專利名稱：一種莖-環(huán)型寡聚核苷酸探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核苷酸結(jié)構(gòu)，具體涉及作為探針的核苷酸的結(jié)構(gòu)。
背景技術(shù)：
莖-環(huán)狀寡核苷酸(stem-loop oligonucleotides)是分子生物學(xué)和生物技術(shù) 領(lǐng)域的常用工具之一。與線性寡核苷酸相比，莖-環(huán)狀寡核苷酸與靶分子的雜交 或結(jié)合具有更高的特異性，并可以根據(jù)不同的應(yīng)用需求靈活設(shè)計(jì)不同形式的莖-環(huán)狀寡核苷酸，例如分子信標(biāo)(molecular beacons)、抑制性聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) 、 LiJX(light upon extension)弓|物等。巨 前，莖-環(huán)狀寡核苷酸已經(jīng)以不同的形式應(yīng)用于多種分子生物學(xué)技術(shù)，主要包括 單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)、基因突變分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和生物芯片等，充分展 示和體現(xiàn)了莖-環(huán)狀寡核苷酸在分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。對(duì)于莖-環(huán)狀寡核苷酸而言，它的莖部熱力學(xué)穩(wěn)定性是維持其自身二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的關(guān)鍵 因素，因此，只要合理設(shè)計(jì)莖-環(huán)狀寡核苷酸的堿基組成，就可以使靶分子能夠 在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下破壞莖-環(huán)狀寡核苷酸的莖部穩(wěn)定性，并使其二級(jí)結(jié)構(gòu)解體， 然后，就可以通過檢測(cè)與其二級(jí)結(jié)構(gòu)解體相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)來達(dá)到對(duì)靶向子的檢 測(cè)。
目前常規(guī)應(yīng)用的莖-環(huán)狀寡聚核苷酸探針以分子信標(biāo)最為常見。分子信標(biāo)的序 列組成包括環(huán)部和莖部序列，并通常在莖部末端的對(duì)稱堿基標(biāo)記上一對(duì)符合熒光 共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)規(guī)則的報(bào)告基 團(tuán)和淬滅基團(tuán)。分子信標(biāo)的環(huán)部是耙分子識(shí)別區(qū)，環(huán)部則是維持熱力學(xué)穩(wěn)定性的 結(jié)構(gòu)。當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶分子時(shí)，分子信標(biāo)的環(huán)部與靶分子發(fā)生雜交反應(yīng)，并 且，這種雜交反應(yīng)能使莖部解體成單鏈分子，從而使標(biāo)記在莖部末端的報(bào)告基團(tuán) 和淬滅基團(tuán)的空間距離增大，導(dǎo)致報(bào)告基團(tuán)不再受淬滅基團(tuán)的影響而發(fā)出熒光。但是，由于這種莖-環(huán)狀寡聚核苷酸的靶分子識(shí)別區(qū)的初始狀態(tài)為單鏈形式，因 此，它與靶分子結(jié)合的特異性有待進(jìn)一步提高；此外，由于莖部序列較短，從而 使它的熱力學(xué)亞穩(wěn)定性較低，因此，設(shè)計(jì)難度很高，對(duì)靶分子的序列組成也有一 定的特殊要求，從而在一定程度上限制了應(yīng)用范疇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是進(jìn)一步提高莖-環(huán)狀寡聚核苷酸探針的特異性和 設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)便性。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是，
一種莖-環(huán)狀寡聚核苷酸探針，該探針具有莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)的初始狀態(tài)，由 環(huán)部和莖部構(gòu)成，莖部是兩段互補(bǔ)的堿基序列通過氫鍵結(jié)合形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，與 靶分子特異性結(jié)合的識(shí)別區(qū)主要由探針的莖部序列組成；當(dāng)反應(yīng)體系中沒有靶分 子存在時(shí)，所述的識(shí)別區(qū)以初始狀態(tài)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在；當(dāng)反應(yīng)體系中有靶分子存 在時(shí)，靶分子與所述的識(shí)別區(qū)特異性結(jié)合時(shí)，莖部的發(fā)卡結(jié)構(gòu)解體，同時(shí)探針或 靶分子產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)差異。
本發(fā)明探針還可以在莖部的中間或自由端對(duì)稱地標(biāo)記有能產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的 標(biāo)記物，當(dāng)莖部的發(fā)卡結(jié)構(gòu)解體時(shí)能產(chǎn)生信號(hào)的差異。
本發(fā)明探針還可以在本發(fā)明探針的部分或全部堿基標(biāo)記有能產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào) 的標(biāo)記物，從而可以檢測(cè)本發(fā)明探針-靶分子復(fù)合體在形成前后產(chǎn)生信號(hào)的差異。
本發(fā)明探針可以有多種實(shí)現(xiàn)方式本發(fā)明探針既可以由一條單鏈寡核苷酸通 過內(nèi)部堿基互補(bǔ)結(jié)合形成，即單體探針；也可以是存在一定堿基互補(bǔ)關(guān)系的兩條 單鏈寡核苷酸結(jié)合形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，即雙體探針；本發(fā)明探針的莖部末端可以是 平端，也可以是粘性末端。
本發(fā)明探針中的靶分子識(shí)別區(qū)可以全部由莖部序列組成，也可以由莖部和環(huán) 部序列組成，還可以由莖部和粘性末端序列組成。
