專利名稱：：一種分離培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種分離培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法及其專用培養(yǎng)基。技術(shù)背景干細(xì)胞是一種具有自我更新能力和多系分化潛能的原始細(xì)胞，是細(xì)胞移植的理想細(xì)胞。在個(gè)體發(fā)育過程中，存在各種形式的干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞，多能干細(xì)胞以及各種組織中的定向干細(xì)胞如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等。但在實(shí)際應(yīng)用上卻面臨倫理的挑戰(zhàn)或取材的限制。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是存在于人體組織中具有多系分化潛能的一種亞全能干細(xì)胞群，因其在特定環(huán)境下可誘導(dǎo)分化為多種組織細(xì)胞，且具有免疫源性低，移植后能形成穩(wěn)定嵌合等特點(diǎn)，故可作為一種理想的供異基因移植的細(xì)胞。以前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，骨髓或脂肪等組織來源的MSC可以在體外經(jīng)誘導(dǎo)分化為肌肉細(xì)胞，為這類細(xì)胞用于體內(nèi)移植提供了理論基礎(chǔ)，因?yàn)橹窘M織較骨髓更容易取材而且來源更為豐富，所以成體脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床上具有更高的應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種分離培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法及其專用培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)用培養(yǎng)基，包括動(dòng)物細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(FCS)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF);所述胎牛血清的終濃度為1-200mL/L，所述表皮生長(zhǎng)因子的終濃度為l-100ng/ml，所述血小板衍生生長(zhǎng)因子的終濃度為l-100ng/ml。其中，所述胎牛血清的終濃度優(yōu)選為10-100mL/L，尤其優(yōu)選為10-30ml/L，最優(yōu)選為20ml/L;所述表皮生長(zhǎng)因子的終濃度優(yōu)選為10-30ng/ral，尤其優(yōu)選為10ng/ml;所述血小板衍生生長(zhǎng)因子的終濃度優(yōu)選為10-30ng/ml，尤其優(yōu)選為10ng/ml。所述動(dòng)物細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基可為腿EM/F12、MCDB-201、DMEM、MEM、RPMI1640、DMEM、M199、BME禾nIMEM等中的任意一種或其任意組合。本發(fā)明所提供的分離培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，是消化人脂肪組織，收集細(xì)胞，將所收集的細(xì)胞接種在塑料培養(yǎng)容器中，加入上述任一種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，收集貼壁細(xì)胞；將所述貼壁細(xì)胞在所述專用培養(yǎng)基中傳代2次或2次以上，得到人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。上述方法中，所收集的細(xì)胞按4X105個(gè)/ml—lXl()7個(gè)/ml的接種密度接種在塑料培養(yǎng)容器中；優(yōu)選的接種密度是2Xl()6個(gè)/ml培養(yǎng)基。上述方法中，所述培養(yǎng)的環(huán)境條件為50ml/LC02，37"和95%的相對(duì)空氣濕度。本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法，適合于從各種脂肪組織中分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，該分離培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、效率高。培養(yǎng)得到的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有CD31—、CD34—、CD45—和HLA-DR一，且CD29+、CD44+、CD105+和Flk-l+的表型；在體外經(jīng)誘導(dǎo)可表達(dá)骨骼肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性細(xì)胞表面標(biāo)志和相關(guān)抗原分子，分化為骨骼肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞；在藥物導(dǎo)致的肌肉損傷模型小鼠體內(nèi)可分化為肌纖維、血管內(nèi)皮和有功能的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，并能部分恢復(fù)杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)模型小鼠(mdx)肌膜上抗肌萎縮蛋白的表達(dá)，緩解其病理癥狀。