專利名稱：：表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及工程菌及其構建方法與應用，特別是涉及表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌及其構建方法與其在發(fā)酵生產聚羥基脂肪酸酯中的應用。
背景技術：
：聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，簡稱PHA)是一種能由許多微生物合成的胞內聚酯，在微生物胞內以顆粒狀的內含物形式存在，是細菌胞內的一種碳源和能源的儲備物。由于其具有與塑料相近的物理材料性能及生物可降解性能，因此被稱之為生物可降解塑料。聚羥基脂肪酸酯的化學結構式如式I所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(式I)其中，ra=1、2、3或4，通常m-l;n=100-10000，表示聚合度；R為高度可變側鏈，可以是飽和或不飽和、直鏈或支鏈、脂肪族或芳香族的基團。近年來，組織工程領域的研究結果表明PHA還具有良好的生物相容性，是非常有潛力的生物醫(yī)用材料。PHA按照其單體結構的不同，可以分為以下三類短鏈PHA，其單體的碳原子數(shù)小于6，如聚3-羥基丁酸酯PHB，3-羥基丁酸戊酸共聚酯PHBV;中長鏈raA，含有碳原子數(shù)不小于6的單體；短鏈中長鏈共聚PHA，既含有短鏈PHA單體，又含有中長鏈raA單體，這兩種單體通過隨機共聚的形式連接，如3-羥基丁酸己酸共聚酯PHBHHx。不同單體組成的PHA具有不同的物理性質，例如強度、延展性、結晶速率等。微生物的許多代謝途徑，如e氧化途徑等，與PHA的生物合成過程密切相關。脂肪酸是PHA生物合成的合適碳源，脂肪酸代謝過程的中間產物可以通過幾條不同的代謝途徑生成各種羥基脂肪酸單體用于PHA的合成。這三種PHA的物理性能差異很大。目前，PHA主要是從微生物中提取的，但現(xiàn)有的提取方法都存在較大缺陷，如回收率不高、產品純度低、提取后產品分子量降低等，加上使用的許多有機溶劑毒性較大，沸點較低，提取過程需要高壓，給生產帶來安全隱患。對于中長鏈的PHA，現(xiàn)有的提取方法通常得到PHA沉淀是粘性很大的物質，較難分離和干燥，給提取帶來一定的困難，而且純度較低，帶有較多雜質，限制了其在醫(yī)學領域中的應用。因此，迫切需要一種工藝簡單，成本低，且產率較高的生產聚羥基脂肪酸酯的方法。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種可高效表達聚羥基脂肪酸酯(PHA)的專用表達工程菌。為解決上述技術問題，本發(fā)明釆取以下技術方案用于表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌，是抑制或敲除產聚羥基脂肪酸酯細菌中的與脂肪酸e氧化代謝途徑相關的一個或多個基因后得到的產聚羥基脂肪酸酯菌突變株。所述與脂肪酸e氧化代謝途徑相關的基因，可包括3-酮酰輔酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoAthiolase)(/感GenBank號:1044992)、3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因(3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenase)(Z"ao^，GenBank號1044991)、3_酮酰輔酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoAthiolase)(，尸，GenBank號:1041755)、3-酮酰輔酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoAthiolase)(/aWjr，GenBank號1045080)、乙酰輔酶A?；D移酶基因(acetyl-CoAacetyltransferase)(pAsZ，GenBank號1046928)和?；o酶A水合酶/異構酶enoy1-CoAhydratase/isomerase(/ao^Lr，GenBank號1045082)等基因。用于構建本發(fā)明產聚羥基脂肪酸酯的工程菌的出發(fā)菌株一產聚羥基脂肪酸酯菌株的選擇是多種多樣的，可為任意一株產聚羥基脂肪酸酯的細菌，優(yōu)選為產一種或多種單體碳鏈長度不小于6的中長鏈單體羥基脂肪酸酯的菌株，如/^eW咖OT^諷WAKT2442(Kellerhalsetal，Closed-loopcontrolofbacterialhigh-cell-densityfed-batchcultures:Productionofmcl-PHAsby/^ew/o/z^mss戸Wo^KT2442undersingle-substrateandcofeedingconditions.BIOTECHNOLOGYANDBIOENGINEERING，1999,65(3):306-315)、尸seMb/zro/7asp""V/aKT2440(ATCC編號47054)、Psew/o/z/o/asae/i/gj'77c^aPA01(ATCC編號39018)、/^ewfoMwas;w"^3KCTC1639(KimTK,JungYM，VoMT,ShioyaS,LeeYH.