專利名稱：一種丹參二萜合酶基因及其編碼產物與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用cDNA芯片技術克隆二萜合酶基因及其編碼產物與應用，尤其涉及丹參 主要活性成分松香烷型二萜醌類化合物生物合成的二萜合酶基因及其編碼產物與應用，屬于 藥用植物基因工程領域。
背景技術：
藥用植物有效成分(次生代謝產物)的形成是植物次生代謝途徑中特有基因的產物。隨 著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨具特色又有廣闊應用前景的藥用植物次生代謝合成 相關功能基因的研究逐漸成為研究的熱點(魏小勇，方花，李杰芬.植物中藥功能基因研究. 中草藥，2005， 36 (8): 1251-1254)，這些基因的克隆將破解藥用植物有效成分的生物合成 途徑及其調控機制，為藥材品質的形成提供理論基礎，同時為利用生物技術提高目標成分含 量或直接生產有效成分或中間體帶來廣闊的應用空間。
二萜類化合物是植物中重要的次生代謝產物之一，在藥用植物中很多活性成分如紫杉醇、 丹參酮IIA、雷公藤甲、乙素等均為二萜類化合物。藥用植物丹參&/1^賄7"^7^/加8§￡.為一 味常用中藥，素有"一味丹參，功同四物"的美稱，具有活血化瘀，理氣止痛的功效，是眾 多復方、保健品的主要成分。丹參主要含有兩類活性成分脂溶性的二萜醌類化合物和水溶 性的酚酸類化合物。其中以丹參酮IIA (tanshinone IIA)為代表的活性成分為松香烷型 (abietane) 二祐化合物(Ikeshiro Y， Mase I, Tomita Y. Abietane type diterpenoids from Salvia miltiorrhiza. Phytochemistry 1989， 28:3139—3141)。其中二路合酶(diterpene synthase),又稱二 萜環(huán)化酶(diterpene cyclase)被認為是合成萜類次生代謝終產物的關鍵酶(committed step)
(Trapp SC, Croteau R.Genomic Organization of Plant Terpene Synthases and Molecular Evolutionary Implications. Genetics, 2001,158: 811-832)。 二砲合酶基因的功能為催化二砲的共 同前體櫳牛兒基櫳牛兒基二磷酸(GGPP)形成具有特定立體結構的柯巴基焦磷酸(Capalyl pyrophosphate, CDP)，進而形成結構多樣的二萜類化合物。形成松香烷型母核的二砲環(huán)化酶 已在冷杉、云杉等裸子植物中得到克隆和功能鑒定(Vogel BS, Wildung MR, Vogel G, Croteau R. Abietadiene Synthase from Grand Fir (Abies grandis). cDNA isolation, characterization, and bacterial expression of a bifunctional diterpene cyclase involved in resin acid biosynthesis.J Biol Chem, 1996; 271: 23262-23268),但由于萜類環(huán)化酶的催化功能和基因結構在裸子植物和被 子植物間存在顯著差異(Martin DM, Faldt J, Bohlmann J. Functional Characterization of Nine Nonyay Spruce TPS Genes and Evolution of Gymnosperm Terpene Synthases of the TPS-d Subfamily.Plant Physiology, 2004, 135: 1卯8- 1927),不能僅通過序列相似性比較而確定其生 化功能，常規(guī)的利用兼并引物克隆目的基因的策略也難以應用于該類基因的克隆。因此，丹 參二萜合酶基因是首次得到的被子植物松香垸型二萜合酶基因，為丹參酮類成分合成的關鍵 酶，但在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的丹參二萜合酶 基因及其氨基酸序列。
植物基因克隆的方法有很多種，如功能克隆、表型克隆、定位克隆等。近年來，國外研究者采用經(jīng)典的功能克隆法克隆到一些藥用植物的關鍵酶基因，如紫杉醇合酶。然而在事先 無目的蛋白或其相應基因定位的的情況下分離相關基因是相當困難的。因此，對于遺傳背景 不清，相關基因產物不明的情況下，表型克隆成為基因克隆的主要方法?；蛐酒夹g是20 世紀80年代發(fā)展起來的一項髙新技術，它可以對生物整個基因組的所有基因表達同時進行實 時監(jiān)測，作為一個全新的、強有力的技術平臺，已廣泛地應用于功能基因組的研究中，也成 為挖掘新基因的強有力手段。cDNA芯片巳在擬南芥、水稻、番茄、棉花等多個植物中得到了 應用，但在藥用植物功能基因研究中還沒有相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種丹參cDNA芯片的制作、雜交、差異基因分析以及功能基因克隆的方法。
本發(fā)明提供了一種與丹參二萜醌類化合物合成有關的基因SmCPS (5Wv/a M/Wo廳W加 Bge copalyl pyrophosphate synthase)，它是下歹U核苷酸序歹U之一 序列表中SEQ ID No. 1的DNA序列；
與序列表中SEQ ID No. 1限定的DNA序列具有一個或幾個堿基突變，且編碼相同功能 蛋白質的DNA序列。
一種由上述基因SmCPS編碼的蛋白質，具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或將序列 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代且具有序列2的氨基酸殘基序列相同 活性的由序列2衍生的蛋白質。
本發(fā)明SEQ ID No. 1的DNA序列由2601個堿基組成，編碼序列表中由793個氨基酸殘 基組成的蛋白質序列SEQ ID No. 2。
本發(fā)明克隆基因SmCPS經(jīng)茉莉酸甲酯誘導后，其表達量明顯增加，伴隨著丹參二萜醌類 化合物如丹參酮IIA及隱丹參酮的快速積累。
含有本發(fā)明基因SmCPS的表達載體及細胞系也在本發(fā)明的保護范圍之內。將SEQ ID No. 1 基因的cDNA克隆到原核表達載體pET30a的限制性內切酶Kpnl和EcoRV位點間，得到表 達載體，利用CaCl2等方法即會得到含有該表達載體的大腸桿菌菌株。利用氣相色譜-質譜聯(lián) 用技術，分析SmCPS基因的功能。研究結果表明，本發(fā)明與丹參二萜醌類化合物合成有關的 基因具有二蔽合酶基因的DXDD特征結構域，酶促反應分析發(fā)現(xiàn)該基因催化丹參二萜醌類化 合物的早期合成步驟，對于培育高品質的藥用植物品種特別是丹參具有重要的理論及實際意義。


圖1丹參CPS與其他植物CPS家族蛋白的分子進化樹
10種CPS (copalyl diphosphate synthase)蛋白的物種來源為番茄Sl(Solanum lycopersicum)、 黃瓜Cs (Cucumis sativus)、煙草Nt (Nicotiarm tabacum)、野甘草Sd (Scoparia dulcis)、 箅瓜Cm (Cucurbita maxima)、玉米Zm(Zea mays)、擬南芥At (Arabidopsis thaliana)、 琴葉巴豆Cs (Croton sublyratus)、水稻Os (Oryza sativa);松香二烯合酶AS (abietadiene synthase)來源與北美冷衫Ag (Abies grandis)。圖2 SraCPS實時熒光定量PCR結果
1—0d， 2-ld， 3—2d， 4—3d， 5-5d， 6-15d
圖3丹參受茉莉酸甲酯誘導后SmCPS表達量與丹參酮IIA含量相對變化曲線 圖4酶促反應產物的GC-MS分析 A-GGPP標準品，B-CDP標準品，C-酶促反應產物。