本發(fā)明方法得到的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可應(yīng)用于體內(nèi)治療外因?qū)е碌募∪鈸p傷和遺傳因素導(dǎo)致的肌肉進(jìn)行性壞死，治療各種獲得性或遺傳性肌肉損傷導(dǎo)致的肌纖維及肌肉血管缺損，為治療肌肉組織相關(guān)疾病，包括嚴(yán)重肌肉損傷和以杜氏肌營養(yǎng)不良癥代表的遺傳性疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和臨床研究證據(jù)，為細(xì)胞移植治療提供了新的途徑。圖1為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)、免疫表型和細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果圖2為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為肌肉細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果圖3為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植C57BL/6小鼠后4周，免疫熒光檢測(cè)供體細(xì)胞(FITC-P2M)分化情況圖4為供體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源肌肉衛(wèi)星細(xì)胞在肌肉再次損傷后被激活圖5為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療DMD模型小鼠mdxA部分重建肌纖維膜上抗肌萎縮蛋白(PE-dystrophin)的表達(dá)B治療組中心核肌纖維比例顯著減少C治療組血清肌酸激酶(CK)水平明顯降低具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)一、試劑I型膠原酶購自Sigma公司。月夷蛋白酶購自Gibco公司。DMEM/F12(即DF12)、M199、MEM、RPMI1640、BME、IMEM禾口DMEM購自GIBCO公司。MCDB-201購自Sigma公司。EGF購自Gibco公司。PDGF、VEGF和bFGF購自Sigma公司。氫化可的松購自Sigma公司。FCS和馬血清(HS)購自Hyclone公司。二、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)分別用下列3種培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)A、由終濃度為580ml/LDMEM/F12，400ral/LMCDB-201，20ml/L胎牛血清(FCS)，10ng/mlEGF，10ng/mlPDGF組成。B、由終濃度為580ml/LDMEM/F12,419ml/LMCDB-201，lml/L胎牛血清(FCS)，lng/mlEGF，lng/mlPDGF組成。C、由終濃度為400ml/LDMEM/F12，400ml/LMCDB-201，200ral/L胎牛血清(FCS)，100ng/mlEGF，由100ng/mlPDGF組成。采用吸脂術(shù)采集出來的脂肪組織，用D-Hank，s洗2遍以稀釋麻醉藥，0.75g/LI型膠原酶37"C消化lh，用100目篩網(wǎng)過濾后，室溫1200g離心10分鐘，得到細(xì)胞沉淀，之后用D-Hank's重懸并洗滌2遍以除去膠原酶，室溫1200g離心10分鐘，收集細(xì)胞。細(xì)胞以2X106個(gè)/ml的密度分別接種于裝有上述A至C擴(kuò)增培養(yǎng)液的T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶(購自Corning公司)中，在37。C、50ml/LC02、空氣相對(duì)濕度為95%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24-48小時(shí)棄去未貼壁的細(xì)胞，并補(bǔ)充相同的擴(kuò)增培養(yǎng)液，以后每3天半量換相同的擴(kuò)增培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%-80%匯合時(shí)，1.25g/L胰蛋白酶(Gibco公司)常規(guī)消化，細(xì)胞按照l:3進(jìn)行傳代。結(jié)果表明細(xì)胞接種于A擴(kuò)增培養(yǎng)液中，在接種后7-10天細(xì)胞(原代細(xì)胞)達(dá)70%-80%匯合，有內(nèi)皮樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞兩種形態(tài)。第1代細(xì)胞在A擴(kuò)增培養(yǎng)液中，培養(yǎng)2-3天，達(dá)70%-80%匯合，細(xì)胞基本為梭形，少數(shù)呈內(nèi)皮細(xì)胞樣形態(tài)，梭形細(xì)胞的百分比大于95%。第2代細(xì)胞在A擴(kuò)增培養(yǎng)液中，培養(yǎng)2-3天，達(dá)70%-80%匯合，細(xì)胞均呈梭形。經(jīng)鑒定，該梭形細(xì)胞即為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。結(jié)果表明細(xì)胞接種于B擴(kuò)增培養(yǎng)液中，在接種后10-14天細(xì)胞(原代細(xì)胞)達(dá)70%-80%匯合，有內(nèi)皮樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞兩種形態(tài)。