，MetabolicengineeringandcharacterizationofphaClandphaC2genesfrom尸sewo^膨朋s，"'cfeKCTC1639foroverproductionofmedium-chain-lengthpolyhydroxyalkanoate.BiotechnolProg.2006Nov-Dec;22(6):1541-6.)、尸se油脂愿叫strain3Y2(DelamaxreSC，ChangHJ，BattCA.Identificationandcharacterizationoftwopolyhydroxyalkanoatebiosynthesislociin尸5"e〃flfe脂朋51柳strain3Y2.ApplMicrobiolBiotechnol.2005Dec;69(3):293-303,Epub2005Nov15.)或」erOT^ss力j^r叩力Ls4AK4(QiuYZ，0uyangSP，ShenZ，WuQ，ChenGQ.，Metabolicengineeringfortheproductionofcopolyestersconsistingof3—hydroxybutyrateand3—hydroxyhexanoatebyAeromonashydrophila.MacromolBiosci.2004Mar15;4(3):255-61.)等。其中，以/^e"^^o/7^p""&KT2442為出發(fā)菌株，構建的敲除3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因(/ad5)及3-酮酰輔酶A硫解酶基因(/a^)的缺失突變株為尸./w^VsKT0Y06。以尸se"o^ra朋s/7^jWaKT2442為出發(fā)菌株，構建的敲除3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因(/朋幼的缺失突變株為尸./wz^feKT0Y06-1。以尸se"t/咖o朋si血KT2440為出發(fā)菌株，構建的敲除3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因(/加幼的缺失突變株為尸.；^nVaKTOY06-2。以尸set/ffo歷Masaei7/^'/osaPA01為出發(fā)菌株，構建的敲除3-酮酰輔酶A硫解酶基因(/ca月的缺失突變株為尸.aeri/w'/WMPACSS01。本發(fā)明的第二個目的是提供一種構建上述用于表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌的方法。本發(fā)明所提供的構建上述用于表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌的方法，包括以下步驟1)構建含有一個或多個與脂肪酸P氧化代謝途徑相關基因的重組自殺載體；2)將歩驟1)構建的重組自殺載體導入產聚羥基脂肪酸酯細菌，使產聚羥基脂肪酸酯細菌中的所述一個或多個與脂肪酸p氧化代謝途徑相關基因敲除，得到表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌。在上述工程菌的構建方法中，步驟l)中用于構建含有一個或多個與脂肪酸e氧化代謝途徑相關基因的重組自殺載體的出發(fā)載體的選擇是多種多樣的，可為pK18mobSacB、pGMB151、pXL275、pCVD442、p麗1823、pSUP202、pJK102或pSZ36等任一自殺載體，優(yōu)選為pK18mobSacB。其中，以pK18mobSacB為出發(fā)載體，構建的含有來源于/^ew/o/zo朋sKT2442菌株的3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因/sqS及3-酮酰輔酶A硫解酶基因AW的重組自殺載體為pSPKll;以pK18mobSacB為出發(fā)載體，構建的含有來源于/^e"o^/o朋sp""^KT2442或/^ewytM7OTas/wz^VaKT2440菌株的3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因/a必的重組自殺載體為pSPK13;以pK18mobSacB為出發(fā)載體，構建的含有來源于尸seM^ra朋s朋27^j'"ompa01菌株的3-酮酰輔酶a硫解酶基因pcaF的重組自殺載體為pSPK15。上述重組自殺載體均可按照基因工程領域中的常規(guī)方法構建。所述步驟2)中可將步驟l)構建的重組自殺載體通過轉化有所述重組自殺載體的￡h'S17-l導入產聚羥基脂肪酸酯細菌。步驟2)中用于構建本發(fā)明產聚羥基脂肪酸酯的工程菌的出發(fā)菌株一產聚羥基脂肪酸酯菌株的選擇是多種多樣的，可為任意一株產聚羥基脂肪酸酯的細菌，優(yōu)選為產一種或多種單體碳鏈長度不小于6的中長鏈單體羥基脂肪酸酯的菌株，如/^ew/o/^/ws/Wi.fl^KT2442、Pse"fifo/7o77as/w"ofeKT2440(ATCC編號47054)、/^e〃ob/ira/^S"aer"gjVosaPAOl(ATCC編號39018)、尸5e"o^w"as/w"daKCTC1639、尸se〃c/o/w朋55p.strain3Y2、或爿ero歷07a51/yo^o/力ja4AK4等。