具體實施例方式
實施例l、丹參cDNA芯片的制作
1、 丹參總RNA的分離和檢測
取陜西商洛丹參(So/Wa M/Wwr/n'za Bge)根2g，在研缽中用液氮快速研磨成粉末，快 速轉移至65。C預熱的lOmL提取緩沖液中(CTAB(W/V)2%， Tris-HCl (pH8.0) lOOmmol.!/1, EDTA 25mmol-L-1， NaCl 2.0 mol'L—1 ， PVP40 2%,亞精胺0.5g/L，巰基乙醇2%)，充分振 蕩混勻；用等體積氯仿抽提兩次，7500g離心15分鐘。上清液加入l/4體積的10MLiCl，混 勻后放置4'C沉淀過夜；7500 g離心20分鐘，沉淀用500nL SSTE(SDS 0.5%, NaCl 1 mol'U1 ， Tris-HCl (pH8.0) lOmmoH;1 ， EDTA lmmol.!/1,在65。C溶解5分鐘。用等體積氯仿抽提， 13000 g離心5分鐘；上清液加入2倍體積無水乙醇，-70'C放置2h; 4'C 13000 g離心20分鐘， 沉淀室溫干燥10分鐘后溶于100pL DEPC處理的水中，用1.0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完 整性，用GenQuant核酸定量儀測定A260、 A280比值和濃度。置于-80'C冰箱備用。
2、 cDNA文庫的構建
采用mRNA純化試劑盒(QuichprepTM Micro mRNA Purification Kit, Pharmacia公司) 分離mRNA后，通過在cDNA分子兩端加上EcoR I /Not I接頭，在T4多核苷酸激酶的作 用下磷酸化，與表達載體入ZAP Express Predigested Vector (ZAP Express Predigested Vector Kit, stratagene公司)連接，#《后采用stratagene公司的ZAP Express Pridigested Gigapack Cloning Kits(EcoRI/CIAP-Treated)將包裝蛋白在體外包裝連接產物，感染E.coli XU-Blue MRF'構建 成cDNA文庫。
3、 cDNA芯片的制備 3.1 PCR擴增
挑取分離良好的噬菌斑溶于IO(VL SM緩沖液(Amresco公司)中混勻后作為PCR模板。 PCR擴增引物為人ZAP Express多克隆位點兩側的部分序列Ml3-20引物 5'-GTAAAACGACGGC CAGTG-3'， BK反向引物5'-GGAAACAGCTATGACCTTG-3'。 96 孔板PCR反應體系，準備如下混合物dNTP (25mmol'L-l)， 600pL; Mg2+ 600pL， 10X 緩沖液lOOO)uL; Taq (TakaraEx Taq, 5U^L")， 40pL; M13-20引物(12,5,ol.L-l )， 200pL; BK反向引物(12.5,1-L-l) 200pL;高純水補足至lOmL。混合均勻后，用排槍分裝至96 孔PCR板。然后各加入6pLDNA模板，混合均勻。在ABI9700型基因擴增儀上進行PCR反 應，反應條件為94'C預變性3分鐘，然后進行35個循環(huán)，為94°C 30s， 54°C 30s， 72°C 2 分鐘，循環(huán)結束后72'C后延伸5分鐘。取3pL反應產物在含EB的1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，在SYNGENE型凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照。
3.2 PCR產物純化
使用96孔Multiscreen filter plates (Millipore公司)純化板進行PCR產物的純化。將1.4.1 項下瓊脂糖凝膠檢測為單一條帶的PCR產物(lOO^L)轉入純化板中；將純化板放于Millipore 的真空裝置上，于15mmHg真空抽濾IO分鐘，直至抽千；加入10(HiL水，15mmHg真空抽 濾10分鐘，直至抽干；從真空抽濾裝置上取下PCR純化板，加入40^L (pH8.0左右)的水， 將純化板放至搖床上輕搖20-30分鐘重懸DNA;將純化產物吸出，置于酶標板上測定濃度和 純度；取lpL純化產物在1.5。/。的瓊脂糖凝膠上電泳檢測；將純化產物真空干燥。
3.3 cDNA芯片點制
根據(jù)上述測定的濃度差異加入適量50y。DMSO作為點樣液，調節(jié)濃度至約250ng^L-l后， 將樣品轉移至384孔板中準備芯片點制。點樣儀為GeneMachine公司OmniGrid 100。點樣參
數(shù)為針2X12， X: 8000 ， Y: 6000;點間距300mic訓;點陣13X14;點陣間距
500 microns;矩陣模式4X12。 實施例2:丹參二萜合酶基因的克隆
1、芯片雜交分析
丹參毛狀根為發(fā)根農桿菌15834直接感染的方式進行Ri-質粒轉化誘導的毛狀根。取生長 良好的丹參毛狀根(各0.1g)繼代培養(yǎng)于6， 7V固體培養(yǎng)基上，置于25'C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)， 分別于30天、45天、60天收獲復。將30天材料作為參照，分別與45天和60天的材料進行 雜交，重復兩次，每組均采用正反標記以消除染料的誤差。
采用間接標記法進行探針標記，包括雙鏈cDNA合成、T7介導的RNA體外轉錄合成 cRNA、隨機引物反轉錄、cDNA用KLENOW酶標記等步驟。
(1 )雙鏈cDNA合成取5g總RNA ， 以T7 — Oligo ( dT ) 15 ， (5'陽AAACGACGGCCAGTGAAT TGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTT TV-3'， V可以是G、 C和A,上海博亞生物技術有限公司)為引物，用cDNA Synthesis Kit (TaKaRa公司)合成雙鏈cDNA; 雙鏈合成以后用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen公 司)純化。
(2) 體外轉錄合成cRNA:用T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System (Promega公司)將雙鏈cDNA進行體外轉錄合成cRNA;然后用RNeasy試劑盒(Qiagen
公司)純化。
(3) 隨機引物反轉錄取2gcRNA,用SuperscriptII反轉錄酶，200 U'^iU1 (Invitrogen 公司)，9 Random Primer進行反轉錄，反轉錄產物用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen
公司)純化。
(4) cDNA用KLENOW酶標記取lg cRNA反轉錄產物，用隨機引物進行KLENOW 標記，標記產物用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen公司)純化，純化后抽干。標記過程 中dATP， dGTP， dTTP使用濃度為120 M， dCTP使用濃度為60M， Cy5-dCTP， Cy3-dCTP 使用濃度為40 M。
將不同樣品分別用cy3、 cy5(Amersham公司)進行標記，然后溶于30L雜交液中(3xSSC，0.2°/。SDS， 5xDenhart's, 25%甲酰胺)，于42'C雜交過夜。雜交結束后，先在42'C左右含0.2% SDS， 2xSSC的液體中洗5分鐘，而后在0.2xSSC中室溫洗5分鐘，玻片甩干后進行掃描。 將不同樣品分別用cy3、 cy5 (Amersham公司)進行標記，然后溶于30L雜交液中(3xSSC, 0.2%SDS， 5xDenhart，s, 25%甲酰胺)，于42。C雜交過夜。雜交結束后，先在42。C左右含0.2% SDS， 2xSSC的液體中洗5分鐘，而后在0.2xSSC中室溫洗5分鐘，玻片甩干后進行掃描。 芯片用LuxScan 10K/A雙通道激光掃描儀(CapitalBio公司)進行掃描。采用GenePix Pro 4.0 圖像分析軟件(Axon Instruments公司)對芯片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數(shù)字信號； 然后對芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進行歸一化；最后用Ttest方法結合兩倍差異的標準來確 定差異表達基因。