第1代細(xì)胞在B擴(kuò)增培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3-4天，達(dá)70%-80%匯合，細(xì)胞基本為梭形，少數(shù)呈內(nèi)皮細(xì)胞樣形態(tài)，梭形細(xì)胞的百分含量約95%。第2代細(xì)胞在B擴(kuò)增培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3-4天，達(dá)70%-80%匯合，梭形細(xì)胞的百分含量大于99%。經(jīng)鑒定，該梭形細(xì)胞即為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。結(jié)果表明細(xì)胞接種于C擴(kuò)增培養(yǎng)液中，在接種后5-8天細(xì)胞(原代細(xì)胞)達(dá)70%-80%匯合，有內(nèi)皮樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞兩種形態(tài)。第1代細(xì)胞在C擴(kuò)增培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1-2天，達(dá)70%-80%匯合，細(xì)胞以梭形為主，少數(shù)呈內(nèi)皮細(xì)胞樣形態(tài)，梭形細(xì)胞的百分含量約90%。第2代細(xì)胞在C擴(kuò)增培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1-2天，達(dá)70%-80%匯合，梭形細(xì)胞的百分含量約95%。第3代細(xì)胞在C擴(kuò)增培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1-2天，達(dá)70%-80%匯合，梭形細(xì)胞的百分含量大于99%。經(jīng)鑒定，該梭形細(xì)胞即為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。二、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定1、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型和細(xì)胞周期測(cè)定用直接免疫熒光法檢測(cè)步驟一中得到的梭形細(xì)胞的表型，細(xì)胞用異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的小鼠抗人CD29、CD44、CD105、Flk-1、CD31、CD34、CD45和HLA-DR抗體(上述抗體均購自BD公司)標(biāo)記后進(jìn)行流式檢測(cè)，流式細(xì)胞儀為BDFACScan(BectonDickinson)。并用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期細(xì)胞用80y。的冷乙醇4。C固定lh。PBS洗2遍，0.5mlPBS重懸細(xì)胞，加RnaseA(100ug/ml)，37。C溫浴30分鐘。測(cè)定前加碘化丙錠(Sigma，5tig/ml)染色。以ModiFit軟件(BectonDickinson)分析細(xì)胞周期。表型結(jié)果顯示，A、B和C擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的梭形細(xì)胞的CD29、CD44、CD105和Flk-l均為陽性，CD31、CD34、CD45和MHCII類分子均為陰性。細(xì)胞周期測(cè)定，結(jié)果表明A、B和C擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的梭形細(xì)胞96.2%處在G0/G1期，而處在G2-M期和S期的細(xì)胞比例很低。圖1中顯示的是A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的梭形細(xì)胞的結(jié)果。圖1中，A為免疫表型檢測(cè)結(jié)果，橫坐標(biāo)表示細(xì)胞熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)；P2表示所選細(xì)胞群體；B第2代的細(xì)胞形態(tài)；C為細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果，橫坐標(biāo)表示熒光通道，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)。2、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為肌肉細(xì)胞和RT-PCR及免疫熒光檢測(cè)將A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞、B擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞、C擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第3代細(xì)胞，在貼壁后，分別換用成肌誘導(dǎo)體系(930ml/LDMEM、20ml/LFCS、50ml/L馬血清(horseserum，HS)、50,氫化可的松)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3天半量換液，誘導(dǎo)培養(yǎng)l周后，A、B和C擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的梭形細(xì)胞均具有如下培養(yǎng)特點(diǎn)部分細(xì)胞體積均明顯增粗，由原來的梭形變?yōu)榕謼U妝(圖2中A)，誘導(dǎo)2周后，個(gè)別細(xì)胞開始彼此融合，逐漸形成多核的管狀細(xì)胞。