構(gòu)成本發(fā)明探針的核酸分子根據(jù)不同靶分子的需要，可以全部或部分是核酸、 肽核酸(p印tide nucleic acid, PNA)、鎖核酸(locked nucleic acid, 固)或 其它類似物，核酸分子上的堿基可以是天然堿基或其類似物；探針的5'-和/或3'-末端可以進(jìn)行磷酸基團(tuán)、羥基基團(tuán)或其它類似基團(tuán)的修飾或標(biāo)記。
在本發(fā)明中，對(duì)所述粘性末端的長(zhǎng)度沒有特別限制，通常其長(zhǎng)度為3 20 bp, 最佳是4 6 bp。
在本發(fā)明中，對(duì)本發(fā)明探針?biāo)霏h(huán)部的長(zhǎng)度沒有特別限制，通常其長(zhǎng)度為3 20 bp，最佳是4 6 bp。
在本發(fā)明中，對(duì)本發(fā)明探針?biāo)鲎R(shí)別區(qū)的長(zhǎng)度沒有特別限制，通常其長(zhǎng)度為 8 50 bp,最佳是15 30 bp。
在本發(fā)明中，對(duì)本發(fā)明探針?biāo)銮o部的長(zhǎng)度沒有特別限制，通常其長(zhǎng)度為8 50 bp，較佳為10 40 bp，最佳是15 30 bp。
在本發(fā)明中，為了提高檢測(cè)的特異性，本發(fā)明探針中的互補(bǔ)區(qū)可以引入人工 錯(cuò)配堿基，所述人工錯(cuò)配堿基是天然的A、 T、 C、 G四種堿基或其類似物。
本發(fā)明探針還可以在任意一個(gè)部位引入支鏈寡核苷酸，引入寡核苷酸序列不 影響亞穩(wěn)定寡核苷酸探針特異性識(shí)別結(jié)合或互補(bǔ)雜交靶分子的生物學(xué)活性，同時(shí) 又有利于將亞穩(wěn)定寡核苷酸探針固定于固相基質(zhì)的表面。
本發(fā)明還可在固相基質(zhì)表面和/或本發(fā)明探針(或靶分子)標(biāo)記、修飾或合成有 手臂分子，并通過二者之間的手臂分子，或手臂分子與其它分子的相互作用將本 發(fā)明探針(或靶分子)固定于固相基質(zhì)表面。
本發(fā)明探針的莖部發(fā)卡結(jié)構(gòu)解體時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)可以通過(但并不限于) 以下方式實(shí)現(xiàn)
(1)在本發(fā)明探針的末端和/或莖部的中間標(biāo)記上符合熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)的兩個(gè)或多個(gè)適合鑒另U的基 團(tuán)分子，包括熒光基團(tuán)、稀有元素或非熒光發(fā)色基團(tuán)、淬滅基團(tuán)或其它類似基團(tuán)， 靶向不同靶分子的本發(fā)明探針可以標(biāo)記上不同或相同的基團(tuán)分子，探針與耙分子 反應(yīng)的前后，基團(tuán)分子產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)被淬滅或釋放，從而存在可檢測(cè)信號(hào)的 差異。例如，在探針莖部?jī)蓷l互補(bǔ)鏈的對(duì)稱末端堿基標(biāo)記上熒光基團(tuán)(如FAM) 和淬滅基團(tuán)(如Dabcyl)，當(dāng)反應(yīng)體系中不存在耙分子時(shí)，熒光基團(tuán)(如FAM)發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)(如Dabcyl)吸收，從而在反應(yīng)體系中檢測(cè)不到熒光 信號(hào)，或者熒光信號(hào)弱，但是，當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶分子時(shí)，靶分子與本發(fā)明探 針的識(shí)別區(qū)特異性結(jié)合或互補(bǔ)雜交，使本發(fā)明探針在初始狀態(tài)的莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié) 構(gòu)解體，熒光基團(tuán)(如FAM)發(fā)射的熒光能量不再被淬滅基團(tuán)(如Dabcyl)吸收， 從而在反應(yīng)體系中檢測(cè)能夠檢測(cè)到熒光信號(hào)，或者熒光信號(hào)增強(qiáng)，并且，可以通 過熒光信號(hào)有無和/或強(qiáng)度的變化達(dá)到對(duì)耙分子的定性和/或定量檢測(cè)。
(2) 在本發(fā)明探針的部分或全部堿基上標(biāo)記有熒光分子、發(fā)光基團(tuán)、生物素、 地高辛分子、同位素或其它類似發(fā)光分子或適合鑒別的標(biāo)記分子，其特征是通過 檢測(cè)反應(yīng)體系中本發(fā)明探針-耙分子復(fù)合體中的本發(fā)明探針標(biāo)記分子的信號(hào)達(dá)到 對(duì)靶分子的定性或定量檢測(cè)。例如，將靶分子經(jīng)物理吸附和/或化學(xué)耦聯(lián)方法固 定于固相基質(zhì)(包括生物芯片、微陣列、其它類似陣列或微珠等)的表面，當(dāng)本 發(fā)明探針與靶分子作用后，本發(fā)明探針-靶分子復(fù)合體就被固定于生物芯片等的 表面，通過檢測(cè)上述標(biāo)記分子的信號(hào)，即可達(dá)到對(duì)靶分子的定性和/或定量檢測(cè)。
(3) 靶分子采用適當(dāng)方法在一個(gè)或多個(gè)堿基標(biāo)記有熒光分子、發(fā)光基團(tuán)、生物 素、地高辛分子、同位素或其它類似發(fā)光分子或適合鑒別的標(biāo)記分子，其特征是 通過檢測(cè)反應(yīng)體系中本發(fā)明探針-靶分子復(fù)合體中與上述標(biāo)記分子對(duì)應(yīng)的可檢測(cè) 信號(hào)的變化情況達(dá)到對(duì)靶分子的定性和/或定量檢測(cè)。例如，將本發(fā)明探針固定 于生物芯片、微陣列、其它類似陣列或微珠的表面，當(dāng)液相中的耙分子與本發(fā)明 探針作用后，本發(fā)明探針-靶分子復(fù)合體就被固定于生物芯片等的表面，通過檢 測(cè)上述表面的標(biāo)記分子信號(hào)，即可達(dá)到對(duì)靶分子的定性和/或定量檢測(cè)。
本發(fā)明探針檢測(cè)靶分子的原理是當(dāng)含有本發(fā)明探針的反應(yīng)體系中不存在耙 分子時(shí)，本發(fā)明探針保持其亞穩(wěn)定莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)的初始狀態(tài)；但是，當(dāng)含有 本發(fā)明探針的反應(yīng)體系中存在靶分子時(shí)，靶分子與本發(fā)明探針的識(shí)別區(qū)相互作 用，并且，這種作用能夠使本發(fā)明探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)解體，并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的差 異(包括可檢測(cè)信號(hào)的有無和/或強(qiáng)度的變化)，最后，通過上述可檢測(cè)信號(hào)的有 無和/或強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)物中靶分子的定性和/或定量檢測(cè)。本發(fā)明探針