2、 差異基因的獲得和分析
將每組芯片兩次重復的共同差異基因進行5'單向測序，獲得的EST序列采用Windows 系統(tǒng)下的StadenPachage (gap4) (http:Vstaden.sourceforge.net)軟件進行序列前處理以及拼接 聚類。去掉載體、接頭以及低質量序列和較短的序列。使用BLASTX(6 December 2005: BLAST 2.2.13 released; http:〃www.ncbi.nih.gov /BLAST/)將處理后的EST序列在蛋白質水平上與 NCBI非冗余蛋白質數(shù)據(jù)庫(non-redundant protein database)進行同源性比較，結果克隆號為 chipl6g09的基因在60/30天雜交結果中表現(xiàn)為上調基因，BIASTX注釋為copalyl diphosphate synthase (CPS)基因，命名為SmCPS，該片段具有終止密碼子，為丹參CPS基因的3'末端。
3、 5 -RACE
采用SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech公司)試劑盒進行擴增SmCPS 的5'末端，按照說明書進行操作?？俁NA用Trizol (Invitrogene公司)試劑盒提取，步驟詳 見試劑盒操作手冊。根據(jù)上述CPS基因基因設計特異引物為GSP1: 5、-GCA TCCTCA TAAGCCTCATTCCC-3、，進行cDNA5'末端的擴增。PCR條件為94°C5min， 94°C30s， 68°C 30s， 72°C3min (35個循環(huán))，72°C7min。擴增出約1500bp的DNA片段，瓊脂糖凝膠回收試 劑盒(Takara)回收目的片段，按pMD19T載體(Takara)試劑盒操作手冊將上述片段克隆至 pMD19-T載體中，鑒定陽性克隆并測序(北京三博遠志生物有限公司)。
通過cDNA雜交所得EST序列和5'-RACE獲得的部分片段測序結果可得到序列表SEQ ID NO: 1所示的丹參CPS基因全長cDNA序列，其所推導的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示。
4、 全長cDNA的克隆和測序
根據(jù)5'-RACE的結果和已知部分的序列，采用5、和3'末端引物直接擴增5'-RACE所逆 轉錄的5'-RACE-Ready cDNA，使用LATaq (Takara)進行LA-PCR方法擴增CPS全長序列。 引 物 CPS-F : 5、陽GGGCAAGCAGTGTATCAACGC-3' ; CPS-R : 5'-TTCCCGTGGCGACACAAACAA-3、。擴增出約2500bp片段，瓊脂糖凝膠回收試劑盒 (Takara)回收目的片段，按上述方法克隆至pMD19-T載體中(Takara)，鑒定陽性克隆并進 行雙向測序(北京三博遠志生物有限公司)。 實施例3、 SmCPS基因的生物信息學分析本發(fā)明涉及的丹參二萜合酶基因全長cDNA的長度為2601bp，詳細序列見序列表中的序 列1，其中開放讀碼框位于106~2487bp。將丹參全長cDNA序列用BLAST程序在 Non-redundant GenBank十EMBL+DDBJ+PDB禾口 Non-redundant GenBank CDS translation +PDB+Swissprot+ Superdate +PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸同源性檢索，結果核苷酸水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn) 同源性序列，可見利用常規(guī)的兼并引物克隆該基因難度很大。該基因在氨基酸水平上與野甘 草Scopa〃'a血/ds中的柯巴基焦磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase)基因有48%的同源性， 且在370-373位置上具有二砲合酶基因的結構域DXDD。蛋白質進化樹分析表明，丹參CPS 基因與琴葉巴豆(CratoA7 suib/yrafus)、野甘草(5"c印an'a t/Ww's)等親緣關系較近，而與 單子葉植物水稻、玉米等較遠，與裸子植物的香垸型二萜合酶如北美冷杉的松香二烯合酶親 緣關系最遠(圖1)，表明所克隆到的丹參CPS基因為一個新基因。利用密碼子分析軟件 (http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov)對SmCPS基因的密碼子使用頻率進行分析，并依據(jù)該基因的 密碼子使用表改變部分堿基。利用生物信息學軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/Virtual Ribosome/)和BLAST程序對突變后的基因序列進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列保持不變， 其仍具有DXDD結構域。
實施例4、茉莉酸甲酯處理后SmCPS基因表達與丹參酮IIA含量的分析
利用茉莉酸甲酯(lOOmM)處理丹參毛狀根，收集不同時間點的材料用于丹參CPS基因 表達量和隱丹參酮的含量。CPS基因表達量采用熒光實時定量PCR?？俁NA用Trizol (Invitrogene公司)試劑盒提取，步驟詳見試劑盒操作手冊。取lpg RNA模板按RT試劑盒 (Takara公司)說明書反轉錄得到cDNA。 Real-time定量PCR采用ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA)禾口 SYBGREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK)試劑盒，以丹參actin基因(GenBank登錄號DQ243702)(引物序列 actin-222: 5，-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT _3，， actin-488: 5，-AGGAACCACCGATCCAGACA -3，) 作 為對照，確證不同時間都符合要求而且cDNA的量都相差不多。CPS基因引物為SmCPS F 5' GATCGGAAGACGCTGTA， 3'SmCPS R 5' TCGCCAAGAAATAGGAAA3，。按94 °C for 5 min ， (94°C for 30 sec, 55。C for 30 sec and 72。C for 1 min) 40 cycles, 72°C 7 min的PCR條件 進行擴增。結果表明經(jīng)過MJ處理后，SmCPS基因表達水平于24h內迅速升高，之后逐漸 降低到對照組水平(圖2)。經(jīng)actin內參基因均一化之后，與對照組比較，處理后24h， MJ 處理組是同時期對照組的5.8倍(圖3)，說明丹參毛狀根經(jīng)茉莉酸甲酯處理后，SmCPS基因 表達水平內迅速升高，從而有利于其編碼的蛋白CPS催化GGPP的環(huán)化，推動代謝流向目的 產物丹參酮類成分流動。