誘導(dǎo)3周時(shí)，形成多核肌管樣細(xì)胞，PE-抗肌球蛋白重鏈(MHC)免疫熒光染色顯示，部分細(xì)胞發(fā)紅色熒光，呈陽性(圖2中C)。半定量RT-PCR分析顯示，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在成肌誘導(dǎo)過程中漸次表達(dá)成肌調(diào)節(jié)因子(myogenicregulatoryfactors,MRFs)家族中Myf5，MyoD，myogenin等基因和骨骼肌細(xì)胞特異性肌球蛋白(myosin)基因(圖2中D)。圖2中A、B、C和D為A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞分化為肌肉細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果A成肌誘導(dǎo)l周形態(tài)；B成肌誘導(dǎo)3周形態(tài)；C成肌誘導(dǎo)3周的PE-抗肌球蛋白重鏈(MHC)染色；D半定量RT-PCR，圖2中D，1、2、3、4和5分別表示誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)1周、誘導(dǎo)2周、誘導(dǎo)3周、陽性對(duì)照為胎肌組織。其中，MHC免疫熒光染色方法如下成肌誘導(dǎo)3周后，細(xì)胞以4%多聚甲醛固定，PBS清洗后以血清封閉，然后用小鼠抗MHC單克隆抗體(myosinheavychain,SantaC環(huán)，1:100)室溫孵育1小時(shí)，PBS清洗后，再以TRITC-標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgG二抗室溫孵育30分鐘。PBS清洗后用Hoechst33342(Sigma)復(fù)染細(xì)胞核(蘭色熒光)。熒光顯微鏡下觀察(Olympus)。未誘導(dǎo)的MSC無陽性；而成肌誘導(dǎo)3周的部分細(xì)胞有紅色熒光，為MHC陽性；C2C12(成肌細(xì)胞系)做為陽性對(duì)照。半定量RT-PCR分析中，以人e-actin作為對(duì)照，用于擴(kuò)增人Myf5，人MyoD，人myogenin、人肌球蛋白(myosin)的引物分別如表1所示。表l擴(kuò)增Myf5，MyoD，myogenin、肌球蛋白(myosin)的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和RT-PCR及免疫熒光檢測(cè)用Matrigel膠鋪底，分別將A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞、B擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞、C擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第3代細(xì)胞，接種于24孔板，用內(nèi)皮誘導(dǎo)體系(980ml/LM199、20ml/LFCS、50ng/mlVEGF、10ng/mlbFGF)培養(yǎng)，A、B和C擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的梭形細(xì)胞均具有如下培養(yǎng)特點(diǎn)在成內(nèi)皮誘導(dǎo)最初的12小時(shí)內(nèi)，接種的細(xì)胞由圓形逐漸伸展成短梭形，由分散狀態(tài)逐漸變成一些聚集的細(xì)胞群(圖2中E);第24小時(shí)，細(xì)胞簇變大，簇與簇之間連接，能夠看到初步的網(wǎng)格狀形成；48小時(shí)后，網(wǎng)格之間連線變細(xì)，由節(jié)點(diǎn)互相連接，形成網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)(圖2中F)。vWF免疫熒光染色顯示，多數(shù)細(xì)胞呈陽性(圖2中G)。RT-PCR顯示分化后的細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志CD31和CD34(圖2中H)。圖2中E、F、G和H為A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果E成血管內(nèi)皮誘導(dǎo)12小時(shí)；F成血管內(nèi)皮誘導(dǎo)48小時(shí)；G成血管內(nèi)皮誘導(dǎo)48小時(shí)，PE-vWF染色；H半定量RT-PCR，誘導(dǎo)前(l道)、誘導(dǎo)后(2道)、陽性對(duì)照為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)(3道)。其中，vWF免疫熒光染色方法如下成內(nèi)皮誘導(dǎo)48小時(shí)后，用2.4U/ml的dispase消化matrigel收集釋放的細(xì)胞。之后，將收集到的細(xì)胞在明膠包被的蓋玻片上貼4小時(shí)做細(xì)胞爬片。蓋玻片用4%的多聚甲醛室溫固定10分鐘，PBS清洗后，血清封閉IO分鐘來減少非特異性結(jié)合。滴加PE標(biāo)記的小鼠抗vWF單克隆抗體(BD公司，1:50稀釋)，室溫孵育l小時(shí)，PBS清洗后用Hoechst33342(Sigma)復(fù)染細(xì)胞核。