的熱力學(xué)亞穩(wěn)定性的維持依靠其自身內(nèi)部核酸互補(bǔ)序列形成的莖部穩(wěn)定性維持， 該穩(wěn)定性使本發(fā)明探針可以在一定條件下保持其自身莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，例如，將本發(fā)明探針于適當(dāng)離子強(qiáng)度(例如0.5MNa+)高溫變性(例如95 °C 5min)，并隨后緩慢降至室溫后，本發(fā)明探針即可形成亞穩(wěn)定的莖-環(huán)狀二級(jí) 結(jié)構(gòu)。但是，當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶分子時(shí)，本發(fā)明探針的識(shí)別區(qū)與靶分子特異性 結(jié)合或互補(bǔ)雜交，使本發(fā)明探針莖部的雙鏈核酸區(qū)解體，并最終破壞本發(fā)明探針 原有的莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明探針檢測(cè)靶分子方法可以通過(但并不限于)以下方式實(shí)現(xiàn)
(1) 使用本發(fā)明所述本發(fā)明探針的核酸擴(kuò)增方法，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)熒光PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、連 接酶鏈反應(yīng)(LCR)、鏈取代反應(yīng)(LCR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo) 的擴(kuò)增和滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)或其它類似擴(kuò)增方法。
(2) 使用本發(fā)明所述本發(fā)明探針的核酸雜交方法，例如Southern雜交、 Northern雜交、Western雜交或其它類似雜交方法。
(3)使用本發(fā)明所述本發(fā)明探針的生物芯片，例如微陣列、流式生物芯片、 微珠技術(shù)或者其它類似生物芯片。
當(dāng)本發(fā)明探針用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí)，本發(fā)明探針與引物的數(shù)量關(guān)系沒有 特別限制。通常，探針分子與引物之比介于1:10 10:1，更佳為1.5:1 5:1， 這樣，在反應(yīng)體系中，所述本發(fā)明探針基本上熊與引物的全部擴(kuò)增片段特異性雜 交。不同的引物可使用相同的本發(fā)明探針，也可使用不同的本發(fā)明探針(例如 帶有發(fā)不同熒光的報(bào)告基團(tuán)和相應(yīng)淬滅基團(tuán)的探針，序列相同或不同的本發(fā)明探 針)。對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度沒有特別限制。其主要步驟包括將本發(fā)明探針、 引物與待檢測(cè)物置于反應(yīng)體系中，然后，在合適的條件下，發(fā)生退火(或雜交)， 本發(fā)明探針與擴(kuò)增片段結(jié)合，使熒光信號(hào)或發(fā)色基團(tuán)的熒光信號(hào)增強(qiáng)或降低；經(jīng) 過若干循環(huán)后，與PCR原理相同，因擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交形成的可檢測(cè)信號(hào)也是 成指數(shù)級(jí)(或近似于指數(shù)關(guān)系)增加的，在可檢測(cè)信號(hào)是熒光的情況下，這些信號(hào)
可用于實(shí)時(shí)熒光閱讀儀，如Roche' s LightCycler，或者ABI GeneAmp 5700或 GeneAmp 7700等進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定；也可使用靜態(tài)熒光閱讀儀，在PCR反應(yīng)結(jié)束后 進(jìn)行熒光測(cè)定。信號(hào)的采集可以在核酸擴(kuò)增過程中的變性階段，也可以在核酸擴(kuò) 增過程中的延伸階段。由于本發(fā)明中可檢測(cè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制依賴于核酸擴(kuò)增過程中 本發(fā)明單體探針與核酸擴(kuò)增物之間的結(jié)合可破壞其發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使檢測(cè)的特異性和 靈敏度均有所增加。
當(dāng)本發(fā)明探針用于雜交反應(yīng)，其主要步驟是
(1) 將靶分子采用物理吸附和/或化學(xué)耦聯(lián)方式固定于固相基質(zhì)的表面；
(2) 本發(fā)明探針與固定于固相基質(zhì)表面的耙分子進(jìn)行雜交；
(3) 通過檢測(cè)本發(fā)明探針二級(jí)結(jié)構(gòu)解體前后可檢測(cè)信號(hào)的差異達(dá)到對(duì)耙分子 的定性和/或定量檢測(cè)；或者，通過檢測(cè)固相基質(zhì)表面本發(fā)明探針-耙分子復(fù)合體 可檢測(cè)信號(hào)的有無和/或強(qiáng)度的變化來達(dá)到對(duì)耙分子的定性和/或定量檢測(cè)。
本發(fā)明探針用于微陣列檢測(cè)的方法是
(1) 采用物理吸附和/或化學(xué)耦聯(lián)方式將本發(fā)明探針固定于固相基質(zhì)的表面；
(2) 靶分子與固定于固相基質(zhì)表面的本發(fā)明探針進(jìn)行雜交；
(3) 通過檢測(cè)本發(fā)明探針二級(jí)結(jié)構(gòu)解體前后可檢測(cè)信號(hào)的差異達(dá)到對(duì)耙分子 的定性和/或定量檢測(cè)；或者，檢測(cè)固相基質(zhì)表面本發(fā)明探針-靶分子復(fù)合體可檢 測(cè)信號(hào)的有無和/或強(qiáng)度的變化來達(dá)到對(duì)耙分子的定性和/或定量檢測(cè)。
本發(fā)明探針用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法是
(1) 本發(fā)明探針的識(shí)別區(qū)由可特異性地識(shí)別并結(jié)合某種蛋白的適配子 (aptamer)序列組成。
(2) 靶分子與本發(fā)明探針在適當(dāng)條件下反應(yīng)。
(3) 通過檢測(cè)本發(fā)明探針二級(jí)結(jié)構(gòu)解體前后可檢測(cè)信號(hào)的差異達(dá)到對(duì)對(duì)靶分 子的定性和/或定量檢測(cè)；或者，檢測(cè)本發(fā)明探針-靶分子復(fù)合體可檢測(cè)信號(hào)的有 無和/或強(qiáng)度的變化來達(dá)到對(duì)靶分子的定性和/或定量檢測(cè)。