采用HPLC測定隱丹參酮含量，色譜條件為Waters 2695高效液相色譜儀,Waters 2996 二極管陣列檢測器，Millennium 32工作站,色譜甲醇(天津)；水為三重蒸餾水，氯仿(分析純)， 無水乙醇(分析純)，隱丹參酮(購自北京市藥品檢定所)。RP-WatersC18(150mmX3.9mm,5 "m)柱,檢測波長270nm;柱溫30°C，其流動相條件為.-流速1.0mL.min—1，流動相為0.5% 醋酸甲醇(A)禾Q 0.5 。/。醋酸水(B)線性梯度洗脫0~25min， 30% 60%A; 25 30min， 60 % 65%A; 30 50min， 65% 70%A; 50 60min， 70% 80%A; 60~61min， 80% 30%A。 在該色譜條件下對丹參毛狀根丹參酮IIA進行含量測定。結果顯示經(jīng)過MJ處理后5d，丹參酮類成分含量迅速上升，處理后第5d，丹參酮IIA成分是對照組的1.3倍,處理后第10d， 丹參酮IIA成分含量是對照組的6.3倍；處理后第15d，丹參酮IIA成分含量是對照組的6.9
倍(圖3)。結果表明丹參毛狀根經(jīng)茉莉酸甲酯處理后，丹參CPS基因表達量能被顯著的誘
導表達，且伴隨丹參酮IIA、隱丹參酮成分的迅速積累?？芍玫降牡PS基因為丹參 酮類成分生物合成途徑的關鍵酶基因。 實施例5、 SmCPS基因原核表達分析
1、 大腸桿菌表達載體的構建
依據(jù)丹參二砲合酶的全長cDNA序列(表l)，設計擴增完整開放閱讀框的引物，分別在 正、反向引物上分別引入限制性酶切位點KpnI和EcoRV。以全長cDNA片段為模板，經(jīng)PCR 擴增后，保證丹參二萜合酶基因的閱讀框完全正確，并用KpnI和EcoRV內切酶進行酶切反 應，回收目的片段2533bp;大腸桿菌表達載體pET30a用Kpnl和EcoRV內切酶進行酶切反 應，回收目的片段5kb。將經(jīng)酶切的丹參二萜合酶基因的目的片段克隆至酶切過的pET30a表 達載體上，轉化大腸桿菌BL21,進行重組子的PCR鑒定和酶切鑒定。
2、 蛋白表達的誘導
挑取蛋白接種于2mL的LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素)中，于37'C振蕩培養(yǎng)過夜。次曰 按l: 100稀釋加入到50mLLB液體培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD6oo為0.3-0.5，加入IPTG 至終濃度0.5mM，誘導目標蛋白表達，繼續(xù)于37'C搖床培養(yǎng)3-4小時。當細菌培養(yǎng)至OD600 為1.0時，10000rpm離心5分鐘，棄上清，收集菌體。
3、 丹參二萜合酶活性的分析
取上述菌體加入溶菌酶至終濃度為100|ag/mL，然后加入1/10體積的Triton-lOO， 30'C培 養(yǎng)15分鐘，冰浴條件下用超聲波處理，12000rpm， 4'C離心15分鐘，上清液備用。取lml 上清液，加入0.25nmol的GGPP， 55。C條件下反應2小時。用乙酸乙酯提取反應混合物，然 后用GC-MS進行酶活分析，檢測CDP是否存在，同時以未加入上清液的GGPP作為對照。 結果表明，在酶溶液和GGPP存在的情況下，可以檢測到CDP的存在(圖4)。
4、 丹參二萜合酶衍生物的活性分析
分別將SEQIDNo.l序列171bp處的G突變?yōu)镃、 1043bp處C突變?yōu)镚、 1992bp處T 突變?yōu)锳，得到各自衍生序列SEQIDNo.3、 SEQIDNo.5、 SEQIDNo.7。其編碼氨基酸序列 分別為SEQIDNo.4、 SEQIDNo.6、 SEQIDNo.8，經(jīng)GC-MS進行酶活分析，發(fā)現(xiàn)均具備與 SEQIDNo.2相同的生物學功能。序列表
〈110〉中國中醫(yī)科學院中藥研究所
〈120〉 一種丹參二萜合酶基因及其編碼產物與應用
〈160〉 8
〈170〉 Patentln version 3.4
〈210〉 1
〈211〉 2601
〈212〉 DMA
〈213〉 丹參(Salvia Miltiorrhiza Bge.)
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (106).. (2487)
〈400〉 1
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tc咖gg郷agcgccacacacttatcccgtcgacgtgtttggaaggctc1080
tgggcg3tcgaccggctgcagcgcctcgg3atttcccgcttttttgagccgg卿ttgct1140
gattgcttaagccacatccaC肌3ttttggacggataagggagttttcagtgggag卿a1200
tcggagttttgcgacattgacgatacatccatgggaatgaggcttatgaggatgcatggEi1260
tstgeLtgttggctg鄉(xiāng)aatttcagLgcetg3犯ga^tggtaBattctcttgci320
tacggcgggcgtcgccttctccgatatac3atctttacagagcttctcag1380
ctccgatttcccggcgaggaaatcctcgaagatgcga卿gattcgcctacgatttcttg1440
tcagattctggat咖tgggttatttctaagcacttgcct1500
g已tg鄧atc3agctcgggct卿gatgccgtggctcgccaccctaccccgcgtcgaggcg1560
tcc3gtact3cgccggctccggCg3Cgtgtgg已tcgg咖gacgctgtac1620
3鵬tgccggcgacacgtaccacgacctagcca3gacggatttcaagaga1680
tgccaagcg3agcatcagttcgagtggctct3C已tgC犯g犯tggtacgagagctgcggc1740
tcgggat犯gcagaa已ggaccttctgctttcctatttcttggcgaccgcg1800
agcatcttcg3gCtCg卿ggaccaacgagcgaatcgcgtgggcc犯atcgcsgatcatc1860
gctaagatgatcacttctttcttcaacasggaaactacgtcggaggaggacaa.gcgagct1920cttttgaacg agctcggaaa cattaatggc ggtggggccg gtagcattgc gctagcgacc tacaxxagac acc3gctg朋aaatgcttgg gaagcagacg acgcggagct cctaaccaac ttcagggaag aaatactggc gcacaacgag atctgtcgac agctttcttt cattcaaagc gcagcgaaat cgagcataaa aaacaaggaa ttggtgcttg agaaatatgg gggcat卿t gcgaagactt attattacag agcgtatcat aaagtgcttt tcgagccagt cgcgtgaata gtcgccacgg gaaaatctct agaggatctg ataaattttt agattttcta g 〈210〉 2 〈211〉 793 〈212〉 PRT 〈213〉丹參 <400> 2 Met Ala Ser 1
Arg Arg lie
ctcaacgaca ctcactcagt agcgtatggc
3Cgttg犯C3
tacaaagctc ga腿gg卿 ctcgaagaag agaaatataa gccgccgsca ttttgtttaa
tgtgt3t3g3
caaacggcgc tcctcgaggg tgacgcagct tctgcgccgg tctccaacct tgggagt卿 acatgcaaat agaaagcgtt ccatagacac ataagtatat gctcgttcag
aggg卿gaa attcgacaga gcaacatggc ccacatcgcc 33cca_gca_aa gggcg卿tc gttggtgaag tttagcagtt acacatgttt agttgtttgt
(Salvia Miltiorrhiza Bge.)