熒光顯微鏡下觀察(Olympus)。半定量RT-PCR分析中，以人e-actin作為對(duì)照，用于擴(kuò)增人CD31和人CD34的引物如表2所示。表2擴(kuò)增人CD31和CD34的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4、骨骼肌損傷模型的建立、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體移植和體內(nèi)分化檢測(cè)選用8周齡C57BL/6小鼠(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所)，脛骨前肌(tibialisanterior,TA)單點(diǎn)注射10yM濃度的蛇毒毒素(cardiotoxin，CTX1，購自Sigma公司)，25y1/TA,制成骨骼肌損傷模型。CTX1注射24小時(shí)后，將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞)以25ylPBS重懸后原位注射到同一TA肌肉(L.I.)，或以200ulPBS重懸后經(jīng)尾靜脈移植(I.V.)，劑量為1X106個(gè)細(xì)胞/只。A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞原位注射5只小鼠的TA，尾靜脈移植5只小鼠。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞原位移植后4周時(shí)，取移植細(xì)胞的TA肌和對(duì)側(cè)TA肌(未移植細(xì)胞)，福爾馬林固定后，石蠟包埋切片，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)片子脫蠟后以PBS清洗，血清封閉IO分鐘來減少非特異性結(jié)合，然后分別用小鼠抗人MHC、vWF、laminin和Pax7單克隆抗體(均購自SantaCruz公司，1:100稀釋)與山羊抗人P2M單克隆抗體(SantaCruz，1:200稀釋)共同進(jìn)行孵育，室溫1小時(shí)。這些片子用PBS清洗后，再用TRITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠和FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG二抗(中杉，1:50稀釋)室溫孵育30分鐘。PBS清洗后用Hoechst33342(Sigma)復(fù)染細(xì)胞核。熒光顯微鏡下觀察(Olympus)。結(jié)果表明A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞原位移植后4周的TA肌表達(dá)人特異P2微球蛋白(P2M)的供體細(xì)胞分化為肌球蛋白重鏈(MHC)陽性的多核肌纖維和vWF陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞，并有部分供體來源的單核細(xì)胞位于肌纖維膜和laminin陽性的基膜之間(與肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的特異組織定位相符)，且表達(dá)Pax7;而未移植細(xì)胞的對(duì)側(cè)TA肌則檢測(cè)不到供體來源細(xì)胞(人特異P2M為陰性)。圖3顯示的是A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞原位移植后4周的TA肌中供體細(xì)胞(即P2M陽性細(xì)胞)的分化情況。圖3中A，P2M/MHC免疫熒光雙染表明植入的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為多核肌管細(xì)胞，左為合成圖，箭標(biāo)所示為供體來源的肌纖維(呈黃色熒光)；中為人P2M陽性的供體細(xì)胞(呈綠色熒光)，右為MHC陽性的肌纖維(呈紅色熒光)。B，e2M/vWF免疫熒光雙染表明植入的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，左為合成圖，箭標(biāo)所示為供體來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞(呈黃色熒光)，箭頭所示為受體自身的血管內(nèi)皮細(xì)胞(呈紅色熒光)；中為人P2M陽性的供體細(xì)胞(呈綠色熒光)；右為vWF陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞(呈紅色熒光)。C，PE-Pax7免疫熒光檢測(cè)表明植入的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，左為合成圖，箭標(biāo)所示為供體來源的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞(呈黃色熒光)，箭頭所示為受體自身的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞(呈紅色熒光)，中為人02M陽性的供體細(xì)胞(呈綠色熒光)；右為Pax7陽性的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞(呈紅色熒光)。D，P2M/larainin免疫熒光雙染表明植入的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的單核細(xì)胞位于肌纖維膜和laminin陽性的基膜之間，左為合成圖，箭標(biāo)所示為供體來源的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞(呈黃色熒光)；中為人P2M陽性的供體細(xì)胞(呈綠色熒光)；右為laminin陽性的基膜(呈紅色熒光)。