在本發(fā)明中，除另外特別說明外，下列詞語/術(shù)語具有以下含義
本發(fā)明所述"核酸"是指核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、 RNA或DNA 的多聚核苷酸類似物、RNA或DNA的寡核苷酸類似物、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或其 它技術(shù)制備的核酸產(chǎn)物、mRNA、 cDNA、經(jīng)過修飾的核酸(例如重亞硫酸鹽修飾 的基因組DNA)、各種限制酶或其它酶消化或酶切的核酸產(chǎn)物(例如甲基化敏感 限制性內(nèi)切酶(methylation-sensitive restriction endonuclease， MSRE)的消 化產(chǎn)物)、其它類似核酸片段。
本發(fā)明所述"寡核苷酸"是指小分子核酸，由核苷酸殘基(片段)通過磷酸二 酯鍵連接(聚合)而成，分子量介于核酸與核苷酸之間，并傾向于核苷酸。本發(fā)明 對(duì)核苷酸殘基的數(shù)目并無嚴(yán)格界限。
本發(fā)明所述"靶分子"是指采用本發(fā)明所述方法直接或間接檢測(cè)的物質(zhì)，主 要包括(但并不限于)核酸、蛋白質(zhì)、抗原、抗體、糖類、肽類、病原體或其它分 子。
本發(fā)明所述"定性檢測(cè)"是指直接或間接檢測(cè)靶分子是否存在，或者直接或 間接檢測(cè)靶分子是否存在于待檢測(cè)物。
本發(fā)明所述"定量檢測(cè)"是指直接或間接檢測(cè)靶分子的濃度，或者直接或間 接檢測(cè)待檢測(cè)物中耙分子的濃度，例如，檢測(cè)待檢測(cè)物中耙核酸的拷貝數(shù)，或者 是檢測(cè)待檢測(cè)物中抗體的滴度。
本發(fā)明所述"初始狀態(tài)"是指本發(fā)明探針在無靶分子存在的情況下，于適當(dāng) 條件下以莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)形式存在的亞穩(wěn)定狀態(tài)，例如，將本發(fā)明探針于適當(dāng) 離子強(qiáng)度(例如0.5MNa+)高溫變性(例如95°C， 5 min)，并隨后緩慢降至室 溫后，本發(fā)明探針即可形成亞穩(wěn)定的莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明所述"亞穩(wěn)定"描述了本發(fā)明探針的熱力學(xué)穩(wěn)定性特征，它是指本發(fā) 明探針在反應(yīng)體系中缺乏靶分子的情況下均保持其初始狀態(tài)的莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié) 構(gòu)，但是，當(dāng)反應(yīng)休系中存在靶分子時(shí)，靶分子與本發(fā)明探針的識(shí)別區(qū)特異性結(jié) 合或互補(bǔ)雜交，從而破壞本發(fā)明探針在初始狀態(tài)的亞穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且，通過 檢測(cè)與此二級(jí)結(jié)構(gòu)解體相關(guān)的一系列可檢測(cè)信號(hào)來達(dá)到對(duì)靶分子的定性和/或定
量檢測(cè)。
本發(fā)明所述"解體"是指本發(fā)明探針在特定條件下，其莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)被破 壞，其初始狀態(tài)的莖區(qū)雙鏈核酸不再是本發(fā)明探針的雙鏈互補(bǔ)區(qū)。
本發(fā)明所述"單體"是指由一條寡核苷酸單鏈構(gòu)成的本發(fā)明探針。
本發(fā)明所述"雙休"是指由兩條寡核苷酸單鏈構(gòu)成的本發(fā)明探針。
本發(fā)明所述"粘性末端區(qū)"或"粘性末端"或"粘端"是指在本發(fā)明探針莖 區(qū)的5'-或3'-末端的擺動(dòng)寡核苷酸，其特征是粘性末端區(qū)自身與其它分子的結(jié) 合或互補(bǔ)雜交并不能影響本發(fā)明探針的亞穩(wěn)定特性，但是，當(dāng)存在與粘性末端區(qū) 及其毗鄰的莖區(qū)核酸特異性結(jié)合或互補(bǔ)雜交的靶分子(例如核酸)時(shí)，上述特異 性結(jié)合或互補(bǔ)雜交可破壞亞穩(wěn)定寡核苷酸探的莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述"莖 部"是指在本發(fā)明探針在初始狀態(tài)時(shí)存在的雙鏈核酸區(qū)。
本發(fā)明所述"環(huán)部"是指在本發(fā)明探針初始狀態(tài)二級(jí)結(jié)構(gòu)中在其中部或側(cè)部 存在的單鏈核酸區(qū)。
本文所述"識(shí)別區(qū)"是指本發(fā)明探針特異性識(shí)別并結(jié)合靶分子，或者與靶分 子互補(bǔ)的核酸序列，識(shí)別區(qū)的作用在于當(dāng)識(shí)別區(qū)的核酸序列與靶分子特異性結(jié)合 或互補(bǔ)雜交后，可以破壞本發(fā)明探針在初始狀態(tài)的莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明所述"本發(fā)明探針-靶分子復(fù)合體"是指本發(fā)明探針通過其識(shí)別區(qū)特異 性結(jié)合或互補(bǔ)雜交靶分子后形成的復(fù)合體。
本發(fā)明所述"榮光共振會(huì)b量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)"是利用不同發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)之間的相互作用而達(dá)到 對(duì)某些特定波長(zhǎng)光進(jìn)行檢測(cè)的一種信號(hào)檢測(cè)原理，例如，TaqMan探針和分子信 標(biāo)等均是基于FRET原理。 ，
本發(fā)明所述"可檢測(cè)信號(hào)的差異"是指可檢測(cè)信號(hào)的有無和/或強(qiáng)度的差異。
本發(fā)明所述"固相基質(zhì)"包括多種方法處理的玻璃片、硅片、陶瓷片、塑料、 硝酸纖維、尼龍膜或橡膠等。
本發(fā)明所述"固定"是指通過物理吸附和/或化學(xué)耦聯(lián)方式將寡核苷酸探針或
耙分子連接于固相基質(zhì)的表面。
本發(fā)明所述"物理吸附"是指寡核苷酸探針或靶分子通過次級(jí)鍵(例如離子 鍵)與固相基質(zhì)表面相連并固定，或者是以非共價(jià)鍵作用將寡核苷酸探針或靶分 子直接或恒電位吸附到固相基質(zhì)的表面，或者由本發(fā)明探針中的磷酸根負(fù)離子與 固相基質(zhì)表面帶正電荷的修飾層通過靜電作用而固定。
