專利名稱：：檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人泌尿生殖道分泌物中病原體的檢驗(yàn)，尤其涉及一種檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法。技術(shù)背景隨著我國對(duì)外開放程度的逐步加深，加上社會(huì)上有些人受到"性自由"思想的影響和對(duì)性傳播疾病的無知，在一些開放城市和經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)了新的性病患者，加之當(dāng)今各地之間的人員流動(dòng)非常頻繁，性病的發(fā)生及傳播呈愈演愈烈之勢。如2004年全國31個(gè)省(直轄市、自治區(qū))共累計(jì)報(bào)告性病(HIV/AIDS除外)809，550例，較上一年就上升了10%。2004年全國性病疫情分析報(bào)告顯示，淋病奈瑟氏球菌(簡稱淋球菌，NG)、解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)已成為三種主要的導(dǎo)致性病的病原體。對(duì)本市部分就診者的檢測顯示，合并2種或3種病原體感染的患者正在逐年增加。性傳播疾病對(duì)人類健康的危害性很大。特別是對(duì)青年人，后果更為嚴(yán)重，有的會(huì)導(dǎo)致終身的健康問題，包括不孕、不育、慢性疼痛以及增加感染艾滋病的危險(xiǎn)，對(duì)人們的身心健康和家庭社會(huì)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。對(duì)性傳播疾病實(shí)行早期監(jiān)測和診斷，是性病防治工作中的一個(gè)重要組成部分，對(duì)于提高性病治愈率，縮短病程和傳染期，控制和消滅傳染源，阻止性疾病的蔓延有著重要的作用。目前對(duì)淋病奈瑟氏球菌、解脲支原體和沙眼衣原體的檢驗(yàn)方法主要有涂片檢査，細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)、血清學(xué)試驗(yàn)和PCR法。涂片檢查是檢測淋球菌的主要方法，但尿道分泌物的狀態(tài)會(huì)影響檢測的敏感度；細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)是將標(biāo)本接種于合適的培養(yǎng)基或細(xì)胞，使其擴(kuò)增，并進(jìn)一步作出鑒定。培養(yǎng)法特異性高，能檢出病人分泌物內(nèi)活的病原體，結(jié)合藥敏試驗(yàn)?zāi)茏鳛樗幬锆熜У呐袛?，過去常作為檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于受專業(yè)化技術(shù)、試劑、設(shè)備、周期長等因素的影響，目前臨床一般不采用，僅在科研單位進(jìn)行科研活動(dòng)，或作為新診斷試劑方法學(xué)評(píng)價(jià)的金標(biāo)準(zhǔn)；血清學(xué)試驗(yàn)可以提供快速診斷，曾被認(rèn)為是一種理想的診斷方法，但因?yàn)槊舾行院吞禺愋圆粔蚋?，進(jìn)口抗體的昂貴價(jià)格而不能用于過篩實(shí)驗(yàn)；PCR法用于感染早期的病原體診斷，己逐漸成為病原體檢測的新寵。PCR法操作簡單、耗時(shí)較少、靈敏度高，理論上只要有一個(gè)拷貝便可被檢出。但是作為高度敏感的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，操作不當(dāng)極易造成污染而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。近年來出現(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timequantitativePCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它基本解決了過去實(shí)驗(yàn)過程因污染出現(xiàn)的假陽性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中，特異性熒光探針的選擇和設(shè)計(jì)是至關(guān)重要的。它是把熒光化合物標(biāo)記到特異性的寡核苷酸上形成熒光標(biāo)記的DNA探針，通過探針與PCR產(chǎn)物特異性的結(jié)合，在PCR過程中可對(duì)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)均相、實(shí)時(shí)、定量檢測。根據(jù)熒光基團(tuán)標(biāo)記和實(shí)現(xiàn)能量共振轉(zhuǎn)移方式的不同，熒光PCR所用的探針可以分為五大類，分別是Taqman探針，分子信標(biāo)，光標(biāo)記引物，雜交探針，DNA-RNA-DNA嵌合探針。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中，定量PCR儀的發(fā)展是另一決定因素。多色多通道檢測是當(dāng)今的主流趨勢，多通道指可同時(shí)檢測一個(gè)樣品中的多種熒光，使得在單管內(nèi)可同時(shí)檢測多模板。