專利名稱：一種定量檢測輪狀病毒的方法及其專用標(biāo)準(zhǔn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測輪狀病毒的方法及其專用標(biāo)準(zhǔn)品。
背景技術(shù)：
輪狀病毒是全世界范圍內(nèi)人和動(dòng)物急性腹瀉的主要致病微生物之一。其中A組輪狀病毒是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的兒童急性胃腸炎最重要的原因，每年達(dá)到600,000-800,000的致死率(Umesh，D.P.，Joseph，S.B.，Jon，R.G.，Roger，I.G.，1998.Rotavirus.Emerg.Infect.Dis.4(4)，561-570)；近年的研究資料表明，我國秋冬季節(jié)50％～60％的嬰幼兒腹瀉由輪狀病毒引起(常汝需，何翠娟.腹瀉患兒糞便標(biāo)本中輪狀病毒檢測方法比較[J].中華兒科雜志，2000，38(11)703～704)。輪狀病毒是一種雙鏈RNA病毒，由11個(gè)基因組片段組成，它的核心部分是由70nm直徑的雙層衣殼組成。該病毒的內(nèi)殼具有四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1，VP2，VP3和VP6)，而外殼具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP4和VP7)。其中VP4和VP7是兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白，它們決定了輪狀病毒的血清型和病毒中和作用(neutralization)(Estes，M.K.，Palmer，E.L.，Obijeski，J.F.，1983.Rotaviruses.Curr.Top.Microbiol.Immunol.105，123-184)。輪狀病毒主要是通過糞-口途徑傳播，在生活污水和受污染的地表水中輪狀病毒存在十分常見，其主要是通過生長在污染水中的甲殼類動(dòng)物和污染的飲用水傳播(parashar，U.D；R.C Holman；M.J.Clarke；J.S.Bresee；and R.I.Glass.Hospitalizations associated with rotavirus diarrhea in the United States，1993through 1995surveillance based on the new ICD-9-CM rotavirus-specificdiagnostic code.1998.J.Infect.Dis.17713-17；Le Guyader，F(xiàn)；L.Haugarrean；L.Miossec；E.Dubois；and M.Pommepuy.Three-year study to assess human entericviruses in shellfish.Appli.Environ.Microbiol.2000.663241-3248)。
目前國內(nèi)外主要利用替代指標(biāo)來估計(jì)水體中病毒的含量(D.Hot.，O.Legeay，J.Jacquesa，C.Gantzerc，Y.Caudrelierb，K.Guyardb，M.Langeb，L.Andreolettia.Detection of somatic phages，infectious enteroviruses andenterovirus genomes as indicators of human enteric viral pollution in surfacewater，Water Research 2003374703-4710)。替代指標(biāo)主要利用細(xì)菌排泄物指示劑(糞大腸桿菌和鏈球菌)和人類糞便中特殊類型的噬菌體，如嗜肉性大腸桿菌噬菌體，F(xiàn)-特異性RNA噬菌體及bacteriophage fragilis噬菌體作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(A.Arraj1，，J.Bohatier，H.Laveran and O.Traore.Comparison ofbacteriophage and enteric virus removal in pilot scale activated sludgeplants.Journal of Applied Microbiology 2005.98516-524)。但是，研究表明在大腸桿菌和大腸桿菌噬菌體沒有超標(biāo)的情況下，病毒仍然存在，而且水體中大腸桿菌噬菌體和病毒相關(guān)性不理想，也不能反應(yīng)病毒的感染性。近年來，世界各國針對水環(huán)境中輪狀病毒的快速檢測展開了大量研究工作，其中基于實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)的檢測方法呈現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。
實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)是通過實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)過程中熒光信號的積累，對樣品進(jìn)行檢測和定量分析。Real-time PCR整個(gè)過程是在全封閉的狀態(tài)下進(jìn)行片段擴(kuò)增及產(chǎn)物分析的，這樣有效地減少了污染及對人體的危害，同時(shí)能夠快速大量地進(jìn)行定量檢測。Real-time PCR技術(shù)是快速簡便的定量檢測技術(shù)，它可以采用絕對定量和相對定量2種方式實(shí)現(xiàn)定量檢測。其中絕對定量是目前采用最多的一種，但是需要采用外標(biāo)準(zhǔn)品的定量制備來實(shí)現(xiàn)絕對定量(Lan.M.Mackay et al.Real-time PCRin Virology.Nucleic Acids Research.2006 301292-1305)。在Real-time PCR定量檢測中，這些外標(biāo)準(zhǔn)品的制備成為其能否準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵。