本發(fā)明所述"化學(xué)耦聯(lián)"是通過形成共價(jià)鍵(例如酰胺鍵、酯鍵、醚鍵等) 使寡核苷酸探針或靶分子與固相基質(zhì)表面的活性基團(tuán)相互作用，從而將寡核苷酸 探針或靶分子固定到固相基質(zhì)的表面，例如首先活化預(yù)處理固相基質(zhì)的表面， 引入各種所需活性基團(tuán)，如氨基、羧基、巰基、羥基、鹵素基(包括氟、氯、溴、 碘等)等，或者衍生核苷酸，使其帶上合適的功能基因，隨后用雙官能試劑或偶 聯(lián)活化劑聯(lián)絡(luò)將寡核苷酸探針或靶分子固定到固相基質(zhì)的表面，常用的雙官能基 團(tuán)有戊二醛(GA)、對(duì)硝基苯氯甲酸酯(NPC)、馬來酰亞胺(MA)、 二異硫氰酸酯等。
本發(fā)明所述"支鏈寡核苷酸"是指在本發(fā)明所述本發(fā)明探針的末端或內(nèi)部的 部分或全部堿基中增加一部分其它堿基或寡核苷酸序列，其特征是引入的堿基或 寡核苷酸序列不影響本發(fā)明探針特異性識(shí)別結(jié)合或互補(bǔ)雜交靶分子的生物學(xué)活 性，同時(shí)又有利于將本發(fā)明探針固定于固相基質(zhì)的表面。
所謂"手臂分子"是指具有一個(gè)或多個(gè)活性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物。
本發(fā)明不同于已有的莖-環(huán)狀寡核苷酸，以分子信標(biāo)為例分子信標(biāo)與靶分子 互補(bǔ)雜交的寡核苷酸序列在初始狀態(tài)時(shí)是單鏈形式(即環(huán)區(qū))，當(dāng)其單鏈環(huán)狀結(jié) 構(gòu)的寡核苷酸序列與靶分子作用的情況下，雙鏈莖區(qū)結(jié)構(gòu)被打開，并利用標(biāo)記在 分子信標(biāo)兩末端的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的相互作用使分子信標(biāo)在莖部結(jié)構(gòu)被打 開后存在可檢測(cè)信號(hào)的差異；而在本發(fā)明中，本發(fā)明探針特異性識(shí)別結(jié)合或互補(bǔ) 雜交靶分子的識(shí)別區(qū)則主要或完全以莖部結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列為主，并且，本發(fā) 明探針分子內(nèi)部存在與靶分子競(jìng)爭(zhēng)的寡核苷酸序列。
本發(fā)明與現(xiàn)有的寡核苷酸探針技術(shù)相比，主要具有以下優(yōu)點(diǎn)
l)更髙的特異性——由于本發(fā)明探針分子內(nèi)部存在與靶分子競(jìng)爭(zhēng)的核酸序
列，因此，只有當(dāng)本發(fā)明探針的識(shí)別區(qū)與靶分子完全互補(bǔ)時(shí)才能使本發(fā)明探針的 二級(jí)結(jié)構(gòu)解體，從而產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的差異。
(2) 易于復(fù)合式檢測(cè)——由于本發(fā)明探針的熱力學(xué)穩(wěn)定性，不同本發(fā)明探針之 間，以及本發(fā)明探針與非靶分子之間存在相互作用的可能性極小，從而提高了在 同一反應(yīng)體系中使用靶向不同靶分子的多種本發(fā)明探針，從而能極大地提高耙分 子的檢測(cè)種類。
(3) 設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)便性——由于本發(fā)明探針的識(shí)別區(qū)部分或全部位于莖部，因此，
簡(jiǎn)化了本發(fā)明探針的設(shè)計(jì)難度，降低了對(duì)靶分子序列的特殊要求。


圖1是帶有粘性末端的本發(fā)明單體探針及其檢測(cè)原理示意圖。
圖2是無粘性末端的本發(fā)明單體探針及其檢測(cè)原理示意圖。
圖3是帶有粘性末端的本發(fā)明雙體探針及其檢測(cè)原理示意圖。
圖4是無粘性末端的本發(fā)明雙體探針及其檢測(cè)原理示意圖。
圖5是本發(fā)明探針固定于固相基質(zhì)表面的原理示意圖。
圖6是基于雙體探針的生物芯片檢測(cè)原理示意圖
圖7是基于單體探針檢測(cè)蛋白分子的原理示意圖
圖8是本發(fā)明探針用于hMLHl基因的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖9是本發(fā)明探針用于hMLHl基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)時(shí)熒光曲線圖。
具體實(shí)施例方式
下面將通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明探針的結(jié)構(gòu)和效果，但本發(fā)明 并不僅限于下面實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)說明書的內(nèi)容和實(shí)際的需要對(duì) 本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
實(shí)施例一、帶有粘性末端的單體探針
一種莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的單體寡聚核苷酸探針P，該探針由一條寡聚核苷酸鏈組成， 其初始狀態(tài)有序列c形成的環(huán)部、互補(bǔ)序列b和一結(jié)合形成的莖部，以及粘端a
13構(gòu)成，在b*末端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，在b和a連接處標(biāo)記有淬滅基團(tuán)，識(shí)別區(qū)由 莖部b和粘端a組成。耙分子T由序列M和腫連接而成，與探針P的莖部序列 b和粘端a完全互補(bǔ)。當(dāng)反應(yīng)體系中不存在靶分子T時(shí)，探針P維持初始狀態(tài)，熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)被相鄰的淬滅基團(tuán)所吸收，體系中沒有可檢測(cè)的熒光信號(hào)； 當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶分子T時(shí)，靶分子T與探針的識(shí)別區(qū)b、 a互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致探針發(fā)卡結(jié)構(gòu)解體，熒光基團(tuán)和淬火基團(tuán)分離，熒光基團(tuán)即發(fā)出可檢測(cè)的熒光信 號(hào)，如圖1所示。
實(shí)施例二、無粘性末端的單體探針