為了探討供體來源的Pax7陽性細(xì)胞是否為有功能的肌肉干細(xì)胞，在細(xì)胞移植后4周時(shí)，移植細(xì)胞的TA肌再次以CTX致?lián)p，24小時(shí)后，進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和Myf5基因。其中，擴(kuò)增PCNA的引物，上游引物5'-GGAGAACTTGGAAATGGAAAC-3，，下游引物5，-CTGCATTTAGAGTCAAGACCC-3，;擴(kuò)增GAPDH基因的引物，上游引物5，-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3，，下游引物5，-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3';擴(kuò)增Myf5、mh-e-actin基因的引物同表l。結(jié)果表明CTX損傷的植入A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞的TA肌高表達(dá)人特異的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和Myf5，而作為對(duì)照的未損傷的植入A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞的TA肌則無表達(dá)。這提示植入的部分供體細(xì)胞以靜止(Myf5陰性)的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞形式存在，而在肌肉損傷后被激活(表達(dá)活化標(biāo)記，如Myf5)，并再次參與肌肉修復(fù)。圖4顯示的是A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞來源的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞在肌肉再次損傷后的PCNA和Myf5的表達(dá)情況。圖4中，1為未移植細(xì)胞的C57BL/6小鼠的CTX損傷TA肌，2為A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞，3為移植A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞的C57BL/6小鼠再次CTX損傷的TA肌，4為對(duì)照，即未損傷的移植A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞的TA肌。圖4中，h-Myf5表示人Myf5基因；h-PCNA表示人PCNA基因；mh-P-actin表示人鼠通用P-actin基因；GAPDH表示人GAPDH基因。另外，在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞尾靜脈移植4周后，取CTX損傷TA肌、未損傷TA肌和其他臟器，石蠟包埋切片，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)(步驟和試劑均如前所述)。結(jié)果表明在CTX損傷的TA肌中有供體細(xì)胞存在，且分化為MHC陽性的肌管細(xì)胞，而未損傷的TA肌中則均沒檢測(cè)到供體細(xì)胞，另外，在其他臟器組織中也無供體細(xì)胞存在，僅在肺部有少量存在，但并不表達(dá)腿C。這表明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞傾向于歸巢至損傷肌肉部位，并且其成肌分化具有組織特異性。5、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植后，可部分改善DMD模型小鼠的病理特征DMD是一種X-性連鎖隱性遺傳性疾病，由于DMD基因缺陷，導(dǎo)致肌細(xì)胞膜上該基因編碼的抗肌萎縮蛋白(dystrophin,Dys)表達(dá)異常或缺失，從而引起肌膜形態(tài)和功能損害，致使肌纖維進(jìn)行性變性壞死。當(dāng)其肌肉干細(xì)胞(musclesatellitecells,肌肉衛(wèi)星細(xì)胞)庫因細(xì)胞不斷調(diào)動(dòng)而耗竭，就造成肌纖維不可逆的壞死，甚至消失，并為增生結(jié)締組織所替代，最終導(dǎo)致死亡。傳統(tǒng)的藥物治療無法從根本上糾正其基因表達(dá)缺陷，為了進(jìn)一步探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)于遺傳性疾病是否具有療效，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植DMD模型小鼠mdx。DMD模型小鼠mdx(購自南京模式動(dòng)物中心)將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞)以200ulPBS重懸后經(jīng)尾靜脈移植(I.V.)，劑量為1Xl(f個(gè)細(xì)胞/只，移植20只mdx小鼠，另20只mdx小鼠作為對(duì)照。在移植后4周取TA肌肉石蠟包埋切片，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè):片子脫蠟后以PBS清洗，血清封閉10分鐘來減少非特異性結(jié)合，然后用小鼠抗人dystrophin單克隆抗體(購自SantaCruz公司，1:100稀釋)與山羊抗人P2M單克隆抗體(SantaCruz,1:200稀釋)共同進(jìn)行孵育，室溫1小時(shí)。