文獻(xiàn)報(bào)道分子生物學(xué)RT-PCR技術(shù)，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速等優(yōu)點(diǎn)，可以檢測受污染水體中的腸道致病病毒的每一個(gè)基因組RNA；其中腸道病毒基因組的檢測，對預(yù)測水體中病毒存在具有重要的意義(D.Hot.，O.Legeay，J.Jacquesa，C.Gantzerc，Y.Caudrelierb，K.Guyardb，M.Langeb，L.Andreolettia.Detectionof somatic phages.infectious enteroviruses and enterovirus genomes asindicators of human enteric viral pollution in surface water，Water Research2003 374703-4710)。同時(shí)L.Andreoletti等提出利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR定量檢測腸道病毒基因組是一種適合檢測水環(huán)境中病毒污染指標(biāo)的方法(D.Hot.，O.Legeay，J.Jacquesa，C.Gantzerc，Y.Caudrelierb，K.Guyardb，M.Langeb，L.Andreolettia.Detection of somatic phages，infectious enteroviruses andenterovirus genomes as indicators of human enteric viral pollution in surfacewater，Water Research 2003 374703-4710)。He and.Jiang等利用real-timePCR定量檢測環(huán)境樣品中的人類腺病毒和腸道球菌素，證明這種方法比病毒蝕斑分析或細(xì)菌培養(yǎng)方法具有更高的敏感性。隨后Jim Gray等將酶聯(lián)免疫分析(EIA)和real-time RT-PCR技術(shù)兩者相比較，結(jié)果表明real-time RT-PCR更快速經(jīng)濟(jì)(GagandeepKang，Miren Iturriza-Gomara，Jeremy G.Wheeler，Premila Crystal，BindhuMonica，Sasirekha Ramani，Beryl Primrose，Prabhakar D.Moses，Chris I.Gallimore，David W.Brown，and Jim Gray。Quantitation of Group A Rotavirusby Real-Time Reverse-Transcription-Polymerase Chain ReactionCorrelationWith Clinical Severity in Children in South India。Journal of Medical Virology.2004.73118-122)。Charlotte C.Yu Ip等報(bào)道應(yīng)用real-time PCR、nested-PCR和電子顯微鏡(electron microsopy)這三種技術(shù)檢測來自腹瀉兒童的糞便標(biāo)本中輪狀病毒，結(jié)果表明real-time RT-PCR分析具有簡單快速，敏感性高和減少外源性污染等優(yōu)點(diǎn)；并確定real-time RT-PCR可檢測多種情況包括隨機(jī)腹瀉、爆發(fā)流行、環(huán)境樣品等中的輪狀病毒(Xiaoli L.Pang，Bonita Lee，Nasim Boroumand，BarbaraLeblanc，Jutta K.Preiksaitis，and Charlotte C.Yu Ip。Increased Detectionof Rotavirus Using a Real Time Reverse transcription-Polymerase ChainReaction(RT-PCR)Assay in Stool Specimens From Children With Diarrhea。Journal of Medical Virology.2004.72496-501)。Pang等利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測了123例兒童腹瀉標(biāo)本的輪狀病毒感染，檢測靈敏度較傳統(tǒng)的RT-PCR和巢式PCR提高了102-104倍，耗時(shí)則是后者的一半，且證明該方法還可以監(jiān)控水環(huán)境樣品中的病毒污染情況(Pang XL，Lee B，Boroumand N，et al.Increased detection ofrotavirus using a real time reserve transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)assay in stool specimens from children with diarrhea.J Med Virol.2004.72(3)496-501)。綜上所述，近年一些研究者已經(jīng)采用real-time PCR技術(shù)檢測來自腹瀉標(biāo)本的輪狀病毒，但是水環(huán)境樣品中的輪狀病毒及其感染性的檢測還在探索過程中。這些研究者在樣就過程中考慮到real-time PCR技術(shù)的關(guān)鍵是定量，所以他們采用TaqMan探針技術(shù)或者外標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建來實(shí)現(xiàn)絕對定量。其中不同外標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建成為研究的關(guān)鍵技術(shù)。
就水質(zhì)控制標(biāo)準(zhǔn)而言，USEPA很重視水介病原微生物對人體健康的影響，在其水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中微生物標(biāo)準(zhǔn)為8項(xiàng)，其中包括病毒指標(biāo)，而我國的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中對水介傳播的病毒還沒有明確規(guī)定，僅規(guī)定耐熱大腸菌群每100mL水樣中不得檢出(CJ/T206-2005城市供水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn))。而在修訂水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)過程中，相應(yīng)的檢測方法的建立尤為重要。目前，國內(nèi)外尚無檢測水環(huán)境中輪狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)方法，Real-time PCR被認(rèn)為是最有前景的快速敏感定量的檢測方法。因此在Real-time PCR定量檢測中，外標(biāo)準(zhǔn)品的制備是其定量的關(guān)鍵技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測輪狀病毒的方法及其專用標(biāo)準(zhǔn)品。