目前，在大部分醫(yī)院都具有多通道的熒光PCR儀。此外，為滿足多色多通道檢測的需求，目前已開發(fā)了包括FAM，TET，VIC，HEX等近十種的熒光基團(tuán)。但是，目前幾乎所有臨床上使用的都是單檢PCR產(chǎn)品，一次只能檢測出一種病原體，不利于對(duì)混合感染的檢測，而且操作過程相對(duì)費(fèi)時(shí)，成本高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種檢測人泌尿生殖道病原體的引物。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種檢測人泌尿生殖道病原體的探針。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供一種檢測人泌尿生殖道病原體的方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供一種檢測人泌尿生殖道病原體的試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種檢測人泌尿生殖道病原體的引物，包括以下引物對(duì)中的至少一對(duì)(1)用于擴(kuò)增淋病奈瑟氏球菌靶核酸序列的引物對(duì)，其第一引物序列含有SEQIDNO:1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO:2的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸；(2)用于擴(kuò)增解脲支原體靶核酸序列的引物對(duì)，其第一引物序列含有SEQIDNO:3的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO:4的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸；(3)用于擴(kuò)增沙眼衣原體靶核酸序列的引物對(duì)，其第一引物序列含有SEQIDNO:5的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO:6的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。較佳地，所述引物對(duì)至少包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2;禾口/或SEQIDNO:3、SEQIDNO:4;禾口/或SEQIDNO:5、SEQIDNO:6。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測人泌尿生殖道病原體的探針，包括至少以下的一種寡核苷酸序列(1)與上述引物對(duì)擴(kuò)增的淋病奈瑟氏球菌的靶核酸序列進(jìn)行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:7或其互補(bǔ)序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸；(2)與上述引物對(duì)擴(kuò)增的解脲支原體的靶核酸序列進(jìn)行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:8或其互補(bǔ)序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸；(3)與上述引物對(duì)擴(kuò)增的沙眼衣原體的靶核酸序列進(jìn)行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:9或其互補(bǔ)序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。較佳地，所述探針至少包括SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9中的一種寡核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測人泌尿生殖道病原體的方法，包括以下步驟-(1)提取核酸樣本；(2)用至少一對(duì)上述的引物序列，以步驟(l)提取的核酸為模板，擴(kuò)增病原體的耙核酸序列；(3)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并分析結(jié)果。較佳地，所述步驟(2)中還包括加入能與步驟(2)所用引物對(duì)擴(kuò)增的靶核酸序列進(jìn)行雜交的探針序列。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測人泌尿生殖道病原體的試劑盒，包括至少一對(duì)本發(fā)明所述的引物序列。較佳地，所述試劑盒還包括至少一種本發(fā)明所述的探針序列，該探針序列與所含引物序列擴(kuò)增的耙核酸序列進(jìn)行雜交。更佳地，所述試劑盒包含以下引物和探針組合中的至少一種組合(1)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:7;(2)SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:8;(3)SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:9。