用PBS清洗后，再用TRITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠和FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG二抗(中杉，1:50稀釋)室溫孵育30分鐘。PBS清洗后用Hoechst33342(Sigma)復(fù)染細(xì)胞核。熒光顯微鏡下觀察(Olympus)。結(jié)果表明細(xì)胞移植組(治療組)的TA肌肉中具邊緣核特征的dystrophin陽性的成熟肌纖維成簇存在，并且?guī)缀跛羞@些肌纖維都為供體細(xì)胞來源(人特異P2M陽性)。圖5牛A顯示的是移植A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞后4周的TA肌肉的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。左為合成圖，供體來源的肌纖維其肌膜上表達(dá)抗肌萎縮蛋白(dystrophin);中為人P2M陽性的供體細(xì)胞(呈綠色熒光)；右為dystr叩hin陽性的肌膜(呈紅色熒光)。骨骼肌中以新生中心核肌纖維為主是DMD—個(gè)明顯的病理特征，分別在細(xì)胞移植(移植A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞)后各時(shí)間點(diǎn)取mck治療組和對(duì)照組(未移植脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞)的TA肌肉，統(tǒng)計(jì)中心核(CN)肌纖維比例(CN肌纖維比例《N肌纖維細(xì)胞數(shù)/總肌纖維數(shù))。每只鼠觀察6張片子，每張切片連續(xù)取6-10個(gè)非重疊視野，用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用"均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差"表示，p<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異)。結(jié)果表明這兩組的中心核比例在移植后2周沒有明顯差異，而在移植后4周和12周時(shí)，治療組的中心核比例要顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。圖5B顯示的是15只治療組(移植A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞)mdx小鼠的TA肌和15只對(duì)照mdx小鼠的TA肌的檢測(cè)結(jié)果，Treatedmdx表示治療組mdx，Controlmdx表示對(duì)照組mdx。另外高水平的血清肌酸激酶(creatinekinase,CK)值也是DMD的一個(gè)重要特點(diǎn)，按照常規(guī)方法檢測(cè)小鼠血清CK值。結(jié)果表明在脂肪間充質(zhì)千細(xì)胞移植后7天，治療組和對(duì)照組nidx小鼠的CK值都要顯著高于正常C57BL/6小鼠的，但在移植后12周時(shí)，治療組的CK值要明顯低于對(duì)照組(P〈0.05)。這表明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞植入后能發(fā)揮治療作用，有效改善DMD的特異病理指標(biāo)。圖5C顯示的是10只治療組(移植A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞)nKk小鼠和10只對(duì)照mdx小鼠的血清CK值的檢測(cè)結(jié)果，Treatedmdx表示治療組mdx，Controlmdx表示對(duì)照組mdx(圖5C中UI表示國際單位)。另外，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(A擴(kuò)增培養(yǎng)液中得到的第2代細(xì)胞)經(jīng)尾靜脈移植mdx小鼠后，除骨骼肌外，在膈肌和心肌中也檢測(cè)到了供體來源的肌肉細(xì)胞，這提示在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療全身性肌肉損傷疾病時(shí)，靜脈輸注可作為一種操作性更強(qiáng)，更為有效的移植手段。步驟二證明，步驟一中分離的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)成肌誘導(dǎo)，可誘導(dǎo)分化為骨骼肌細(xì)胞，相繼表達(dá)成肌調(diào)節(jié)因子家族中的基因，并表達(dá)骨骼肌細(xì)胞特異性表面分子肌球蛋白重鏈。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植后，可歸巢到損傷的肌肉組織中，參與受體受損肌纖維的重建，并分化為有功能的Pax7+肌肉衛(wèi)星細(xì)胞。在體外經(jīng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF誘導(dǎo)，步驟一中分離的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表面標(biāo)志分子和相關(guān)抗原，如vWF和CD31。移植后，步驟一中分離的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在受體內(nèi)可分化為vWF+血管內(nèi)皮細(xì)胞。