本發(fā)明所提供的定量檢測輪狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)品，是含有序列表中序列1的核苷酸序列的重組載體，或是含有所述重組載體的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。
序列表中的序列1由318個(gè)脫氧核糖核苷酸組成。
序列1與GenBank中猴輪狀病毒株SA-11的所有VP7的序列具有99％以上的同源性，與GenBank中人輪狀病毒株的VP7序列具有75％以上的同源性。利用序列1所制備的標(biāo)準(zhǔn)品除可作為檢測猴輪狀病毒株的外標(biāo)準(zhǔn)品外，還可作為檢測其他輪狀病毒株的外標(biāo)準(zhǔn)品，該標(biāo)準(zhǔn)品具有廣譜性。
所述標(biāo)準(zhǔn)品可用于定量PCR檢測中。
所述定量PCR可為常規(guī)PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR。
任何可將承載的外源DNA片段帶入受體細(xì)胞，并在其中得以維持的DNA分子均可用于構(gòu)建所述重組載體，如質(zhì)粒、噬菌體載體、粘質(zhì)粒載體(cosmid)等基因工程載體。
所述重組載體可按照常規(guī)方法，將核苷酸序列是序列表中序列1的核苷酸片段插入載體的多克隆位點(diǎn)得到。
所述轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞可為細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明所提供的定量檢測輪狀病毒的方法，是分別以待檢測樣品和上述任一種標(biāo)準(zhǔn)品的基因組DNA為模板，或以分別由所述待檢測樣品和上述任一種標(biāo)準(zhǔn)品的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用由核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸片段和核苷酸序列是序列表中序列3的核苷酸片段組成的引物對進(jìn)行PCR，對待檢測樣品進(jìn)行輪狀病毒定量。
序列表中序列2的核苷酸序列是5′-CCTCACTTATACACTTTGCC-3′；序列表中序列3的核苷酸序列是5′-TTCGCTTCGTCAGTTTGCT-3′。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一個(gè)定量檢測輪狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)品，該標(biāo)準(zhǔn)品是將核苷酸序列是序列表中序列1的核苷酸片段和pGEM-T Easy載體連接得到的重組載體pGEM-T Easy-VP7。它是按照下述方法制備的1)從MA-104細(xì)胞中分離并培養(yǎng)猴輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株；2)利用Trizol裂解法進(jìn)行細(xì)胞總的RNA的提取，獲得總RNA；3)采用SuperscriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用特異性引物(序列2和序列3)，PCR擴(kuò)增序列是序列表中序列1的核苷酸片段；采用T-A克隆技術(shù)，將該核苷酸片段連入pGEM-T Easy載體，得到重組載體pGEM-T Easy-VP7。
上述外標(biāo)準(zhǔn)品pGEM-T Easy-VP7的制備方法中，輪狀病毒RNA是從MA-104細(xì)胞中培養(yǎng)制備，因此是感染性輪狀病毒典型的代表?；诖说玫降耐鈽?biāo)準(zhǔn)品屬于感染性輪狀病毒特異性的，在此基礎(chǔ)上建立的real-time PCR方法除在精確性、靈敏性方面具有優(yōu)勢外，同時(shí)在評價(jià)病毒的感染性方面具有更大的優(yōu)勢；由序列表中的序列2和序列3組成的引物包含了具有特異性的部分和結(jié)構(gòu)蛋白的部分，因此基于此建立的方法可檢測廣泛的、具有感染性的輪狀病毒，提高了檢測范圍和精度。
本發(fā)明的定量檢測輪狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)品具有廣譜識別和感染性特異相結(jié)合的特點(diǎn)，敏感性高，制備方法簡便，可長期保存，純度好，檢測線性范圍較寬，可以普遍用于各種樣品，特別是水環(huán)境中輪狀病毒的快速定量檢測。


圖1A是重組載體的酶切鑒定圖譜圖1B為pGEM-T Easy-VP7重組質(zhì)粒的部分測序結(jié)果圖2為不同稀釋滴度的pGEM-T Easy-VP7的常規(guī)PCR圖3A是實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3B是實(shí)時(shí)定量PCR的熔解曲線圖4為常規(guī)PCR檢測感染了猴輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株SA-11的Caco-2細(xì)胞的cDNA樣品結(jié)果圖5為實(shí)時(shí)定量PCR檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pGEM-T Easy-VP7的擴(kuò)增曲線圖6A為檢測未知樣品(Caco-2細(xì)胞的cDNA樣品)的實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖6B為實(shí)時(shí)定量PCR檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pGEM-T Easy-VP7和未知樣品(Caco-2細(xì)胞的cDNA樣品)的擴(kuò)增曲線具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下面僅以含有序列表中序列1的核苷酸序列的重組質(zhì)粒為例，闡明定量檢測輪狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)品定量檢測輪狀病毒的效果，其它含有序列表中序列1的核苷酸序列的重組載體或含有該重組載體的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞定量檢測輪狀病毒的效果都與該標(biāo)準(zhǔn)品相同。