Ala Thr Ser 35
Tyr Gin Leu 50
Gin Val His 65
Val Lys Asn
Thr Thr Gly
Val Ala Met 115
Ser Ser Leu 130
Gly Asp Gin 145
Ala Cys Val
Lys Arg Gly
Gly Asn Glu 195
Leu Leu Gin
210 Ser Pro Ala
Leu
Thr 20
Ala
Ser 5
Pro
Ser Thr lie Leu
Ala Ser Ala
Trp Met Gly
Asn His Lys
Asp His
lie
Asp 100 lie
Glu
Glu
85
Gly
Lys
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Lys
55
Gly
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Lys 25 Ser
Ser
10
Leu
Arg
Ser Arg Ser Lys Asn
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Ser Val Ala
Thr Thr Val
Pro lie Glu
Arg lie Ser Asp
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Val
Val 180 Glu
Ala 165 Thr
lie
Phe 150 Leu
Val
Val 135 Cys
Glu 120 Gin
Val
Val 105 Gly
Asn
Tyr
Arg Ser Trp
Tyr
90
Ser
Arg
Gin
Asp
Tyr lie Lys
His Met Thr
Lys Ala Lys
Val Gin Glu
Ser 215 Val
Cys 200 Leu
Glu 185 Gly
Asn 170 Asn
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75
lie
Pro
Asp
Leu
Arg 155 Val
Thr
60
Gin
Arg
Tyr
Gly
Glu 140 Leu
His Asp Phe Glu Val
Val
Gly lie Glu
Tyr His Val Arg 11
Asp 220 Glu
Pro
Pro
Leu
45
Val
Gly
Thr
Asp
Pro 125 Asp
Val
Ala
Lys
Val 205 Leu
Gin
Ala
Glu 30
Ser
Asp
His
Leu
Thr 110 Gin
Gly
Asn
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Leu 190 Phe
Pro
Lys
Ala
15
Cys
Leu
Ala
Asp
L>eu
95
Ala
Phe
Ser
Thr
Lys 175 Met
Pro
Tyr
Leu
Arg
Phe
Ser
Pro
Ala
80
Arg
Trp
Pro
Trp
lie 160
Val
Glu Ala Asp Lys
1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2601225 Arg
Ser
Gin
Ala
Thr 305 Val
Ser
Lys
Cys
Gly 385 Gly
lie
lie
Leu
Pro 465 Pro
Asp
Asp
Lys
Gly 545 Phe
lie
Phe
lie
Leu
Ser
Phe 290 lie
Phe
Arg
Phe
Asp 370 Tyr
Lys
Tyr
Leu
Ala 450 Asp
Arg
Val
Thr
His 530 lie
Leu
Ala
Asn
Pro
Glu
Ala 275 Met
Asp
Gly
Phe
Trp 355 lie
Asp
Phe
Asn
Glu 435 Asn
Glu
Val
Trp
Tyr 515 Gin
Glu
Ala
Trp
Lys
Leu
Gly 260 Asp
Gin
Thr
/\rg
Phe 340 Thr
Asp
Val
Ser
Leu 420 Asp
Asn
lie
Glu
lie 500 His
Phe
Glu
Thr
Ala 580 Glu
Glu 245 Leu
Gly
Thr
Phe
Leu 325 Glu
Asp
Asp
Asp
Cys 405 Tyr
Ala
Gin
Lys
Ala 485 Gly
Asp
Glu
Phe
Ala 565 Lys
Thr
230 lie
Glu
Ser
Lys
Asn 310 Trp
Pro
Lys
Thr
Pro 390 Tyr
Arg
Lys
lie
Leu 470 Lys
Lys
Leu
Trp
Gly 550 Ser
Ser
Thr
Met
Asn
Phe
Asp 295 Gly
Ala
Glu
Gly
Ser 375 Asn
Gly
Ala
Arg
Leu 455 Gly
Tyr
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Ala
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lie
Gin
Ser
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Leu
Leu 280 Glu
Gly
lie
lie
Val 360 Met
Val
Gly
Ser
Phe 440 Asp
Leu
Tyr
Leu
Lys 520 Tyr
Ser
Phe
lie
Glu
Lys
Asp 265 Thr
Lys
Ala
Asp
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Gly
Leu
Gin
Gin 425 Ala
Lys
Glu
lie
Tyr 505 Thr
Met
Arg
Glu
lie 585 Glu
lie 250 Trp
Ser
Cys
Pro
Arg 330 Asp
Ser
Met
Arg
Met 410 Leu
Tyr
Trp
Met
Gin 490 Arg
Asp
Gin
Lys
Leu 570 Ala
Asp
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Asp
Pro
Tyr
His 315 Leu
Cys
Gly
Arg
Asn 395 lie
Arg
Asp
Val
Pro 475 Tyr
Met
Phe
Glu
Asp 555 Glu
Lys
Lys
Thr
Lys
Ser
Gin 300 Thr
Gin
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Arg
Leu 380 Phe
Glu
Phe
Phe
lie 460 Trp
Tyr
Pro
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Trp 540 Leu
Arg
Met
Arg
Ser
Leu
Ser 285 Phe
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Arg
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Glu 365 Met
Lys
Ser
Pro
Leu 445 Ser
Leu
Ala
Glu
Arg 525 Tyr
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lie
Ala
Leu
Leu 270 Thr
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Pro
Leu
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Gin
Pro
Gly 430 Lys
Lys
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Gly
lie 510 Cys
Glu
Leu
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Thr 590 Leu
Leu 255 Lys
Ala
Lys
Val
Gly 335 lie
Glu
Met
Lys
Ser 415 Glu
Glu
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Thr
Ser 495 Ser
Gin
Ser
Ser
Glu 575
Ser
Leu
240 Phe
Leu
Phe
Asn
Asp 320 lie
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Phe
His
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Glu
Lys
Leu
Leu 480 Gly
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Ala
Cys
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Phe
Asn595 600 Glu Leu Gly Asn lie Asn Gly Leu Asn Asp Thr
610 615 Glu Gly Gly Ala Gly Ser lie Ala Leu Ala Thr 625 630 635
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645 650 Val Trp Leu Thr Gin Leu Gin His Gly Glu Ala
660 665 Leu Thr Asn Thr Leu Asn lie Cys Ala Gly His
675 680 Glu lie Leu Ala His Asn Glu Tyr Lys Ala Leu
690 695 Lys lie Cys Arg Gin Leu Ser Phe lie Gin Ser 705 710 715
Val Glu Gly Glu lie Ala Ala Lys Ser Ser lie
725 730 Glu Glu Asp Met Gin Met Leu Val Lys Uu Val
740 745 Gly lie Asp Arg Asn lie Lys Lys Ala Phe Leu
755 760 Tyr Tyr Tyr Arg Ala Tyr His Ala Ala Asp Thr
770 775 Phe Lys Val Leu Phe Glu Pro Val Ala 785 790 <210〉 3 <211> 2601 <212〉 DNA
<213〉 丹參(Salvia Miltiorrhiza Bge.) <220>
<221〉 CDS <222> (106)..(2487) <400> 3
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catactttaei tttctttcca catctccact caaagggaaa tctacaatcc tcagccgctc tccggcggcc cgccgcagaa cttcaccggc cggaatgttt cgccaccagt gcatggatgg tctctcagct accaacttaa tcacaagaaa atatcagttg gtgcatgacc acgacggcac taccgttcat caaggccatg gatcccattg aatacatcEig gacgttgttg aggacgacgg tcgccgtacg acacggcgtg ggtggcgatg atcaaggacg cagttcccct ccagcctcga gtggatcgtg cagaatcaac gatcagaagc ttttctgcgt ctacgatcgc ctcgtcaata ttg卿tcgt ggaatgttca tgctcacaag gtcaaa卿g aatgtggata aacttatgga gggaaatgag gagcacatga tttccggcgc ttctacaaaa agcgaaaagc ttaggcatcg
13
605
Asn Gly Ala Gly Arg 620
Leu Thr Gin Phe Leu 640
Lys Asn Ala Trp Ser 655
Asp Asp Ala Glu Leu 670
lie Ala Phe Arg Glu 685
Ser Asn Leu Thr Ser 700
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Lys Asn Lys Glu Leu 735
Leu Glu Lys Tyr Gly 750
Ala Val Ala Lys Thr 765
lie Asp Thr His Met 780
C33gC33C3C
tttgaatggc ttacgccggc gcagcagcag ccacagtaga
atgCggtgElEl
gggacgggag tggaggggcg tcgaggatgg ccatcgcgtg gagtgacgta cttgtgggtt aagatcttcc
taaattttct60
ctccttatcc120
ctcggctaag180
240
tgcgccgcag300
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犯taagcgtg420
ggacggcccc■
atcgtggggc540
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catcaaggaa660
cgaagtggtg720
ttacgattct780ccggcggtgc attatgcaca tggg3csaac accgccttcg at已gacactt tgggcgatcg gattgcttaa tcggagtttt tatgatgttg t已cggcgggc ctccgatttc
aggstgccgg tgcc犯gcga atcgaggaat agcatcttcg gcta恥atga cttttgaacg ggtggggccg
t3C6lCC3gaC
ttc郷gaag atctgtcgac
ttggtgcttg gcga^gactt aaagtgcttt gtcgccacgg ata犯ttttt <210〉 4 <211〉 793 <212〉 PRT