在本發(fā)明中，術(shù)語"引物"是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點(diǎn)，在上述條件下可以誘發(fā)合成與核酸鏈互補(bǔ)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液中并在合適的溫度下進(jìn)行上述合成。優(yōu)選的引物是單股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決于該引物的設(shè)計(jì)用途，但一般在1525個(gè)核苷酸之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物不必反應(yīng)模板的準(zhǔn)確序列，但必須充分互補(bǔ)，以與模板雜交并引發(fā)DNA合成。在本發(fā)明中，術(shù)語"探針"是指能識(shí)別特異核苷酸序列的帶標(biāo)記的一段單鏈DNA或RNA分子，它只與被檢測的特定核苷酸序列結(jié)合。探針位置盡可能地靠近上游引物。為保證結(jié)合特異性，探針的合適長度一般在1545個(gè)核苷酸之間。由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法，可以在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測淋病奈瑟氏球菌(NG)、解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)三種不同的病原體，不僅提高性傳播疾病的早期檢出率，而且減少醫(yī)務(wù)人員的操作時(shí)間，降低成本，并減輕病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。圖1是本發(fā)明檢測的淋病奈瑟氏球菌、解脲支原體和沙眼衣原體三種病原體的電泳圖；圖2是本發(fā)明單獨(dú)檢測淋病奈瑟氏球菌的熒光定量PCR圖；圖3是本發(fā)明單獨(dú)檢測解脲支原體的熒光定量PCR圖；圖4是本發(fā)明單獨(dú)檢測沙眼衣原體的熒光定量PCR圖；圖5是本發(fā)明同時(shí)檢測淋病奈瑟氏球菌、解脲支原體和沙眼衣原體三種病原體的熒光定量PCR圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1檢測淋病奈瑟氏球菌(NG)、解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)的引物、探針序列及方法1.淋病奈瑟氏球菌的引物和探針根據(jù)淋病奈瑟氏球菌的靶核酸序列(GenbankAcession:M10316)，選擇合適的區(qū)域設(shè)計(jì)引物與探針，共設(shè)計(jì)了兩組引物和探針，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)比較，選擇了其中的一組，具體的序列如下NG-Fl:5'-GCTACGCATACCCGCGTTGC-3'(SEQIDNO:1，位于靶序列3141-3160bp)NG-Rl:5'-CGAAGACCTTCGAGCAGACA-3'(SEQIDNO:2，位于靶序列3531-3512bp)NG-Fl，NG-Rl的擴(kuò)增產(chǎn)物長391bp(見圖1),對(duì)應(yīng)于靶序列的隱蔽質(zhì)粒區(qū)。雜交探針NG-PI:FAM-5'-CTGTTTMGTCGTCCAGCTCGTTC-3'-BHQ1(SEQIDNO:7，位于耙序列3251-3275bp)經(jīng)檢測，NG-F1、NG-R1、NG-PI檢測的靈敏度能達(dá)到E3水平(見圖2)。2.解脲支原體的引物和探針根據(jù)解脲支原體的靶核酸序列(GenbankAcession:X51315),選擇合適的區(qū)域設(shè)計(jì)引物與探針，共設(shè)計(jì)了兩組引物和探針，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)比較，選擇了其中的一組，具體的序列如下UU-Fl:5'-CAGGTAAATTAGTACCAG-3'(SEQIDNO:3，位于靶序列543-560bp)UU-R1:5'-ACGACGTCCATAAGCAACT-3'(SEQIDNO:4，位于靶序列757-739bp)UU-F1，UU-R1的擴(kuò)增產(chǎn)物長215bp(見圖l)，位于尿酶基因區(qū)。UU-Pl:HEX-_CCGTCCTATCCAAGTTGGATCACA-B即(SEQIDNO:8，位于耙序列643-666bp)經(jīng)檢測，UU-F1、UU-R1、UU-P1檢測的靈敏度能達(dá)到E3水平(見圖3)。3.沙眼衣原體的引物和探針根據(jù)沙眼衣原體的靶核酸序列(GenbankAcession:CP000052)，選擇合適的區(qū)域設(shè)計(jì)引物與探針，共設(shè)計(jì)了兩組引物和探針，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)比較，選擇了其中的一組，具體的序列如下CT-Fl:5'-CTAGGCGTTTGTACTCCGTCA-3'(SEQIDNO:5，位于靶序列604-624bp)CT-Rl:5'-TCCTCAGAAGTTTATGCACT-3'(SEQIDNO:6，位于耙序列803-784bp)CT-F1，CT-R1的擴(kuò)增產(chǎn)物長200bp(見圖1)，對(duì)應(yīng)于耙序列的隱蔽質(zhì)粒區(qū)。