其中，以尸seM^/o;73sp"^/aKT2442為出發(fā)菌株，構建的敲除3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因/srfff及3-酮酰輔酶A硫解酶基因A必的產聚羥基脂肪酸酯的工程菌為尸.p""ofeKTOY06;以/^e〃c/o膨朋sp"io^KT2442為出發(fā)菌株，構建的敲除3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因/af仿的產聚羥基脂肪酸酯的工程菌為尸.KT0Y06-1;以尸s^fl^7o;7a9/w^VaKT2440為出發(fā)菌株，構建的敲除3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因/s必的產聚羥基脂肪酸酯的工程菌為尸.p"〃'AKTOY06-2;以/^e^o膨朋saan/^/2oaPA01為出發(fā)菌株，構建的敲除3-酮酰輔酶A硫解酶基因pcsF的產聚羥基脂肪酸酯的工程菌為尸.aer"^z'7ja^PACSSO1。此外，其它可抑制或敲除目的基因表達的方法均可用于構建本發(fā)明的用于發(fā)酵生產聚羥基脂肪酸酯的工程菌，這些方法包括人工合成抑制目的基因表達的小干擾RNA，基于A噬菌體Red重組酶的同源重組系統(tǒng)和構建含有人工合成抑制目的基因表達小干擾RNA編碼基因的干擾載體(如RNAi干擾載體，或慢病毒、腺病毒等病毒干擾載體)等。本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達聚羥基脂肪酸酯的方法。本發(fā)明所提供的表達聚羥基脂肪酸酯的方法，是用含有濃度5-20g/L的碳鏈長度為5-18的脂肪酸的發(fā)酵培養(yǎng)基對上述用于表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌進行發(fā)酵，得到聚羥基脂肪酸酯。所述碳鏈長度為5-18的脂肪酸的選擇是廣泛的，如辛酸、癸酸、月硅酸、十二酸、十四酸、十六酸或硬脂酸等。本發(fā)明提供了表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌及其構建方法。該工程菌是通過基因工程手段抑制或敲除野生型產聚羥基脂肪酸酯細菌中的與一個或多個與脂肪酸￡3氧化代謝途徑相關的基因后得到的產聚羥基脂肪酸酯菌突變株。搖瓶發(fā)酵實驗結果表明，與野生型產聚羥基脂肪酸酯細菌相比，本發(fā)明的菌株經發(fā)酵后PHA的表達水平顯著提高，PHA含量可提高到占細胞干重的85X(野生型產聚羥基脂肪酸酯細菌的PHA產量一般為40-50%)，此外，所合成的PHA中的單體結構還與脂肪酸底物的結構高度一致，因此，可以根據(jù)脂肪酸的結構獲得含有大量相同脂肪酸碳鏈長度單體的raA。本發(fā)明的聚羥基脂肪酸酯高產細菌突變株的構建方法簡單，用其發(fā)酵生產PHA將具有操作簡單、產量高、成本低廉及生產周期短的優(yōu)點?；谏鲜鰞?yōu)點，本發(fā)明的工程菌將在聚羥基脂肪酸酯中的生產中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。圖1為質粒pK18mobSacB的物理圖譜具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell,DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001，NY，ColdSpringHarbor)。所述百分比濃度如無特別說明均為質量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。所用弓I物及DNA序列均由上海生工合成。所用酶試劑均購自大連寶生物工程有限公司，提取質粒、回收DNA片斷所用的試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，相應的操作步驟按照產品說明書進行；所有培養(yǎng)基如無特別說明均用去離子水配制，培養(yǎng)基滅菌條件為115。C加熱20分鐘。如無特殊說明，下述實施例中的微生物培養(yǎng)條件均為發(fā)酵溫度30-35°C，發(fā)酵時間36-72h。所用發(fā)酵培養(yǎng)基中除去碳源部分的組成為(NH4)2S044.0g/L，MgS041.0g/L，Na2HP0412H204.5g/L，KH2P041.5g/L，F(xiàn)e(III)-NH4-citrate0.05g/L，CaCl20.02g/L和lmL/L的微量元素溶液；其中，微量元素溶液的配方為ZnS04'7H20100mg/L，MnCl24H2030mg/L，H3B03300mg/L，CoCl26H20200mg/L，CuS045H2010mg/L，NiCl26H2020mg/L，NaMo042H2030mg/L，HC10.5mol/L。其它培養(yǎng)基配方LB液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl，其余為水。LB-Km液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl和50l^g/raL硫酸卡那霉素，其余為水。LB-Km固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl和50Pg/mL硫酸卡那霉素，其余為水。LBS-Amp固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl和1001^g/raL氨芐青霉素，其余為水。