實(shí)施例1、定量檢測輪狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)品pGEM-T Easy-VP7的制備A.輪狀病毒的培養(yǎng)利用DMEM+10％胎牛血清，在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)恒河猴細(xì)胞系MA-104細(xì)胞(ATCC號為HTB-37TM)，當(dāng)該細(xì)胞系在25cm2的培養(yǎng)瓶中生長為單層時(shí)，利用1×PBS清洗細(xì)胞兩次，以去除死細(xì)胞；接種500mL猴輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株SA-11(ATCC號為VR-1565TM)到培養(yǎng)MA-104細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，5％CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育1-2h，加入含有5mL2％胎牛血清的DMEM病毒維持液，培養(yǎng)5天后，觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)有明顯病毒蝕斑單位形成時(shí)，收集細(xì)胞，并收集細(xì)胞上清液，獲得擴(kuò)增猴輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株SA-11。
B.輪狀病毒RNA的提取采用Trizol裂解法對收集感染猴輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株SA-11的MA-104細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取。具體步驟如下1)在25cm2培養(yǎng)瓶約3×105個(gè)細(xì)胞中立即加入1mL Trizol，室溫下?lián)u床上均勻搖動(dòng)5min，利用1mL吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞裂解；2)加0.2mL氯仿，振蕩混勻，室溫放置2min；3)4℃2000g離心15min；4)取上清，加入0.5mL異丙醇混勻，室溫下放置10min；5)4℃12000g離心10min；6)棄上清，在RNA沉淀中加入1mL 75％的乙醇混勻；7)4℃7500g離心5min；8)棄上清，室溫或55℃干燥沉淀，用20μL DEPC水溶，于55℃-65℃置5min溶解。
9)使用紫外分光光度計(jì)鑒定RNA濃度和純度之后立即使用或置于-80℃保存，整個(gè)操作過程中，注意佩戴口罩，手套要經(jīng)常換防止RNA的降解。
C.cDNA的合成和特異性引物的設(shè)計(jì)cDNA的合成取4ug的總RNA使用逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptIII通過逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行cDNA的合成，操作過程如下20uL的cDNA的合成體系包括1uLOligo(dT)12-18(200-500ng)，5uL的mRNA(0.8ug/ul)，1uL的10mMdNTP，6uL的無RNA酶雙蒸水；該體系在65℃水浴反應(yīng)5min，在冰上孵育2min，進(jìn)行短暫離心后，立即加入如下幾種試劑到該管中4uL的5×第一條鏈反應(yīng)緩沖液，1uL的0.1M DTT，1uL的RNA酶抑制劑(40u/uL)，1uL的SuperScriptIII RT(200u/ul)；輕柔混合，在50℃水浴培養(yǎng)60min，在70℃水浴15min滅活。-20℃保存，備用。
特異性引物的設(shè)計(jì)在GenBank中下載猴輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株SA-11的所有VP7的序列和人輪狀病毒株部分VP7序列(見表1)。將這些序列輸入Clastla W軟件中進(jìn)行多序列比較分析其同源性，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和合成，引物的GC含量在40-60％之間，引物之間距離大于30bp。引物序列如下SA-11-Sense5′-CCTCACTTATACACTTTGCC-3′(序列2)；SA-11-Antisense5′-TTCGCTTCGTCAGTTTGCT-3′(序列3)。用無菌雙蒸水將引物配制成200umol/uL的儲(chǔ)存液，分裝，-20度保存。
表1.所有GenBank中猴輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株SA-11 VP7和人輪狀病毒VP7的序列信息

D.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備具體步驟為1)目的片段的制備和純化取8ul cDNA作為PCR反應(yīng)的模板，PCR反應(yīng)體系為100uL2uL 20uM上游引物(序列2)，2uL 20uM下游引物(序列3)，2uL 10mM dNTP，1.2uL TaqDNA聚合酶(5u/uL)，6.4uL 25mM MgCl2，10uL10×PCR緩沖液，76.4ul無菌雙蒸水。PCR反應(yīng)程序?yàn)橄?4℃4min；然后94℃1min，59℃40秒，72℃1min30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；再72℃延伸10min。取10uL PCR產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物大小為318bp，證明擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段。取90ul PCR產(chǎn)物行2％瓊脂糖回收膠，利用膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段的回收純化?；厥占兓笕?ul進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明回收純化的效果較好，可用于T-A和其他雙酶切克隆。