一種莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的單體寡聚核苷酸探針P，該探針由一條寡聚核苷酸鏈組成， 其初始狀態(tài)有序列c形成的環(huán)部、互補(bǔ)序列b和bK結(jié)合形成的莖部構(gòu)成，莖部 的末端為平端，兩末端分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，識(shí)別區(qū)由的莖部序列b 和環(huán)部序列c組成。靶分子T由序列b+和W連接而成，與探針P的莖部序列b 和環(huán)部序列c完全互補(bǔ)。當(dāng)反應(yīng)體系中不存在靶分子T時(shí)，探針P維持初始狀態(tài)， 熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)被相鄰的淬滅基團(tuán)所吸收，體系中沒有可檢測(cè)的熒光信號(hào)； 當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶分子T時(shí)，靶分子T與識(shí)別區(qū)b、 c互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致發(fā)卡結(jié) 構(gòu)解體，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，熒光基團(tuán)即發(fā)出可檢測(cè)的熒光信號(hào)，如圖2 所示。
實(shí)施例三、帶有粘性末端的雙體探針
一種莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的雙體寡聚核苷酸探針P1*P2，該探針由兩條寡聚核苷酸鏈互 補(bǔ)結(jié)合組成，其中，寡核苷酸鏈P1由莖部序列b和粘端序列a連接而成；寡核 苷酸鏈P2由序列bW、 c、 b2求組成，其中，bl宋和b2求分別與Pl的b兩端互補(bǔ)， 并且，bW和b2》在整體上與b完全互補(bǔ)，c則形成雙體探針的環(huán)部；在P2末端 標(biāo)記有熒光基團(tuán)，在Pl與P2末端對(duì)稱處(即在b和a連接處)標(biāo)記有淬滅基團(tuán)， 識(shí)別區(qū)由莖部b和粘末端a組成。靶分子T由序列b*和a*連接而成，與探針Pl *P2的莖部序列b和粘端a完全互補(bǔ)。當(dāng)反應(yīng)體系中不存在靶分子T時(shí)，探針P1 "P2維持初始狀態(tài)，熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)被相鄰的淬滅基團(tuán)所吸收，體系中沒有可檢測(cè)的熒光信號(hào)；當(dāng)反應(yīng)體系中存在耙分子T時(shí)，靶分子T與探針的識(shí)別區(qū)b、 a互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致探針發(fā)卡結(jié)構(gòu)解體，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，熒光基團(tuán)即發(fā) 出可檢測(cè)的熒光信號(hào)，如圖3所示。實(shí)施例四、無粘性末端的雙體探針
一種莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的雙體寡聚核苷酸探針P1，P2，該探針由兩條寡聚核苷酸鏈互 補(bǔ)結(jié)合組成，其中，寡核苷酸鏈P1由莖部序列b組成；寡核苷酸鏈P2由與序列 bl*、 c*、 b24且成，其中，1)1*和b2傘分別與Pl的b兩端互補(bǔ)，并且，bl碎口b2承 在整體上與b完全互補(bǔ)，W則形成雙體探針的環(huán)部；在P1末端標(biāo)記有熒光基團(tuán)， 在P2與Pl末端對(duì)稱處標(biāo)記有淬滅基團(tuán)，識(shí)別區(qū)由P2組成。靶分子T由序列bl、 c、 b2組成，與探針P2的序列完全互補(bǔ)。當(dāng)反應(yīng)體系中不存在靶分子T時(shí)，探 針P1'P2維持初始狀態(tài)，熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)被相鄰的淬滅基團(tuán)所吸收，體系中 沒有可檢測(cè)的熒光信號(hào)；當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶分子T時(shí)，靶分子T與探針的識(shí)別 區(qū)P2互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致探針發(fā)卡結(jié)構(gòu)解體，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，熒光基團(tuán) 即發(fā)出可檢測(cè)的熒光信號(hào)，如圖4所示。
實(shí)施例五、探針在固相基質(zhì)表面的固定
本發(fā)明探針通過物理吸附和/或化學(xué)耦聯(lián)方法固定于固相基質(zhì)(包括生物芯 片、微陣列、其它類似陣列或微珠等)的表面
(1) 采用物理吸附方式將本發(fā)明探針固定或連接于固相基質(zhì)的表面，例如以 非共價(jià)鍵作用將本發(fā)明探針直接或恒電位吸附到固相基質(zhì)的表面，或者由本發(fā)明 探針中的磷酸根負(fù)離子與固相基質(zhì)表面帶正電荷的修飾層通過靜電作用而固定。
(2) 本發(fā)明探針的末端和/或部分(或全部)內(nèi)部堿基經(jīng)標(biāo)記、修飾、衍生化或其它類似方法引入各種所需活性基團(tuán)，包括生物素、半抗原、氨基、羧基、巰基、 羥基、鹵素基(包括氟、氯、溴、碘等)或其它類似活性基團(tuán)，然后使用雙官能試 劑或偶聯(lián)活化劑以化學(xué)耦聯(lián)方式將本發(fā)明探針固定在固相基質(zhì)表面。常用的雙宮能基團(tuán)有戊二醛(GA)、對(duì)硝基苯氯甲酸酯(NPC)、馬來酰亞胺(MA)、 二異硫氰酸 酯等。
(3) 本發(fā)明探針的末端和/或內(nèi)部的部分(或全部)堿基經(jīng)標(biāo)記、修飾、衍生化或其它類似方法弓I入支鏈寡核苷酸或手臂分子，并可同時(shí)對(duì)支鏈寡核苷酸的部分 或全部堿基進(jìn)行標(biāo)記、修飾、衍生化或其它類似方法引入各種所需活性基團(tuán)，包 括生物素、半抗原、氨基、羧基、巰基、羥基、鹵素基(包括氟、氯、溴、碘等) 或其它類似活性基團(tuán)，然后使用雙官能試劑或偶聯(lián)活化劑以化學(xué)耦聯(lián)方式將本發(fā)明探針固定在固相基質(zhì)表面。常用的雙官能基團(tuán)有戊二醛(GA)、對(duì)硝基苯氯甲酸 酯(NPC)、馬來酰亞胺(MA)、 二異硫氰酸酯等。
本發(fā)明探針在固相基質(zhì)上的固定方式如圖5所示。
實(shí)施例六、基于粘性末端單體探針的Northern雜交
(1) 探針的構(gòu)建探針的序列組成及初始狀態(tài)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與實(shí)施例一所述探針 相同，并且，探針的部分或全部堿基標(biāo)記有放射性同位素。
(2) 待檢測(cè)物的制備
采用適當(dāng)?shù)碾娪痉绞?如四醛-瓊脂糖凝膠電泳)分享RNA樣本，然后在適當(dāng) 條件下將其凝膠上的RNA樣本轉(zhuǎn)移至尼龍膜(或硝酸纖維膜)，將尼龍膜進(jìn)行干燥 處理后，經(jīng)紫外線透照儀照射合適的時(shí)間，使RNA充分固定于尼龍膜表面。
(3) 雜交反應(yīng)