LB-Km-Amp固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl，50Pg/mL硫酸卡那霉素和1(Xmg/mL氨芐青霉素，其余為水。實施例1、尸sewob;/7朋aspw^V/aKT24423-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因(3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenase,/a(湖及3-酮酰輔酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoAthiolase，/3W)缺失突變株的構建一、用于缺失突變/^ewt/咖朋aspyz^'cfeKT2442中/a必及/ao^基因的重組自殺載體的構建1)以尸5"ewo^脂/7351，"fl^strainKT2442(vanderMeer，JR，vanNeerven，AR，deVries，EJ，etal.Cloningandcharacterizationofplasmid—encodedgenesforthedegradationof1，2-dichloro-,1，4-dichloro-，and1，2,4-trichlorobenzeneof尸se"ob77cwassp.strainP51.JBacteriol173(1):6-15Jan1991)的基因組DNA為模板，在弓|物PI:5'-ATTTCTAGAGCAGATGATGGCCTTC-3，禾PP2:5'-CTGAAGCTTTGTAATGCCGGTATAC-3'的引導下，PCR擴增相連的兩個基因，包括3-酮酰輔酶A硫解酶基因片段(該基因的NCBIgeneID號為1044992)和3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因/<3(詔片段(該基因的NCBIgeneID號為1044991)，擴增結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經擴增獲得了大小約為2783bp的DNA片段，用限制性內切酶必sI和沿V^III對PCR擴增產物進行雙酶切后，回收大小約為2.8kb的酶切片段。2)用限制性內切酶X力3I/譜Wni對質粒pK18mobSacB(購自theNationalInstituteofGenetics,Japan,其物理圖譜如圖1所示)進行雙酶切，回收約5.7kb的酶切片段；3)將步驟1)和步驟2)的回收片段用T4DNA連接酶進行連接，將連接產物用電轉化法導入￡coh'S17-l(ATCC編號47055)中，然后將轉化子涂布于LB-Kra固體培養(yǎng)平板上，在37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h;4)挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Kra液體培養(yǎng)基中，在37t:、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質粒，并用限制性內切酶I對質粒進行酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小為5.699kb及2.783kb的DNA片段，將構建正確的含有PCR擴增的/sW及/so^基因片段的大腸桿菌克隆載體命名為pSPK10。5)用限制性內切酶5"a7I對質粒pSPK10進行酶切，回收6.648kb的酶切片段；6)將步驟5)的回收片段用T4DNA連接酶進行自連，將連接產物用電轉化法導入￡coh'S17-1中，將轉化子涂布于LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h;7)挑取步驟6)在LB-Kra固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質粒，并用限制性內切酶IZI和歷'/^ni對質粒進行雙酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小為5.699kb及0.949kb的DNA片段。將構建正確的/so^及基因的自殺載體命名為pSPKll，將含有質粒pSPKll的重組大腸桿菌命名為￡c^iS17-1(pSPKll)。二、通過構建好的自殺質粒pSPKll敲除/^ewfifo/zo/7as/wOVaKT2442中/a(詔及faW基因，獲得基因工程菌/^ei^o歷OT35"/w"AKT0Y061)挑取步驟一中獲得的含有質粒pSPKll的重組菌￡cohS17-l(pSPK11)，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，同時將尸sew^膨朋s/w"AKT2442菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，在3(TC、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，然后各取0.5mL上述兩種菌株的培養(yǎng)液混合至同一無菌小管中，8000rpm離心2min，棄去上清液，再加入lmL無菌LB液體培養(yǎng)基，重懸細菌后，置于3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，然后用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上，置于3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;2)挑取在LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種至LB-Amp液體培養(yǎng)基中，在30。