CT-PI:ROX-5'-GAGAGAACGTGCGGGCGATTTGC-3'-BHQ2(SEQIDNO:9，位于耙序列688-711bp)經(jīng)檢測，CT-F1，CT-R1，CT-P1檢測的靈敏度能達(dá)到E3水平(見圖4)。4.引物合成及純化方法合成方法是固相亞磷酸三酯法進(jìn)行化學(xué)DNA合成，純化方法為聚丙烯酰胺凝膠電泳，引物在使用前經(jīng)稀釋后，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測、重定量，確保其A260/A280〉1.7。5.探針合成及純化方法探針合成采用兩步法，第一步用亞磷酸三酯法將R印orter連接于DNA的5'端。第二步是采用Postlink方法將NHS活化酯化的Quencher連接上去(R印orter可用FAM，HEX，TET等；Quencher采用TAMRA，BHQ1,BHQ2等，可修飾于3'端或DNA中間)。因考慮到熒光染料在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，采用的合成單體為Fastamidite，以保證熒光的穩(wěn)定性。探針純化方法采用的是PAGE凝膠電泳法基礎(chǔ)上的HPLC純化，第一步是在Postlink連接Quencher之前，用PAGE將大部分的雜質(zhì)去掉，特別是將可能會(huì)與Quencher連接形成副產(chǎn)物的雜質(zhì)去掉，這有助于Quencher連接效率的提高和后面的純化工作；第二步是在連接了Quencher之后再用PAGE電泳在一定條件下將其它雜質(zhì)除去，以獲得比較高純度的產(chǎn)品；第三步即過dHPLC進(jìn)行純化，對(duì)于純化后產(chǎn)品將檢驗(yàn)其出峰位置及純度，再用紫外分光光度計(jì)在260nm波長下定量。探針在使用前經(jīng)稀釋后，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測、重定量，確保其A260/A280〉1.7。6.其他材料純化水符合《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》要求，Hot-Start酶由超生生物公司提供、dNTP(dATP:dCTP:dGTP:dUTP=25mM:25mM:25mM:25mM)、UNG酶由普洛麥格公司提供。所有化學(xué)試劑為分析純或分析純以上級(jí)別，所有試劑均檢驗(yàn)合格。7.對(duì)照品(1)陰性對(duì)照品純化水。替代試驗(yàn)檢驗(yàn)合格。(2)陽性對(duì)照品已知濃度的NG、UU、CT病原微生物菌液，已知濃度的NG、UU、CT病原微生物質(zhì)粒DNA溶液。8.檢測方法本發(fā)明應(yīng)用多重PCR熒光原理，在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測淋球菌、解脲支原體、沙眼衣原體，在同一反應(yīng)管內(nèi)加入各自的引物與探針，由于三種探針的5'端分別標(biāo)記不同波長的報(bào)告熒光，PCR反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，不同的報(bào)告熒光基團(tuán)釋放熒光，熒光測定儀器分別讀取三種波長的熒光信號(hào)進(jìn)行分析，使三種病原體的檢測在一次實(shí)驗(yàn)中完成。對(duì)反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下(1)多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系(選用40pL反應(yīng)體系)40|nL反應(yīng)體系中含有2.5pL10XPCRreactionbuffer(Mg2+free),3mmol/LMg2+，0.125mmol/LdNTP，0.25nmol/LNG_F，0.25網(wǎng)ol/LNG-R，0.125|iimol/LNG-P，0.25pmol/LUU-F，0.25pmol/LUU-R，0.156|mnol/LUU-P，0.25|umol/LCT_F，0.25)nmol/LCT-R，0.3125pmol/LCT-P，Hot-Start聚合酶2U，UNG酶0.2U，，模板量為3pL，補(bǔ)充水至40pL。(2)多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增條件PCR擴(kuò)增條件確定為42°C5分鐘、95。C15分鐘預(yù)變性；95°C15秒、60°C60秒；37°C恒溫。采用的PCR儀為ABIPRISM7000PCR熒光檢測儀，選定檢測熒光為FAM，HEX,ROX通道，并在PCR循環(huán)第二步60°C時(shí)收集熒光信號(hào)。儀器檢測通道選擇通道l，2，4;其它為默認(rèn)值。檢測結(jié)果如圖5所示，在圖5中，三條上升的曲線中最上面一條曲線代表NG，中間的第二條曲線代表UU，第三條曲線代表CT。