為9. 7 11. 2%。
權(quán)利要求
1.一種甘露聚糖肽的制備方法，其特征在于，該制備方法包括如下步驟(1)制備發(fā)酵產(chǎn)物α-溶血鏈球菌H1S-33號(hào)菌的深層發(fā)酵液，經(jīng)滅活、濃縮、乙醇沉淀得到含有甘露聚糖肽的發(fā)酵產(chǎn)物；(2)提取、除雜質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)物加3～10倍量(W/V)的純化水，在攪拌下進(jìn)行提取，然后用三氯乙酸調(diào)節(jié)pH1.5～3.5，靜置、除去雜質(zhì)得到清液；(3)乙醇分級(jí)沉淀將清液在攪拌下加濃度90％以上乙醇至20％～40％乙醇濃度，靜置4～24小時(shí)，分離沉淀，得一次沉淀物；清液繼續(xù)加濃度90％以上乙醇至50％～80％乙醇濃度，靜置4～24小時(shí)，分離沉淀，得二次沉淀物；(4)一次沉淀物的水解將一次沉淀物用溶菌酶、淀粉酶和纖維素酶中任意一種或者用鹽酸、磷酸、乙酸和氫氟酸中任意一種進(jìn)行水解。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種甘露聚糖肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(4) 中酶水解的步驟如下 一次沉淀物用5 20倍量(W/V)的純化水溶解，調(diào)整 pH6.0 8.0，按500 100000U/g的量加入所述溶菌酶、淀粉酶和纖維素酶中 任意一種，20 60。C保溫4 20小時(shí)，加熱至沸，冷卻至室溫，調(diào)整pH2.0 3.0，濾過，得甘露聚糖肽水溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種甘露聚糖肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(4) 中酸水解的步驟如下 一次沉淀物用5 20倍量(W/V)濃度0.5 5%鹽酸、 磷酸、乙酸和氫氟酸中任意一種溶液溶解，加熱60 105。C并保溫1 8小時(shí)，'冷卻，調(diào)整pH值中性，得甘露聚糖肽水溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任意所述一種甘露聚糖肽的制備方法，其特征在于，將二 次沉淀物溶于經(jīng)過水解的一次沉淀物中，過濾至清，用濃度50 80%乙醇沉淀， 靜置、分離沉淀物，干燥。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任意所述一種甘露聚糖肽的制備方法，其特征在于，將 二次沉淀物溶于經(jīng)過水解的一次沉淀物中，用5 20倍量(W/V)的蒸餾水溶 解，按0. 1 5% (重量)的比例加入活性炭，70 10(TC保溫10 60分鐘，冷 卻、濾過，清液用濃度50 80%乙醇沉淀，靜置、分離沉淀物，干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘露聚糖肽的制備方法。該方法包括如下步驟制備發(fā)酵產(chǎn)物，提取、除雜質(zhì)，乙醇分級(jí)沉淀，一次沉淀物的水解。本發(fā)明的制備方法實(shí)用性強(qiáng)，工藝技術(shù)簡(jiǎn)單易掌握、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品收率高。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101186942SQ20071009310
公開日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2007年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日
發(fā)明者曾康芬, 麗 李, 泉 江, 王君山, 琳 艾, 郭才旺, 爽 陳, 馬宏偉 申請(qǐng)人:成都川抗萬樂藥業(yè)有限公司