C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)24h;3)用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)步驟2)中培養(yǎng)得到的菌液涂布于LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上，在3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;4)挑取步驟3)中在LBS-A^D固體培養(yǎng)平板上長出的20個單菌落，編號，并按次序將各單菌落分別接種在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板和LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;5)挑取步驟4)中只能在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上生長而不能同時在LB-Kra固體培養(yǎng)平板上生長的單菌落，分別接種至LB-A即液體培養(yǎng)基中，在30。C、200rpra下?lián)u床培養(yǎng)24h;6)將步驟5)獲得的不同菌落的培養(yǎng)液各取lmL，離心，棄上清，用200yl無菌水重懸，將重懸的菌液置于沸水浴中水浴10分鐘，冷卻后，以該菌液為模板，在引物P1和P2的引導下，進行PCR擴增，擴增結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，能夠獲得大小約為949kbDNA片段的菌落為構建正確的敲除/ao^及/so^基因的/^ewo^/K^aspwOVaKT2442突變株，將此突變株命名為尸se^/o歷o朋s/wt油KT0Y06。實施例2、用/^ewofe歷o77as/wnVaKT0Y06轉化月桂酸生產PHA的搖瓶實驗對實施例1獲得的基因工程菌/^ewfl^7o朋spyz^'AKT0Y06進行生產PHA的搖瓶實驗，具體方法如下-1)將v^e〃G^o朋s/w"VaKT0Y06接種于LB-Km液體培養(yǎng)基中，在30。C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，再按5%(V/V)的比例將菌液接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在3(TC、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)9h;2)將月硅酸加入到步驟1)中含有尸sew/o邁o朋sKTOY06的發(fā)酵液中，使得發(fā)酵液中月硅酸的濃度為12g/L，然后在3(TC、200rpm下繼續(xù)搖床培養(yǎng)39h。培養(yǎng)結束后，按照文獻(Ouyang，S.P.;Liu，Q.;Fang，L.;Chen，G.Q.Constructionofpha-Operon-DefinedKnockoutMutantsofPseudomormsputidaKT2442andtheirApplicationsinPoly(hydroxyalkanoate)Production.Macromol.Biosci.2007,7，227-233)中記載的方法檢測用上述方法發(fā)酵后的尸sewfo膨朋s;w。'AKTOY06菌體細胞干重以及PHA含量、組成。檢測結果如表1所示，經發(fā)酵后菌體細胞內PHA獲得了高水平的表達，PHA含量可達細胞干重的84.3±4.6%，且所合成的PHA中的單體結構還與脂肪酸底物的結構高度一致，證明本發(fā)明的工程菌可用于PHA的發(fā)酵生產中。表l發(fā)酵后菌體細胞干重以及PHA含量、組成的檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例3、/^ew/，o朋s;w^V3KT24423-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因(3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenase,/at幼缺失突變株的構建一、用于缺失突變/^ewfl^朋as/w"cfeKT2442中/a(仿基因的重組自殺載體的構建1)以尸sew/o歷o/as/w"'flfestrainKT2442的基因組DNA為模板，在引物P3:5，—ATTTCTAGAATCAAACGGGCGTATG—3，禾口P4:5'-ATCAAGCTTCCATTTCACGCAGCTT-3，的引導下，PCR擴增3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因A必片段，擴增結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經擴增獲得了大小約為2279bp的DNA片段，用限制性內切酶I和歷iK/III對PCR擴增產物進行雙酶切后，回收大小約為2.3kb的酶切片段。