根據(jù)樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及臨界對(duì)照的Ct值確定樣品中是否存在三種病原體的DNA，從而判定病人的病原體感染情況。實(shí)施例2檢測淋病奈瑟氏球菌(NG)、解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)的試劑盒的制備1.本發(fā)明試劑盒所采用的原材料(1)引物及探針本發(fā)明的引物及探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)合成。(2)其他材料純化水符合《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》要求，Hot-Start酶由超生生物公司提供、dNTP(dATP:dCTP:dGTP:dUTP=25mM:25mM:25mM:25mM)、UNG酶由普洛麥格公司提供。所有化學(xué)試劑為分析純或分析純以上級(jí)別，所有試劑均檢驗(yàn)合格。(3)對(duì)照品1)陰性對(duì)照品純化水。替代試驗(yàn)檢驗(yàn)合格。2)陽性對(duì)照品己知濃度的NG、UU、CT病原微生物菌液，已知濃度的NG、UU、CT病原微生物質(zhì)粒DNA溶液。2.檢測方法(1)標(biāo)本裂解、從存有分泌物懸濁液的離心管中取樣300^1于0.5ml離心管中，15000rpm離心10分鐘，棄上清；加入裂解緩沖液50^1。于IO(TC加熱IO分鐘，15000rpm離心5分鐘，取3^1上清進(jìn)行PCR反應(yīng)。要注意，裂解后的標(biāo)本應(yīng)保存在-2(TC，如結(jié)果有疑問，應(yīng)取出重復(fù)檢測，直至有了明確的結(jié)果后才可丟棄。每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)前，都要將裂解標(biāo)本離心(13000rpm，5分鐘)后取用。(2)PCR反應(yīng)試劑的制備1)引物及探針的制備引物，探針均為50D/管，將裝有引物或探針的1.5ml離心管13000rpm離心數(shù)秒，使引物干粉聚集于管底，加入500|til純化水，振蕩混勻后靜置10分鐘，探針需要避光靜置，使之充分溶解，13000rpm離心數(shù)秒。2)IOO人份三聯(lián)檢PCR反應(yīng)液的制備取4ml10Xbuffer，0.2ml25畫1/LdNTP，0.2ml50nmol/LNG-F，0.2ml50^imol/LNG-R，0.lml50|umol/LNG-P，0.2ml50pmol/LUU-F，0.2ml50nmol/LUU-R，0.125ml50,ol/LUU-P，0.2ml50^mol/LCT-F，0.2ml50^imol/LCT-R，0.25ml50,ol/LCT-P，用純化水定容至35ml，充分混勻。3)反應(yīng)液的質(zhì)控用待檢的反應(yīng)液檢測陰性內(nèi)控品、陽性內(nèi)控品，靈敏度內(nèi)控品，檢測結(jié)果符合陰性內(nèi)控品的CT值大于38或無CT值，陽性內(nèi)控品CT《28，靈敏度內(nèi)控品CT=2933，則為合格。(3)Hot-start聚合酶和UNG酶混合液(含0.5U/|iilHot-star聚合酶和0.05U/|nlUNG酶)的制備和質(zhì)控分別取2500UHot-start聚合酶、250UUNG酶混合，配備5ml酶溶液。替代試驗(yàn)合格。(4)裂解緩沖液的制備取1MTris-HC1(pH8.0)溶液10ml，0.5MEDTA(pH8.0)2.0ml，5MNaCl20ml，10%TritionX-100100ml,補(bǔ)加純化水定容至1000ml，充分混勻后高壓滅菌。替代試驗(yàn)合格。(5)對(duì)照品的制備1)陽性對(duì)照品的制備和質(zhì)控取含已知濃度的NG、UU、CT病原微生物質(zhì)粒DNA溶液，用TE稀釋，用企業(yè)內(nèi)控品測定陽性對(duì)照品CT《28。2)臨界對(duì)照品的制備取已知濃度的NG、UU、CT病原微生物菌液，用純化水稀釋10倍。用企業(yè)內(nèi)控品測定臨界對(duì)照品CT<36。(6)半成品檢定用企業(yè)內(nèi)控品檢定。1)特異性檢定取8份臨床確診為NG、UU、CT均為陰性的標(biāo)本作為陰性(特異性)參考品并進(jìn)行PCR試驗(yàn)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行——陰性符合率應(yīng)為100%，為合格。2)準(zhǔn)確性檢定取臨床確診為NG、UU、CT均為陽性的標(biāo)本各3份作為準(zhǔn)確性參考品，進(jìn)行PCR試驗(yàn)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行——陽性符合率應(yīng)100%，3)靈敏度檢定用高滴度(107copies/ml濃度用相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定)的臨床標(biāo)本以10倍的梯度逐級(jí)稀釋至103copies/ml，取103copies/ml、104copies/ml、105copies/ml、106copies/ml作為企業(yè)內(nèi)控敏感性參考品或已經(jīng)定量的標(biāo)準(zhǔn)株103copies/ml、104copies/ml、105copies/ml、106copies/ml作為敏感性參考品。