2)T-A克隆技術(shù)a.連接反應(yīng)將回收純化的目的片段和pGEM-T Easy載體連接，具體過程如下根據(jù)回收后進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳所見條帶的亮度，調(diào)節(jié)載體和目的片段的量分別進(jìn)行1∶1，1∶2和1∶3的連接反應(yīng)，最終確定為1∶3的連接比例較好，其連接體系為10uL3uL目的片段，1uL pGEM-T Easy載體，5uL 2×連接酶緩沖液，1uL T4DNA連接酶，4℃連接12h。
b.感受態(tài)細(xì)菌的制備利用CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細(xì)菌，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入該感受態(tài)細(xì)胞中，具體過程如下I.從37℃培養(yǎng)12～16h的平皿中挑取單菌落，轉(zhuǎn)移到含有3mL LB的試管內(nèi)，37℃過夜，次日取出1mL接種至100mL LB的500mL瓶中，37℃劇烈搖振培養(yǎng)2～3h(200～300r/min)，待OD600值達(dá)到0.3～0.4時(shí)，將燒瓶取出立即置冰浴10～15min。
II.菌液轉(zhuǎn)移到一個(gè)冰冷的滅菌的50mL離心管中，4℃ 4000g離心10min回收細(xì)菌。
III.棄培養(yǎng)液，用冰預(yù)冷的10mL 0.1M CaCl2重懸菌體，置冰浴30min。4℃ 4000g離心10min，棄去上清。
IV.再加2mL用冰浴預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸菌體(要輕)。置4℃冰箱12～24h，即可用于轉(zhuǎn)化。
V.按每份100uL分裝細(xì)胞，立刻進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
c.細(xì)菌的轉(zhuǎn)化新鮮制備的感受態(tài)菌，每100uL感受態(tài)菌加10uL連接產(chǎn)物，冰浴30h。42℃熱休克90s，立即插入冰中，放置2min。加入500uL LB，37℃，225rpm培養(yǎng)1h。8000rpm室溫離心，去掉部分上清，混勻后取適量涂含100ug/mLAmp+的LB培養(yǎng)皿，37℃孵育過夜(12～16h)，不能超過16h。
3)陽性克隆的鑒定利用改進(jìn)的堿裂解法提取質(zhì)粒的DNA。具體過程如下將轉(zhuǎn)化后涂盤已經(jīng)出現(xiàn)菌落的培養(yǎng)皿拿出，挑12個(gè)單菌落于含有5mL LB(Amp+)培養(yǎng)液中，在37℃培養(yǎng)10～12h；取1.5mL菌液于1.5mL Eppendorf管中，室溫，12000rpm離心5min；棄去上層液體，加入120uL含有RNA酶的溶液I(50mM葡萄糖，25mM pH8.0的Tris-HCl，10mM pH8.0的EDTA和10ug/mL RNaseA)劇烈振蕩，室溫放置10-15min；加240uL新配置的溶液II(1％SDS，200mM NaOH)，輕輕混勻，室溫不超過5min；加入180uL溶液III(60mL 5M乙酸鉀，11.5mL冰醋酸，加水到100mL)，顛倒混勻，室溫1-5min；室溫12000rpm離心10min，小心將上清液移入另一1.5mL離心管中；加事先混合好的等體積Tris飽和酚∶氯仿(1∶1)混勻，室溫12000rpm離心5min；吸上層水相于另一離心管中，加0.6-0.8倍體積的異丙醇，混勻，室溫12000rpm離心15-20min，棄上清；加入70％乙醇1mL，室溫12000rpm離心5min；棄上清，55℃干燥，加30uL TE溶解。-20℃保存，備酶切鑒定用。
利用Cutter2.0軟件在線分析目的片段中酶切圖譜，確定沒有EcoRI酶切位點(diǎn)，采用EcoRI對所提質(zhì)粒進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，選用100bp的Marker，在凝膠成像儀上觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明初步鑒定幾株陽性克隆。將酶切證明為陽性克隆的菌液送測序，測序結(jié)果進(jìn)行blast比對后，結(jié)果證明為陽性重組體，且該重組體和GenBank中下載猴輪狀病毒株SA-11的所有VP7的序列具有99％以上的同源性，該重組體中所承載的輪狀病毒DNA的核苷酸序列是序列表中的序列1，將含有核苷酸序列是序列表中的序列1的核苷酸片段的重組載體命名為pGEM-T Easy-VP7。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pGEM-T Easy-VP7構(gòu)建成功，進(jìn)行pGEM-T Easy-VP7的大量提取和純化。重組載體的酶切鑒定結(jié)果如圖1A所示，表明獲得了含有318bp外源DNA片段的重組載體。圖1A中，MDNA Marker；陰性沒有載體的酶切體系；1-12酶切重組載體的編號。pGEM-T Easy-VP7的部分測序圖譜如圖1B所示。
E.重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pGEM-T Easy-VP7的檢測步驟為1)重組質(zhì)粒濃度的測定和拷貝數(shù)的計(jì)算取純化的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品1ul到200ul的TE中，利用紫外分光光度測量260nm的OD值，確定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的純度較好。利用DNA質(zhì)量濃度＝A260×核酸稀釋倍數(shù)×50/1000的公式計(jì)算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為3.22ug/uL。獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度后需要計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，其中DNA的拷貝數(shù)＝(DNA的質(zhì)量/DNA的摩爾質(zhì)量)×6.02×1023。其中雙鏈DNA中1bp＝649Da；DNA的摩爾質(zhì)量＝649Da×(3000+318)bp；帶入公式中計(jì)算獲得為9×1011拷貝/uL。