將步驟(2)制備的固定有RNA的尼龍膜放置于雜交管中，加入適量的雜交液和 步驟(l)制備的探針，經(jīng)變性(例如沸水浴10 min)后，于適當(dāng)溫度下(例如 65℃)過夜雜交。
(4) 結(jié)果判斷
雜交反應(yīng)完畢后，經(jīng)過適當(dāng)?shù)南礈觳襟E將末與靶分子雜交的多余探針洗脫， 然后，在尼龍膜上蓋上可透過紫外線的塑料保鮮膜，進(jìn)行放射自顯影，并根據(jù)是 否存在自顯影條帶及條帶的光密度值對(duì)待檢測(cè)物中的靶分子進(jìn)行定性和/定量檢 測(cè)。
實(shí)施例七、基于雙體探針的生物芯片檢測(cè) 如圖6所示，其具體實(shí)施步驟示例如下
(l)構(gòu)建雙體探針
如圖6A所示，雙體探針由單體探針B和b構(gòu)成，其中，探針b的全部序列分 別與探針B的兩端部分序列互補(bǔ)，因此，當(dāng)探針B與b形成狀雙體探針時(shí)，B在 雙體探針的中間部分存在一個(gè)所圖6A所示的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。雙體探針中，單體探針 B與靶分子完全互補(bǔ)。圖6A所示Bl/bl、 B2/b2、 B3/b3和B4/b4是分別靶向不 同耙分子的不同探針。
(2) 探針的固定
將探針B通過分子手臂X以物理吸附和/或化學(xué)耦聯(lián)方式固定于固相基質(zhì)表面 (圖6A)。
(3) 靶分子的制備
提取待檢測(cè)物的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄方法將其轉(zhuǎn)換成cDNA分子，在逆轉(zhuǎn)錄步驟 中，使用熒光標(biāo)記的dUTP(圖6B)，其中，B1沐、B2求和B輯是分別與雙體探針Bl/bl、 B2/b2、 B3/b3和B4/b4中的B1、 B2和B4互補(bǔ)的耙分子。
(4) 雜交反應(yīng)
將步驟(l)構(gòu)建的單體探針bl b4和步驟(3)制備的靶分子按照一定比例制 備成混合液，在適當(dāng)反應(yīng)條件下與步驟(2)制備的生物芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)(圖6C); 反應(yīng)完畢后，經(jīng)洗滌步驟去除末與探針雜交的cDNA片段。
(5)結(jié)果判斷
當(dāng)制備的待檢測(cè)物中存在與探針互補(bǔ)的靶分子時(shí)，則靶分子與生物芯片上固 定的探針B結(jié)合，因靶分子標(biāo)記有熒光分子而雜交點(diǎn)出現(xiàn)熒光信號(hào)，如圖6C-D 所示的B1、 B2和B4探針出現(xiàn)熒光信號(hào)或強(qiáng)度的變化；當(dāng)待檢測(cè)物中不存在靶分 子時(shí)，則單體探針b與生物芯片上固定的探針B結(jié)合，此時(shí)，檢測(cè)點(diǎn)不存在熒光 信號(hào)，如圖6C-D中的B3探針。因此，最終可根據(jù)各探針固定點(diǎn)的熒光信號(hào)的有 無和/或強(qiáng)度的變化，可以對(duì)待檢測(cè)物中的耙分子進(jìn)行定量和/或定性檢測(cè)。
實(shí)施例八含有適配序列的單體探針檢測(cè)蛋白分子的方法
如圖7所示，其具體實(shí)施步驟示例如下
(l)構(gòu)建探針
探針的序列組成及初始狀態(tài)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與實(shí)施例一所述探針相同，并在探針P莖部對(duì)稱末端分別標(biāo)記上如圖7所示的報(bào)告基團(tuán)(圖8中的灰色圓點(diǎn)；如FAM) 和淬滅基團(tuán)(圖8中的黑色圓點(diǎn)；如Dabcyl)。探針P序列中，a和b序列是與靶蛋白分子T特異性結(jié)合的適配子序列。
(2) 雜交反應(yīng)
將探針P和靶分子T在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)休系中進(jìn)行雜交反應(yīng)，在反應(yīng)過程中，探針P的適配子序列(即a+b序列)與靶分子T結(jié)合，形成探針-靶分子復(fù)合體， 在此復(fù)合體中，探針P的c和M部分變成擺動(dòng)端，此時(shí)，b*末端的報(bào)告基團(tuán)因 不再受淬滅基團(tuán)的影響而發(fā)出可見熒光。
(3) 結(jié)果判斷
根據(jù)探針P在雜交反應(yīng)前后的熒光信號(hào)有無和/或熒光強(qiáng)度的差異達(dá)到對(duì)耙分子T的定性和/或定量檢測(cè)。
實(shí)施例九、hMLHl基因的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR
在該實(shí)施例中，設(shè)計(jì)了一對(duì)耙向hMLHl基因的一對(duì)RT-PCR引物和一個(gè)在莖區(qū)末端對(duì)稱堿基分別標(biāo)記上熒光基團(tuán)FAM和淬滅基團(tuán)Dabcyl的亞穩(wěn)定寡核苷酸單體探針
RT-PCR上游引物
5' -AAGCAGTACATATCTGAGGAGTCG-3，
RT-PCR下游引物
5， -TGTTCCACAGTCCACTTCCAG-3，
本發(fā)明探針5， -TGGAGCCAGGCACTTCACTCTGCTCAAAGTAGCAGAGTGAAGTGCCT-3’
該探針是具有粘性末端的單體寡核苷酸探針，其中5'-端25-30bp處為探針的環(huán)部，下劃部分是亞穩(wěn)定寡核苷酸單體探針的莖部，并且，在5’-端8bp處的 堿基A和3’-末端堿基T分別標(biāo)記上了熒光基團(tuán)FAM和淬滅基團(tuán)Dabcyl。
步驟
(1) 利用隨機(jī)引物總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄50℃， 20 min， 95℃， 5 min。
(2) 將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、RT-PCR引物和亞穩(wěn)定寡核苷酸單體探針置于同一反應(yīng)管
中，于Roche LightCycler上進(jìn)行如下條件的擴(kuò)增:94°C, 2 min; 94C 10 sec, 60°C 45 sec，共40個(gè)循環(huán)；信號(hào)采集固定于60℃階段。
結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖8，結(jié)果表明(圖9)，不同稀釋度的陽性標(biāo)本在 不同循環(huán)(CT)出現(xiàn)熒光信號(hào)，陰性標(biāo)本在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)(CT＝40)時(shí)未出現(xiàn)熒光 信號(hào)。
序列表
<110>中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
<120〉 一種莖-環(huán)型寡聚核苷酸探針