2)用限制性內切酶7&I,歷'/^III對質粒pK18mobSacB進行雙酶切，回收約5.7kb的酶切片段；3)將步驟1)和步驟2)的回收片段用T4DNA連接酶進行連接，將連接產物用電轉化法導入￡co^S17-l中，然后將轉化子涂布于LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h;4)挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質粒，并用限制性內切酶J力sI//7歷7wTI1對質粒進行酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小為5.699kb及2.279kb的DNA片段，將構建正確的含有PCR擴增的fa(詔基因片段的大腸桿菌克隆載體命名為pSPK12。5)用限制性內切酶5^I對質粒pSPK12進行酶切，回收6.486kb的酶切片段；6)將步驟5)的回收片段用T4DNA連接酶進行自連，將連接產物用電轉化法導入￡cW/S17-l中，將轉化子涂布于LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h;7)挑取步驟6)在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質粒，并用限制性內切酶JZI和歷V^ni對質粒進行雙酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小為5.699kb及0.787kb的DNA片段。將構建正確的/欲詔基因的自殺載體命名為pSPK13，將含有質粒pSPK13的重組大腸桿菌命名為￡co/j'S17-1(pSPK13)。二、通過構建好的自殺質粒pSPK13敲除尸se"cto/no朋s;w"(/aKT2442中fa必基因，獲得基因工程菌/^ew/，OTss/wtiofeKT0Y06-11)挑取步驟一中獲得的含有質粒pSPK13的重組菌￡cohS17-1(pSPK13)，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，同時將尸sei/^w/朋^pu"cfeKT2442菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，在30。C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，然后各取0.5mL上述兩種菌株的培養(yǎng)液混合至同一無菌小管中，8000rpm離心2min，棄去上清液，再加入lmL無菌LB液體培養(yǎng)基，重懸細菌后，置于30'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，然后用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)混合菌液涂布于LB-Km-A即固體培養(yǎng)平板上，置于3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;2)挑取在LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種至LB-Amp液體培養(yǎng)基中，在30。C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)24h;3)用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)步驟2)中培養(yǎng)得到的菌液涂布于LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上，在3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;4)挑取步驟3)中在LBS-A即固體培養(yǎng)平板上長出的20個單菌落，編號，并按次序將各單菌落分別接種在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板和LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;5)挑取步驟4)中只能在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上生長而不能同時在LB-Km固體培養(yǎng)平板上生長的單菌落，分別接種至LB-Amp液體培養(yǎng)基中，在30。C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)24h;6)將步驟5)獲得的不同菌落的培養(yǎng)液各取lmL，離心，棄上清，用200y1無菌水重懸，將重懸的菌液置于沸水浴中水浴10分鐘，冷卻后，以該菌液為模板，在引物P3和P4的引導下，進行PCR擴增，擴增結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，能夠獲得大小約為787kbDNA片段的菌落為構建正確的敲除基因的尸廳d畫脇jD由'fl^KT2442突變株，將此突變株命名為尸se"d翻愿KT0Y06-1。