<213〉 丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.) <400〉 4
Met Ala Ser Leu Ser Ser Thr lie Leu 1 5 Arg Arg lie Thr Pro Ala Ser
agg鄉(xiāng)tttatcatgtcagggaacasa^Lgttgaaaaggattccactggag840
aaat3ccgactttagtttgg犯gggctcga900
ttttgaaactgcagtcagccgacggttccttcctcacctctccctcctcc960
cgttcatgcaaaccaaggatg^aa已tgctacc^ttcatC33g￡i3C￡LCg1020
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accggctgcagcgcctcggaatttcccgcttttttgagccgg卿ttgct1140
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tcgagccagtcgcgtgaatattttgtttaaagttgtttgt2520
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3gattttXt8g2601
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lie
Ser
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Ala
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Asn His
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55 Asp Gly 70
Ala Lys 25 Ser Ser 40
lie Ser
Ser
10
Leu
Ser
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Val Ala
Thr Thr Val
His 75
Ser
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Thr
60
Gin
Pro Ala Ala 15
Pro Glu Cys 30
Leu Ser Leu 45
Val Asp Ala Gly His Asp
Arg
Phe
Ser
Pro
Ala 80Val Lys
Thr Thr
Val Ala
Ser Ser 130 Gly Asp 145
Ala Cys
Lys Arg
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Leu Leu 210 Ser Pro 225
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Ser Leu
Gin Ser
Ala Phe 290 Thr lie 305
Val Phe
Ser Arg
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Gly Lys lie Tyr lie Leu
Asn
Gly
Met 115 Leu
Gin
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Gly
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Ala
Pro
Glu
Ala 275 Met
Asp
Gly
Phe
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Asp
Phe
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lie
Asp 100 lie
Glu
Lys
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Val 180 Glu
Lys
Val
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Arg
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Glu
85
Gly
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Ala 165 Thr
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Ala
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Asp
Asp
Asp
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Ala
Asp
Arg
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Lys
Glu 230 lie
Glu
Ser
Lys
Asn 310 Trp
Pro
Lys
Thr
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Arg
Lys
Pro
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Val 135 Cys
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Phe
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Ala
Glu
Gly
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Ala
Arg
lie
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Gin
Val
Ser
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Tyr
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Leu
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lie
lie
Val 360 Met
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Gly
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90
Ser
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Gin
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Phe
lie
Val
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Ser
Cys
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Arg 330 Asp
Ser
Met
Arg
Met 410 Leu
Tyr
lie
Pro
Asp
Leu
Arg 155 Val
Val
Glu
Glu
Arg 235 Pro
Asp
Pro
Tyr
His 315 Leu
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Gly
Arg
Asn 395 lie
Arg
Asp
Arg
Tyr
Gly
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Asp
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Lys
Ser
Gin 300 Thr
Gin
Leu
Arg
Leu 380 Phe
Glu
Phe
Phe
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Asp
Pro 125 Asp
Val
Ala
Lys
Val 205 Leu
Leu
Thr 110 Gin
Gly
Asn
His
Leu 190 Phe
Pro
Leu
95
Ala
Phe
Ser
Thr
Lys 175 Met
Pro
Tyr
Arg
Trp
Pro
Trp
lie 160 Val
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Ser Leu Leu Phe 255
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Tyr
Arg
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His 350 Ser
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Gin
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Met
Lys
Ser 415 Glu
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Asp 320 lie
His
Phe
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Glu
Lys<formula>formula see original document page 16</formula>〈212〉 DNA
〈213> 丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.) 〈220>
〈221〉 CDS
〈222〉 (106). (2487)
〈400〉 5
gggcaagcag tgtatcaacg cagagtacgc gggggacaag caagcaacac taaat.tttct 60
catactttaa tttctttcca catctccact caaagggaaa tttgaatggc ctccttatcc 120
tctacaatcc tcagccgctc tccggcggcc cgccgcagaa ttacgccggc gtcggctaag 180
cttcaccggc cggaatgttt cgccaccagt gcatggatgg gcagcagcag taaaaacctt 240
tctctcagct accaacttaa tcacaagaaa atatcagttg ccacagtaga tgcgccgcag 300
gtgcatgacc acgacggcac taccgttcat ca鄉(xiāng)ccatg atgcggtgaa gaatattgag 360
gatcccattg aatacatcag gacgttgttg aggacgacgg gggacgggag aataagcgtg 420
tcgccgtacg acacggcgtg ggtggcgatg atcaaggacg tggaggggcg ggacggcccc ■
cagttcccct ccagcctcga gtggatcgtg cagaatcaac tcgaggatgg atcgtggggc 540
gatcagaagc ttttctgcgt ctacgatcgc ctcgtcaata ccatcgcgtg cgtggtagcc 600
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accgccttcg cgttcatgca aaccaaggat gaaaaatgct accaattcat caagaacacg 1020
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gaagc卿cg acgcggagct cctaaccaac acgttgaaca tctgcgccgg ccacatcgcc 2160
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ttggtgcttg agaaatatgg gggcat卿t卿aatataa卿aagcgtt tttagcagtt 2400gcgaagactt attattacag agcgtatcat gccgccgaca ccatagacac acacatgttt 2460 aaagtgcttt tcgagccagt cgcgtgaata ttttgtttaa ataagtatat agttgtttgt 2520 gtcgccacgg gaaaatctct agaggatctg tgtgtataga gctcgttcag cagaaataaa 2580 ataaattttt agattttcta g 2601 〈210〉 6 〈211〉 793 〈212> PRT
<213〉 丹參(Salvia miltiorrhiza Bge. 〈400〉 6
Met Ala Ser Leu Ser Ser Thr lie Leu 1 5 Arg Arg lie Thr Pro
Ala Thr Ser 35
Tyr Gin Leu 50
Gin Val His 65
Val Lys Asn
Thr Thr Gly
Val Ala Met 115
Ser Ser Leu 130
Gly Asp Gin 145
Ala Cys Val
Lys Arg Gly
Gly Asn Glu 195
Leu Leu Gin
210 Ser Pro Ala 225
Arg lie Pro
Ser Leu Glu
Gin Ser Ala 275
Ala Phe Met
Thr 20 Ala
Asn
Asp
lie
Asp 100 lie
Glu
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Val 180 Glu
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Glu
85
Gly