取103copies/ml滴度的淋病奈瑟氏球菌，解脲支原體，沙眼衣原體混合，作為三檢試劑的臨界參考品，檢測結(jié)果CT符合CT二3236。4)精密度檢定用1份臨界對(duì)照，重復(fù)做10次，CT值變異系數(shù)不得大于15%。(7)分裝、貼簽、包裝1)分裝用微量移液器將準(zhǔn)備好的試劑分裝入清潔的離心管中，蓋緊管蓋，裝量如表1所示表l成份標(biāo)識(shí)量(pl)實(shí)際分裝量&1)PCR反應(yīng)液840900裂解緩沖液12001200Hot-start聚合酶+UNG酶4850陰性對(duì)照200200臨界對(duì)照200200陽性對(duì)照20202)貼簽'將檢驗(yàn)合格的標(biāo)簽，貼在相應(yīng)的離心管上。3)包裝按照試劑盒的組成成份，將相應(yīng)的離心管插入盒內(nèi)襯上，裝入盒中，放入說明書，封口。試劑盒組裝要求如下表2所示表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>3.試劑盒成品檢定(1)外觀檢定檢定方法目測。檢定標(biāo)準(zhǔn)試劑盒包裝完整無缺，并附有說明書；各試劑組分齊全、試劑分裝量符合組成要求。(2)特異性檢定、準(zhǔn)確性檢定、靈敏度檢定、精密度檢定同半成品檢定。4.保存及有效期在-2(TC保存條件下，自檢定合格之日起有效期為6個(gè)月。5.試劑盒使用說明本發(fā)明的試劑盒采用核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記探針雜交方法對(duì)NG、UU、CT的DNA進(jìn)行定性檢測。使用方法(1)試劑準(zhǔn)備按標(biāo)本的數(shù)量和所需的對(duì)照數(shù)量配制反應(yīng)體系，存于4。C。(2)標(biāo)本裂解從存有分泌物懸濁液的離心管中取樣300nl于0.5ml離心管中，15000rpm離心10分鐘，棄上清；加入裂解緩沖液50^1。于IO(TC加熱10分鐘，15000rpm離心5分鐘，取3|il上清進(jìn)行PCR反應(yīng)。(3)加樣在準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)液中分別加入裂解標(biāo)本上清液或定標(biāo)品。(4)PCR反應(yīng)按說明設(shè)定程序，在熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。保存于-2(TC保存，在有效期內(nèi)使用。序歹U表〈110〉上海申友健海生物技術(shù)有限責(zé)任公司<120>檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法〈130〉NP-07-11557<160>9〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉20<212>腿〈213〉人工序列〈220〉<221〉misc一feature〈223>引物〈400>1gctacgcatacccgcgttgc20〈210〉2〈211〉20<212>腿<213>人工序列〈220>〈221>misc—feature〈223>引物<400〉2cgaagaccttcgagcagaca20〈210〉3<211〉18〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<221〉misc一feature<223〉引物〈400〉3caggtaaattagtaccag18〈210〉4<211〉19〈212〉■〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc—feature〈223>引物<400〉4acgacgtccataagcaact19〈210〉5<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物〈400〉5ctaggcgtttgtactccgtca21<210>6<211>20〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈221>misc—feature<223>引物〈400〉6tcctcagaagtttatgcact20<210>7<211>24〈212>腿〈213〉人工序列〈400〉7ctgtttaagtcgtccagctcgttc24<210〉8〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉8ccgtcctatccaagttggatcaca24<210〉9〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉9gagagaacgtgcgggcgatttgc2權(quán)利要求1.