實施例4、用尸sew/，o朋s/wWAKT0Y06-1轉化癸酸生產PHA的搖瓶實驗對實施例1獲得的基因工程菌尸sei/^M朋as;wfi^3KT0Y06-1進行生產PHA的搖瓶實驗，具體方法如下.-1)將尸se"G^zw/7a/w〃WsKT0Y06-1接種于LB-Km液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)9h;2)將癸酸加入到步驟l)中含有/^ew6fe卿朋sp"aAKT0Y06-1的發(fā)酵液巾，使得發(fā)酵液中癸酸的濃度為12g/L，然后按5%(V/V)的比例將菌液接種到含12g/L癸酸的LB-Km液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下繼續(xù)搖床培養(yǎng)到48h。培養(yǎng)結束后，按照與實施例2相同的方法檢測用上述方法發(fā)酵后的Aewfo;^;7as;^i^KT0Y06-1菌體細胞干重以及PHA含量、組成。檢測結果如表2所示，經發(fā)酵后菌體細胞內PHA獲得了高水平的表達，PHA含量可達細胞干重的68.2±6.4%，此外，所合成的PHA中的單體結構還與脂肪酸底物的結構高度一致，證明本發(fā)明的工程菌可用于PHA的發(fā)酵生產中。_表2發(fā)酵后菌體細胞干重以及PHA含量、組成的檢測結果_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例5、/^ew/OTO朋s;w^/sKT24403-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因(3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenase,f況湖缺失突變株的構建一、用于缺失突變尸se"^M7cwasp"^VaKT2440中/aa^基因的重組自殺載體的構建由于Pse油羅as-ia^KT2440(ATCC編號47054)與尸固d扁腦，f油KT2442的/<30^基因序列一致，因此使用實施例3中構建的A(詔基因的自殺載體pSPK13及含有該質粒的重組菌AS17-1(pSPK13)即可。二、通過構建好的自殺質粒pSPK13敲除/^e"o^70/as/wtjWaKT2440中/at仿基因，獲得基因工程菌尸set/t/oM^asKT0Y06-21)挑取實施例3中構建的含有質粒pSPK13的重組菌￡S17-1(pSPK13)，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，同時將尸se"t/o歷朋as;w"ofeKT2440菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，在3(TC、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，然后各取0.5mL上述兩種菌株的培養(yǎng)液混合至同一無菌小管中，8000rpm離心2min，棄去上清液，再加入lmL無菌LB液體培養(yǎng)基，重懸細菌后，置于3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，然后用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上，置于3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;2)挑取在LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種至LB-A卿液體培養(yǎng)基中，在30。C、200rptn下?lián)u床培養(yǎng)24h;3)用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)步驟2)中培養(yǎng)得到的菌液涂布于LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上，在30。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;4)挑取步驟3)中在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的20個單菌落，編號，并按次序將各單菌落分別接種在LBS-A即固體培養(yǎng)平板和LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;5)挑取步驟4)中只能在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上生長而不能同時在LB-Km固體培養(yǎng)平板上生長的單菌落，分別接種至LB-Amp液體培養(yǎng)基中，在3(TC、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)24h;6)將步驟5)獲得的不同菌落的培養(yǎng)液各取lmL，離心，棄上清，用200"1無菌水重懸，將重懸的菌液置于沸水浴中水浴10分鐘，冷卻后，以該菌液為模板，在引物P3和P4的引導下，進行PCR擴增，擴增結束后，對PCR擴增產物進行1X瓊脂糖凝膠電泳檢測，能夠獲得大小約為787kbDNA片段的菌落為構建正確的敲除/ad5基因的/^ew/，o/asKT2442突變株，將此突變株命名為尸sei/ob/zray7as/w"t/aKT0Y06-2。