<130〉 1. Broude NE. Stem-loop oligonucleotides: a robust tool for molecular biology and biotechnology. Trends Biotechnol. 2002; 20(6): 249-256 ;
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<160> 3
<170> Patentln version 3.3
〈210〉 1
<211〉 24
<212〉DNA
<213〉人工序列
<400〉 1
aagcagtaca tatctgagga gtcg 24
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212〉 DNA〈213〉人工序列
〈400〉 2
tgttccacag tccacttcca 20
〈210〉 3
〈211〉 46
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 3
tggagccagg cacttcactc tgctcaaagt agcagagtga agtgcc 4權(quán)利要求
1、一種莖-環(huán)狀寡聚核苷酸探針，該探針具有莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)的初始狀態(tài)，由環(huán)部和莖部構(gòu)成，莖部是兩段互補(bǔ)的堿基序列通過氫鍵結(jié)合形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，與靶分子特異性結(jié)合的識(shí)別區(qū)主要由探針的莖部序列組成；當(dāng)反應(yīng)體系中沒有靶分子存在時(shí)，所述的識(shí)別區(qū)以初始狀態(tài)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在；當(dāng)反應(yīng)體系中有靶分子存在時(shí)，靶分子與所述的識(shí)別區(qū)特異性結(jié)合時(shí)，莖部的發(fā)卡結(jié)構(gòu)解體，同時(shí)探針或靶分子產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)差異。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其特征在于在莖部的中間或自由端對(duì)稱 地標(biāo)記有能產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物，當(dāng)莖部的發(fā)卡結(jié)構(gòu)解體時(shí)能產(chǎn)生信號(hào) 的差異。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其特征在于是由一條單鏈寡核苷酸通過 內(nèi)部堿基互補(bǔ)結(jié)合形成單體探針；
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于是由存在一定堿基互補(bǔ)關(guān)系 的兩條單鏈寡核苷酸結(jié)合形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的雙體探針。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其特征在于構(gòu)成探針的核酸分子全部或 部分是核酸、肽核酸、鎖核酸或其它類似物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其特征在于莖部末端是粘性末端。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于所述的莖部可以引入人工錯(cuò) 配堿基，所述人工錯(cuò)配堿基是天然的A、 T、 C、 G四種堿基或其類似物。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其特征在于靶分子識(shí)別區(qū)由莖部序列組成。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于靶分子識(shí)別區(qū)由莖部和部分 或全部環(huán)部序列組成。
10、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的探針，其特征在于靶分子識(shí)別區(qū)由莖部和粘 性末端序列組成。
11、 根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的探針，其特征是在所述探針的任意一 個(gè)部位弓I入支鏈寡核苷酸或手臂分子。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的探針，其特征在于部分或全部堿基標(biāo) 記有能產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型的莖-環(huán)寡聚核苷酸探針，該探針具有莖-環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)的初始狀態(tài)，由環(huán)部和莖部構(gòu)成，莖部是兩段互補(bǔ)的堿基序列通過氫鍵結(jié)合形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，與靶分子特異性結(jié)合的識(shí)別區(qū)主要由探針的莖部序列組成；當(dāng)沒有靶分子存在時(shí)，所述的識(shí)別區(qū)以初始狀態(tài)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在；當(dāng)有靶分子存在時(shí)，靶分子與所述的識(shí)別區(qū)特異性結(jié)合時(shí)，莖部的發(fā)卡結(jié)構(gòu)解體，同時(shí)探針或靶分子產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)差異。本發(fā)明探針特異性識(shí)別結(jié)合或互補(bǔ)雜交靶分子的識(shí)別區(qū)則主要或完全以莖部結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列為主，并且在探針分子內(nèi)部存在與靶分子競(jìng)爭(zhēng)的寡核苷酸序列，因此，本發(fā)明探針具有更高的特異性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101200759SQ200710093129
公開日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2007年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月13日
發(fā)明者府偉靈, 慶 黃 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院