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Phe 150 Leu
Tyr
Met
Lys
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Glu
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Ser
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Lys
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Gly
Pro
lie
Val
Val 135 Cys
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lie
Thr
Ser 215 Val
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Asp
Ala Lys
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Thr Thr
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Lys Glu 185 Cys Gly 200
Leu Gly
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Ser
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Glu Val
Glu Asp 220 Arg Glu 235
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Pro
Pro
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45
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Gly
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Ala
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Val 205 Leu
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Ser 285 Phe
Ala
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Gly
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Leu
Leu 270 Thr
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Ala
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Ala
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Ala
Phe
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Lys 175
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Pro
Tyr
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Leu 255 Lys
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Lys
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Phe
Ser
Pro
Ala
80
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Trp
Pro
Trp
lie 160
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Glu
Ala
Asp
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Phe
Leu Phe Asn290 Thr lie 305
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Ser Arg
Lys Phe
Cys Asp 370 Gly Tyr 385
Gly Lys
lie Tyr
lie Leu
Leu Ala 450 Pro Asp 465
Pro Arg
Asp Vfil
Asp Thr
Lys His 530 Gly lie 545
Phe Leu
lie Ala
Phe Asn
Glu Leu 610 Glu Gly 625
Glu Gly
Asp
Gly
Phe
Trp 355 lie
Asp
Phe
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Glu 435 Asn
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Val
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Tyr 515 Gin
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Ala
Trp
Lys 595 Gly
Gly Phe Val Trp Leu
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Phe 340 Thr
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Glu
lie 500 His
Phe
Glu
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Ala 580 Glu
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Ala
Asp
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Phe
Leu 325 Glu
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Asp
Asp
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Ala
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Phe
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Arg
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Leu 470 Lys
Lys
Leu
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Ser
Thr
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Leu
295 Gly
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Gly
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lie
Gin
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Gly 615 lie
Thr
Gin
Gly
lie
lie
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Met
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Gly
Ser
Phe 440 Asp
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Tyr
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Lys 520 Tyr
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lie
Glu 600 Leu
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Asp
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Gly
Leu
Gin
Gin 425 Ala
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Tyr 505 Thr
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Glu
lie 585 Glu
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Leu
His
Gly
Pro
Arg 330 Asp
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Arg
Met 410 Leu
Tyr
Trp
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Gin 490 Arg
Asp
Gin
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Leu 570
Ala
Asp
Asp
Ala
Gin 650 Glu
His 315 Leu
Cys
Gly
Arg
Asn 395 lie
Arg
Asp
Val
Pro 475 Tyr
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Phe
Glu
Asp 555 Glu
Lys
Lys
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Thr 635 Leu
Ala
300 Thr
Gin
Leu
Arg
Leu 380 Phe
Glu
Phe
Phe
lie 460 Trp
Tyr
Pro
Lys
Trp 540 Leu
Arg
Met
Arg
Asn 620 Leu
Lys
Asp
Tyr Pro Val Asp 320
Arg Leu Gly lie 335
Ser His lie His 350
Glu Ser Glu Phe 365
Met Arg Met His
Lys
Ser
Pro
Leu 445
Ser
Leu
Ala
Glu
Arg 525 Tyr
Leu
Thr
lie
Ala 605 Gly
Thr
Asn
Asp
Gin
Pro
Gly 430 Lys
Lys
Ala
Gly
lie 510 Cys
Glu
Leu
Asn
Thr 590 Leu
Ala
Gin
Ala
Ala
Lys
Ser 415 Glu
Glu
His
Thr
Ser 495 Ser
Gin
Ser
Ser
Glu 575
Ser
Leu
Gly
Phe
Trp 655 Glu
Asp 400 Pro
Glu
Lys
Leu
Leu 480 Gly
Asn
Ala
Cys
Tyr 560 Arg
Phe
Asn
Arg
Leu 640
Ser
Leu660 665 670
Leu Thr Asn Thr Leu Asn lie Cys Ala Gly His lie Ala Phe Arg Glu
675 680 685
Glu lie Leu Ala His Asn Glu Tyr Lys Ala Uu Ser Asn Leu Thr Ser
690 695 700
Lys lie Cys Arg Gin Leu Ser Phe lie Gin Ser Glu Lys Glu Met Gly 705 710 715 720
Val Glu Gly Glu lie Ala Ala Lys Ser Ser lie Lys Asn Lys Glu Leu
725 730 735
Glu Glu Asp Met Gin Met Leu Val Lys Leu Val Leu Glu Lys Tyr Gly
740 745 750
Gly lie Asp Arg Asn lie Lys Lys Ala Phe Leu Ala Val Ala Lys Thr
755 760 765
Tyr Tyr Tyr Arg Ala Tyr His Ala Ala Asp Thr lie Asp Thr His Met
770 775 780
Phe Lys Val Leu Phe Glu Pro Val Ala 785 790
〈210〉 7
〈211〉 2601
<212〉 DNA
<213> 丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.) 〈220〉
〈221〉 CDS
<222> (106), . (2487)
<400〉 7
gggcaagcagtgtatcaacgceigagtacgcggggg織agc^gcaaca^ct3幼ttttCt60
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<213> 丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.) 〈400〉 8
Leu Ser Ser Thr lie
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gatgcatgga attctcttgc agcttctcag cgatttcttg gcacttgcct cgtcgaggcg gacgctgtac tttcaagaga gsigctgcggc ggcgeiccgcg gcagatcatc caagcgagct agggag卿a attcgacaga gcaacatggc ccacatcgcc 朋cca.gcaaa gggcg卿tc gttggtgaag ttta.gcagtt 3cacatgttt agttgtttgt C3ga朋tEi肌