2)重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-VP7穩(wěn)定性的確定取5批濃度為9×108-4拷貝數(shù)/uL的質(zhì)粒提取物，進(jìn)行分批凍存于-20度，凍存時(shí)間分別為1，20，60天。取這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的5批濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，該實(shí)時(shí)定量PCR中所用的熒光劑為SYBRgreen I，是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料。進(jìn)行平行孔重復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系經(jīng)優(yōu)化如下20uM上游引物(序列2)，20uM下游引物(序列3)和10mM dNTP分別為0.5ul；Taq DNA聚合酶為0.3uL；10×PCR反應(yīng)緩沖液為2uL；25mM MgCl2為1.6uL；20×SYBR green I染料為1.2uL，1uL 9×108-4拷貝數(shù)/uL為模板，用12.4ul的雙蒸水補(bǔ)足體積到20uL。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)過程經(jīng)優(yōu)化為先94℃2min預(yù)變性，然后按照94℃20秒，59℃30秒，72℃20秒，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。融解曲線的過程為95℃1min，55℃1min，至55℃30秒開始進(jìn)行81個(gè)循環(huán)，溫度變化范圍為0.5℃，結(jié)束溫度為95℃。經(jīng)過融解曲線的分析確定特異性反應(yīng)的Tm值為81℃。結(jié)果表明平行樣的Ct值之間的差＜0.5，說明組內(nèi)重復(fù)性較好；三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的CV值＜0.9％，表明該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
表2.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性檢測

4)實(shí)時(shí)定量PCR檢測重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pGEM-T Easy-VP7線性范圍將重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-VP7進(jìn)行10倍的倍比稀釋，稀釋滴度分別為9×109，9×108……9×100拷貝數(shù)/uL，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測，反應(yīng)參數(shù)和過程同步驟3)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定利用上述優(yōu)化的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)參數(shù)和程序可以檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍為9×100-9×1011拷貝數(shù)/uL。結(jié)果如圖5所示，實(shí)時(shí)定量PCR檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍為9×100-9×1011拷貝數(shù)/uL。
5)常規(guī)PCR檢測重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pGEM-T Easy-VP7的范圍將輪狀病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pGEM-T Easy-VP7進(jìn)行10倍的倍比稀釋，稀釋滴度分別為9×1011，9×1010，9×109，9×108……9×10-2拷貝數(shù)/uL，進(jìn)行常規(guī)PCR檢測20uM上游引物(序列2)，20uM下游引物(序列3)和10mM dNTP分別為0.5ul，Taq DNA聚合酶為0.3uL，10×PCR反應(yīng)緩沖液為2uL，25mM MgCl2為1.6uL，1uL 10倍倍比稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用13.6ul的雙蒸水補(bǔ)足體積到20uL。按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增94℃4min預(yù)變性，然后按照94℃1min，59℃40秒，72℃1min 30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖2所示，表明常規(guī)PCR的檢測范圍為9×103～9×1011拷貝數(shù)/uL，該結(jié)果為三次重復(fù)的結(jié)果。圖2中，MDNA Marker(100bp DNA ladder)；1～15分別代表以9×1011，9×1010，9×109，9×108……、9×10-2拷貝數(shù)/uL和陰性對照(雙蒸水)為模板進(jìn)行常規(guī)PCR檢測所擴(kuò)增出的目的片段，目的片段的大小為318bp，在圖中顯示為300bp和400bp之間的堿基對大?。?00bp處的條帶為擴(kuò)增過程中形成的引物二聚體。