步驟一中分離的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞植入疾病模型小鼠(mdx小鼠)后可部分恢復(fù)肌膜上抗肌萎縮蛋白(dystrophin)的表達(dá)，并減少骨骼肌中中心核肌纖維比例，降低血清肌酸激酵(CK)值。權(quán)利要求1、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)用培養(yǎng)基，包括動(dòng)物細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、表皮生長(zhǎng)因子和血小板衍生生長(zhǎng)因子；所述胎牛血清的終濃度為1-200mL/L，所述表皮生長(zhǎng)因子的終濃度為1-100ng/ml，所述血小板衍生生長(zhǎng)因子的終濃度為1-100ng/ml。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述動(dòng)物細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12、MCDB—201、DMEM、MEM、RPMI1640、DMEM、M199、BME禾卩IMEM中白勺任意一種或其任意組合。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述胎牛血清的終濃度為10-30mL/L;所述表皮生長(zhǎng)因子的終濃度為10-30ng/ml;所述血小板衍生生長(zhǎng)因子的終濃度為10-30ng/ml。4、根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述胎牛血清的終濃度為20ml/L，所述表皮生長(zhǎng)因子的終濃度為10ng/ml，所述血小板衍生生長(zhǎng)因子的終濃度為10ng/ml。5、一種分離培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，是消化人脂肪組織，收集細(xì)胞，將所收集的細(xì)胞接種在塑料培養(yǎng)容器中，加入權(quán)利要求1至4中任一所述的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，收集貼壁細(xì)胞；將所述貼壁細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中傳代2次或2次以上，得到人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所收集的細(xì)胞按4Xl()5個(gè)/ml—lX107個(gè)/ml培養(yǎng)基接種在塑料培養(yǎng)容器中。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞的接種密度是2X1()6個(gè)/ml培養(yǎng)基。8、根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，還包括將得到的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化的步驟。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在成肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化為肌肉細(xì)胞。10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明公開了一種分離培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法及其專用培養(yǎng)基。該人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)用培養(yǎng)基，包括動(dòng)物細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、表皮生長(zhǎng)因子和血小板衍生生長(zhǎng)因子；所述胎牛血清的終濃度為1-200mL/L，所述表皮生長(zhǎng)因子的終濃度為1-100ng/ml，所述血小板衍生生長(zhǎng)因子的終濃度為1-100ng/ml。本發(fā)明的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有CD31-、CD34-、CD45-和HLA-DR-，且CD29+、CD44+、CD105+和Flk-1+的表型。在體外經(jīng)誘導(dǎo)可表達(dá)骨骼肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性細(xì)胞表面標(biāo)志和相關(guān)抗原分子。在藥物導(dǎo)致的肌肉損傷模型小鼠體內(nèi)可分化為肌纖維、血管內(nèi)皮和有功能的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，并能部分恢復(fù)杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)模型小鼠(mdx)肌膜上抗肌萎縮蛋白的表達(dá)，緩解其病理癥狀。文檔編號(hào)C12N5/08GK101314766SQ200710099888公開日2008年12月3日申請(qǐng)日期2007年5月31日優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日發(fā)明者劉艷寧,趙春華,曦閆申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所