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Arg Arg
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Ser
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Ser
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Ala
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Pro
Ala Ser Ala
Trp Met Gly
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His Asp His
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Thr Thr Gly
Val Ala
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Met 115 Leu
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Glu
Glu
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55
Gly
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Leu
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Leu His Ser Lys
Ser Val Ala
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Pro lie Glu
Arg lie Ser Asp
Val
Lys Trp lie Val
Glu 120 Gin
Val 105 Gly
Val His
75 Tyr lie 90
Ser Pro Arg Asp
Asn Gin Leu
Ser Pro
Arg Pro
Asn Leu
45 Thr Val 60
Gin Gly
Arg Thr
Tyr Asp
Gly Pro 125 Glu Asp
Ala Ala Arg 15
Glu Cys Phe 30
Ser Leu Ser
Asp Ala Pro
His Asp Ala 80
Leu Leu Arg 95
Thr Ala Trp 110
Gin Phe Pro Gly Ser Trp
1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 I860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2601130 Gly Asp 145
Ala Cys
Lys Arg
Gly Asn
Leu Leu 210 Ser Pro 225
Arg lie
Ser Leu
Gin Ser
Ala Phe 290 Thr lie 305
Val Phe
Ser Arg
Lys Phe
Cys Asp 370 Gly Tyr 385
Gly Lys
lie Tyr
lie Leu
Leu Ala 450 Pro Asp 465
Pro Arg
Gin
Val
Gly
Glu 195 Gin
Ala
Pro
Glu
Ala 275
Met
Asp
Gly
Phe
Trp 355 lie
Asp
Phe
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Glu 435 Asn
Glu Val Asp Val Trp
Lys
Val
Val 180 Glu
Lys
Val
Leu
Gly 260 Asp
Gin
Thr
Arg
Phe 340 Thr
Asp
Val
Ser
Leu 420 Asp
Asn
lie
Glu
lie
Leu
Ala 165 Thr
His
Ala
Gin
Glu 245 Leu
Gly
Thr
Phe
Leu 325 Glu
Asp
Asp
Asp
Cys 405 Tyr
Ala
Gin
Lys
Ala 485 Gly
Phe 150 Leu
Tyr
Met
Lys
Glu 230 lie
Glu
Ser
Lys
Asn 310 Trp
Pro
Lys
Thr
Pro 390 Tyr
Arg
Lys
lie
Leu 470 Lys
Lys
135 Cys
Arg
lie
Thr
Ser 215 Val
Met
Asn
Phe
Asp 295 Gly
Ala
Glu
Gly
Ser 375 Asn
Gly
Ala
Arg
Leu 455 Gly
Tyr
Thr
Val
Ser
Lys
Cys 200 Leu
Tyr
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Leu
Leu 280 Glu
Gly
lie
lie
Val 360
Met
Val
Gly
Ser
Phe 440 Asp
Leu
Tyr
Leu
Tyr
Trp
Glu 185 Gly
Gly
His
Lys
Asp 265 Thr
Lys
Ala
Asp
Ala 345 Phe
Gly
Leu
Gin
Gin 425 Ala
Lys
Glu
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Tyr
Asp
Asn 170 Asn
Phe
lie
Val
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Ser
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Pro
Arg 330 Asp
Ser
Met
Arg
Met 410 Leu
Tyr
Trp
Met
Gin 490 Arg
Arg 155 Val
Val
Glu
Glu
Arg 235 Pro
Asp
Pro
Tyr
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Cys
Gly
Arg
Asn 395 lie
Arg
Asp
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140
Leu
His
Asp
Val
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Lys
Ser
Gin 300 Thr
Gin
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Arg
Leu 380 Phe
Glu
Phe
Phe
lie 460 Trp
Tyr
Pro
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Ala
Lys
Val 205 Leu
Gin
Ser
Leu
Ser 285 Phe
Tyr
Arg
Ser
Glu 365 Met
Lys
Ser
Pro
Leu 445 Ser
Leu
Ala
Glu
Asn
His
Leu 190 Phe
Pro
Lys
Leu
Leu 270 Thr
lie
Pro
Leu
His 350 Ser
Arg
Gin
Pro
Gly 430 Lys
Lys
Ala
Gly
lie
Thr
Lys 175
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Pro
Tyr
Leu
Leu 255 Lys
Ala
Lys
Val
Gly 335 lie
Glu
Met
Lys
Ser 415 Glu
Glu
His
Thr
Ser 495 Ser
lie 160
Val
Glu
Ala
Asp
Lys 240 Phe
Leu
Phe
Asn
Asp 320 lie
His
Phe
His
Asp 400 Pro
Glu
Lys
Leu
Leu 480 Gly
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Lys
Gly 545 Phe
lie
Phe
Glu
Glu 625 Glu
Val
Leu
Glu
Lys 705 Val
Glu
Gly
Tyr
Phe 785
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His 530 lie
Leu
Ala
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Leu 610
Gly
Gly
Trp
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lie 690 lie
Glu
Glu
lie
Tyr 770 Lys
Tyr 515 Gin
Glu
Ala
Trp
Lys 595 Gly
Gly
Phe
Leu
Asn 675 Leu
Cys
Gly
Asp
Asp 755 Tyr
500 His
Asp Leu Ala
Phe Glu Trp
Glu
Thr
Ala 580 Glu
Asn
Ala
Asp
Thr 660 Thr
Ala
Arg
Glu
Met 740 Arg
Arg
Phe
Ala 565 Lys
Thr
lie
Gly
Arg 645 Gin
Leu
His
Gin
lie 725 Gin
Asn
Ala
Gly 550 Ser
Ser
Thr
Asn
Ser 630 Tyr
Leu
Asn
Asn
Leu 710 Ala
Met
lie
Tyr
Val Leu Phe Glu 790
Leu 535 lie
lie
Gin
Ser
Gly 615 lie
Thr
Gin
lie
Glu 695 Ser
Ala
Leu
Lys
His 775 Pro
Lys 520 Tyr
Ser
Phe
lie
Glu 600 Leu
Ala
Arg
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Cys 680 Tyr
Phe
Lys
Val
Lys 760 Ala
Val
505 Thr
Met
Arg
Glu
lie 585 Glu
Asn
Leu
His
Gly 665 Ala
Lys
lie
Ser
Lys 745
Ala
Ala Ala
Asp
Gin
Lys
Leu 570
Ala
Asp
Asp
Ala
Gin 650 Glu
Gly
Ala
Gin
Ser 730 Leu
Phe
Asp
Phe
Glu
Asp 555 Glu
Lys
Lys
Thr
Thr 635 Leu
Ala
His
Leu
Ser 715 lie
Val
Leu
Thr
lys
Trp 540 Leu
Arg
Met
Arg
Asn 620 Leu
Lys
Asp
lie
Ser 700 Glu
Lys
Leu
Ala
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Arg 525 Tyr
Leu
Thr
lie
Ala 605 Gly
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Asn
Asp
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Lys
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Val 765 Asp
510 Cys
Glu
Leu
Asn
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Ala
Gin
Ala
Ala 670 Phe
Leu
Glu
Lys
Lys 750
Ala
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Gin
Ser
Ser
Glu 575
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Leu
Gly
Phe
Trp 655 Glu
Arg
Thr
Met
Glu 735 Tyr
Lys
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Ala
Cys
Tyr 560 Arg
Phe
Asn
Arg
Leu 640
Ser
Leu Glu
Ser
Gly 720 Leu
Gly
Thr
Met
權利要求
1、一種二萜合酶基因SmCPS，它是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1的DNA序列；2)由SEQID No.1通過一個或幾個核苷酸的添加、刪除、取代而得到的序列，其編碼與SEQ ID No.2相同功能的蛋白質。
2、 根據(jù)權利要求1所述的基因，其特征在于所述二萜合酶基因5^C/^為SEQ ID No. 1 所示的核苷酸序列。
3、 根據(jù)權利要求2所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框位于106-2487位核苷酸。
4、 一種由權利要求1所述的基因5"/^尸5"編碼的蛋白質。
5、 根據(jù)權利要求4所述蛋白質，其特征在于它的氨基酸殘基序列為SEQ ID No. 2。
6、 含有權利要求l所述的基因的表達載體。
7、 含有權利要求l所述的基因的轉基因細胞系。
8、 權利要求l所述的基因在丹參育種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種丹參二萜醌類化合物生物合成的二萜合酶基因，該基因為首次利用cDNA芯片技術從丹參中克隆而得，其全長cDNA長度為2601bp，其中開放閱讀框位于106-2487位核苷酸，詳細序列見SEQ ID No.1，編碼793個氨基酸殘基組成的蛋白質，見SEQ ID No.2。丹參二萜合酶是丹參二萜醌類化合物生物合成的一個關鍵酶，該基因控制著丹參二萜合酶的合成和表達，其表達量與丹參酮IIA含量密切相關。因此，該基因的克隆對于闡釋丹參品質形成的分子機理及培育新品種具有重要的意義。
文檔編號C12N15/52GK101319220SQ20071010014
公開日2008年12月10日 申請日期2007年6月5日 優(yōu)先權日2007年6月5日
發(fā)明者付桂芳, 崔光紅, 王學勇, 媛 袁, 偉 高, 黃璐琦 申請人:中國中醫(yī)科學院中藥研究所