F.實(shí)時(shí)定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取已知5個(gè)倍比稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pGEM-T Easy-VP7分別為9×108，9×107，9×106，9×105，9×104拷貝數(shù)/uL，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。同時(shí)每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行樣，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。所有反應(yīng)參數(shù)和過程同步驟E的3)。結(jié)果如圖3A所示，橫坐標(biāo)代表質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的起始稀釋滴度的Log10值，縱坐標(biāo)Threshold Cycle代表系列稀釋滴度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的臨界循環(huán)數(shù)。輪狀病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從9×104～9×107/uL拷貝數(shù)的范圍內(nèi)R2＝0.9995，說明該體系線性相關(guān)性較好；斜率為-3.207說明該體系擴(kuò)增效率較高。圖中結(jié)果為三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
G、實(shí)時(shí)定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的熔解曲線pGEM-T Easy-VP7融解曲線的測定方法同步驟E的3)，結(jié)果表明特異性反應(yīng)的Tm值為81±0.5℃(圖3B)。
實(shí)施例2、利用pGEM-T Easy-VP7在Caco-2細(xì)胞進(jìn)行感染性輪狀病毒的熒光定量PCR檢測利用含有15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞系Coco-2細(xì)胞(ATCC號為CRL-2378.1TM)；當(dāng)這種細(xì)胞系生長為單層時(shí)，分別接種四種滴度(103.5TCID50、101.5TCID50、10-0.5TCID50、10-1.5TCID50)的猴輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株SA-11(ATCC號為VR-1565TM)，同時(shí)各濃度設(shè)三個(gè)平行樣和未感染的細(xì)胞對照。感染120小時(shí)后，收集細(xì)胞利用Trizol裂解法，進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取。利用實(shí)施例1中C的方法進(jìn)行cDNA的合成，分別獲得Coco-2細(xì)胞三個(gè)感染滴度的cDNA，作為待測樣品。分別以Coco-2細(xì)胞三個(gè)感染滴度的cDNA和pGEM-T Easy-VP7(外標(biāo)準(zhǔn)品)為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)溫度條件分別與實(shí)施例1中相同。所用的引物除β-actin外均相同。
猴輪狀病毒SA-11的引物SA-11-Sense5′-CCTCACTTATACACTTTGCC-3′20個(gè)堿基(序列2)SA-11-Antisense5′-TTCGCTTCGTCAGTTTGCT-3′19個(gè)堿基(序列3)細(xì)胞內(nèi)管家基因β-actin特異性引物β-actin-sense5′-GGAGAAAATCTGGCACCACAC-3′；21個(gè)堿基β-actin-antisense5′-CGTACAGGTCTTTGCGGATGT-3′；21個(gè)堿基常規(guī)PCR檢測結(jié)果如圖4所示，Caco-2細(xì)胞在120小時(shí)檢測輪狀病毒的感染滴度為103.5TCID50。其中A為常規(guī)PCR在Caco-2細(xì)胞檢測輪狀病毒的感染滴度，所用引物為猴輪狀病毒株特異性引物。M，為DNA Marker(DL 2000)；C，為未感染輪狀病毒的Caco-2細(xì)胞的cDNA；N，為PCR反應(yīng)體系的陰性對照(雙蒸水)。Lane1～3為感染了10-1.5TCID50輪狀病毒的Caco-2細(xì)胞的cDNA；Lane4～6為感染了10-0.5TCID50輪狀病毒的Caco-2細(xì)胞的cDNA；Lane7～9為感染了101.5TCID50輪狀病毒的Caco-2細(xì)胞的cDNA；Lane10～12為感染了103.5TCID50輪狀病毒的Caco-2細(xì)胞的cDNA；B為常規(guī)PCR在Caco-2細(xì)胞檢測輪狀病毒的感染滴度，所用引物為細(xì)胞內(nèi)管家基因β-actin特異性引物。M，為DNA Marker(DL 2000)；C，為未感染輪狀病毒的Caco-2細(xì)胞的cDNA；N，為PCR反應(yīng)體系的陰性對照(雙蒸水)。Lane1～3為感染了10-1.5TCID50輪狀病毒的Caco-2細(xì)胞的cDNA；Lane4～6為感染了10-0.5TCID50輪狀病毒的caco-2細(xì)胞的cDNA；Lane7～9為感染了101.5TCID50輪狀病毒的Caco-2細(xì)胞的cDNA；Lane10～12為感染了103.5TCID50輪狀病毒的Caco-2細(xì)胞的cDNA。