一種檢測人泌尿生殖道病原體的引物，其特征在于，包括以下引物對(duì)中的至少一對(duì)(1)用于擴(kuò)增淋病奈瑟氏球菌靶核酸序列的引物對(duì)，其第一引物序列含有SEQIDNO1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO2的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸；(2)用于擴(kuò)增解脲支原體靶核酸序列的引物對(duì)，其第一引物序列含有SEQIDNO3的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO4的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸；(3)用于擴(kuò)增沙眼衣原體靶核酸序列的引物對(duì)，其第一引物序列含有SEQIDNO5的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO6的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。2.如權(quán)利要求l所述的引物，其特征在于，所述引物對(duì)至少包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2;禾口/或SEQIDNO:3、SEQIDNO:4;和/或SEQIDNO:5、SEQIDNO:6。3.—種檢測人泌尿生殖道病原體的探針，其特征在于，該探針包括至少以下的一種寡核苷酸序列(1)與權(quán)利要求1所述引物對(duì)擴(kuò)增的淋病奈瑟氏球菌的耙核酸序列進(jìn)行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:7或其互補(bǔ)序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸；(2)與權(quán)利要求1所述引物對(duì)擴(kuò)增的解脲支原體的耙核酸序列進(jìn)行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:8或其互補(bǔ)序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸；(3)與權(quán)利要求1所述引物對(duì)擴(kuò)增的沙眼衣原體的靶核酸序列進(jìn)行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:9或其互補(bǔ)序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。4.如權(quán)利要求3所述的探針，其特征在于，所述探針至少包括SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9中的一種寡核苷酸序列。5.—種檢測人泌尿生殖道病原體的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)提取核酸樣本；(2)用至少一對(duì)權(quán)利要求1所述的引物序列，以步驟(l)提取的核酸為模板，擴(kuò)增病原體的耙核酸序列；(3)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并分析結(jié)果。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中還包括加入能與步驟(2)所用弓I物對(duì)擴(kuò)增的靶核酸序列進(jìn)行雜交的探針序列。7.—種檢測人泌尿生殖道病原體的試劑盒，其特征在于，包括至少一對(duì)權(quán)利要求1所述的引物序列。8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包括至少一種權(quán)利要求3所述的探針序列，該探針序列與所含引物序列擴(kuò)增的靶核酸序列進(jìn)行雜交。9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，包含以下引物和探針組合中的至少一種組合(1)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2禾QSEQIDNO:7;(2)SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:8;(3)SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:9。全文摘要本發(fā)明公開了檢測人泌尿生殖道病原體的引物和探針，以及運(yùn)用該引物和探針對(duì)人泌尿生殖道病原體進(jìn)行檢測的方法。本發(fā)明方法可以在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測淋病奈瑟氏球菌、解脲支原體和沙眼衣原體三種不同的病原體，不僅提高性傳播疾病的早期檢出率，而且減少醫(yī)務(wù)人員的操作時(shí)間，降低成本，并減輕病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101117646SQ20071009393公開日2008年2月6日申請(qǐng)日期2007年7月6日優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日發(fā)明者張愛民,慧熊,謝立群,陳嘉錚申請(qǐng)人:上海申友健海生物技術(shù)有限責(zé)任公司