利用pGEM-T Easy-VP7作為外標(biāo)準(zhǔn)品在caco-2細(xì)胞進(jìn)行感染性輪狀病毒的熒光定量PCR檢測結(jié)果總結(jié)如下根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)如圖6A所制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出103.5TCID50輪狀病毒感染的Caco-2細(xì)胞的cDNA樣品中，輪狀病毒的拷貝數(shù)為4.467×106個(gè)/uL，101.5TCID50輪狀病毒感染的Caco-2細(xì)胞的cDNA樣品中，輪狀病毒的拷貝數(shù)為1.354×105個(gè)/uL。由圖6B可知實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線呈典型的“S”形，具有很好的擴(kuò)增平臺(tái)期；由熔解曲線分析表明擴(kuò)增是輪狀病毒特異性的。圖6B中，曲線1是陰性對照(雙蒸水)，曲線2是感染了10-0.5TCID50輪狀病毒的caco-2細(xì)胞的cDNA，曲線3是感染了101.5TCID50輪狀病毒的caco-2細(xì)胞的cDNA，曲線4是感染了103.5TCID50輪狀病毒的caco-2細(xì)胞的cDNA，曲線5-8分別是pGEM-T Easy-VP7的9×104，9×105，9×106，9×107拷貝數(shù)/uL。這些結(jié)果表明實(shí)時(shí)定量PCR的檢測的結(jié)果較可靠，且敏感性較常規(guī)PCR的檢測敏感性高100倍；同時(shí)這些結(jié)果也表明本發(fā)明中所制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品具有較好的線性關(guān)系和檢測范圍。
序列表<160>3<210>1<211>318<212>DNA<213>猴輪狀病毒SA-11(Simian rotavirus)<400>1cctcacttct acactttgcc tatattatcc gactgaggct gcgactgaaa taaacgataa60ttcatggaaa gacacactgt cacaactatt tcttacgaaa gagtggccaa ctggatccgt120atattttaaa gaatatacta acattgcatc gttttctgtt gatccgcagt tgtattgtga180ttataacgta gtactaatga aatatgacgc gacgttgcaa ttggatatgt cagaacttgc240ggatctaata ttaaacgaat ggttgtgtaa tccaatggat attactctgt attattatca300gcaaactgac gaagcgaa 318<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2cctcacttat acactttgcc20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3ttcgcttcgt cagtttgct 19
權(quán)利要求
1.定量檢測輪狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)品，是含有序列表中序列1的核苷酸序列的重組載體，或是含有所述重組載體的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于定量檢測為定量PCR檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于所述定量PCR為常規(guī)PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于所述重組載體為質(zhì)粒、噬菌體載體或粘質(zhì)粒載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞為細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)品是將核苷酸序列是序列表中序列1的核苷酸片段和pGEM-T Easy載體連接得到的重組載體。
7.權(quán)利要求1至5中任一權(quán)利要求所述的標(biāo)準(zhǔn)品在定量PCR檢測輪狀病毒中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述定量PCR為常規(guī)PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR。
9.一種定量檢測輪狀病毒的方法，是分別以待檢測樣品和權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的標(biāo)準(zhǔn)品的基因組DNA為模板，或以分別由所述待檢測樣品和權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的標(biāo)準(zhǔn)品的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用由核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸片段和核苷酸序列是序列表中序列3的核苷酸片段組成的引物對進(jìn)行PCR，對待檢測樣品進(jìn)行輪狀病毒定量。
10.含有權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量檢測輪狀病毒的方法及其專用標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明的定量檢測輪狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)品，是含有序列表中序列1的核苷酸序列的重組載體，或是含有所述重組載體的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。本發(fā)明的定量檢測輪狀病毒的方法，是分別以待檢測樣品和該標(biāo)準(zhǔn)品的基因組DNA為模板，或以分別由所述待檢測樣品和該標(biāo)準(zhǔn)品的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用由核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸片段和核苷酸序列是序列表中序列3的核苷酸片段組成的引物對進(jìn)行PCR，對待檢測樣品進(jìn)行輪狀病毒定量。該標(biāo)準(zhǔn)品具有廣譜識別和感染性特異相結(jié)合的特點(diǎn)，敏感性高，制備方法簡便，可長期保存，純度好，檢測線性范圍較寬，可以普遍用于各種樣品，中輪狀病毒的快速定量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101058834SQ20071009958
公開日2007年10月24日 申請日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日
發(fā)明者何苗, 胡秀華, 劉麗, 施漢昌, 李丹 申請人:清華大學(xué)