實施例6、用/^ewo^OT^/wnWaKT0Y06-2轉化辛酸生產PHA的搖瓶實驗對實施例1獲得的基因工程菌尸sew/咖o朋sKT0Y06-2進行生產PHA的搖瓶實驗，具體方法如下1)將尸sew/o邁o刀as/wfiAKT0Y06-2接種于LB-Km液體培養(yǎng)基中，在3CTC、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，再按5%(V/V)的比例將菌液接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在30。C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)9h;2)將辛酸加入到步驟1)中含有/^e"c/o卿朋sp"tA/aKTOY06-2的發(fā)酵液中，使得發(fā)酵液中癸酸的濃度為12g/L，然后在30'C、200rpm下繼續(xù)搖床培養(yǎng)39h。培養(yǎng)結束后，按照與實施例2相同的方法檢測用上述方法發(fā)酵后的/^ew/o辺朋asKTOY06-2菌體細胞干重以及PHA含量、組成。檢測結果如表3所示，經發(fā)酵后菌體細胞內PHA獲得了高水平的表達，PHA含量可達細胞干重的6.7±0.8%,此外，所合成的PHA中的單體結構還與脂肪酸底物的結構高度一致，證明本發(fā)明的工程菌可用于PHA的發(fā)酵生產中。表3發(fā)酵后菌體細胞干重以及PHA含量、組成的檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例7、尸sei/^Mwasae2，收/z70MPA013-酮酰輔酶A硫解酶基因(3-ketoacy卜CoAthiolase，/ca月缺失突變株的構建一、用于缺失突變/^ew/，o/7asaeri^i/7aaPA01中pca尸基因的重組自殺載體的構建1)以Z^eW，o朋sae77^i/7osaPA01(ATCC編號39018)的基因組DNA為模板，在引物P5:5，-ATTTCTAGAGCAGCGCCAAGGAAG-3，和P6:5'-ATCAAGCTTCTGACCGTGCGACGG-3'的引導下，PCR擴增3-酮酰輔酶A硫解酶基因pca尸片段(該基因的NCBIgeneID號877715)，擴增結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經擴增獲得了大小約為1733bp的DNA片段，用限制性內切酶JfeI和III對PCR擴增產物進行雙酶切后，回收大小約為1.7kb的酶切片段。2)用限制性內切酶WaI//7ffiWIII對質粒pK18mobSacB進行雙酶切，回收約5.7kb的酶切片段；3)將步驟1)和步驟2)的回收片段用T4DNA連接酶進行連接，將連接產物用電轉化法導入￡coiS17-l中，然后將轉化子涂布于LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h;4)挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質粒，并用限制性內切酶Z力aI//7歷'/7丑11對質粒進行酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小為5.699kb及1.733kb的DNA片段，將構建正確的含有PCR擴增的pcs,基因片段的大腸桿菌克隆載體命名為pSPK14。5)用限制性內切酶5"WI對質粒pSPK14進行酶切，回收6.535kb的酶切片段；6)將步驟5)的問收片段用T4DNA連接酶進行自連，將連接產物用電轉化法導入￡coh'S17-1中，將轉化子涂布于LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h;7)挑取步驟6)在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37'C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質粒，并用限制性內切酶必aI和必V^III對質粒進行雙酶切鑒定，陽性質粒經酶切后可產生大小為5.699kb及0.836kb的DNA片段。將構建正確的pcs尸基因的自殺載體命名為pSPK15，將含有質粒pSPK15的重組大腸桿菌命名為￡co"'S17-1(pSPK15)。二、通過構建好的自殺質粒pSPK15敲除尸se〃(/offio/asaer,^/"osaPA01中pca尸基因，獲得基因工程菌尸5"e"fibwo"3saerwgi"o5aPACSS011)挑取步驟一構建的含有質粒pSPK15的重組菌￡c^iS17-l(pSPK15)，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37'C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，同時將/^ew/o歷oa^aer"《i"OMPA01菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，然后各取0.5mL上述兩種菌株的培養(yǎng)液混合至同一無菌小管中，8000rpm離心2min，棄去上清液，再加入lmL無菌LB液體培養(yǎng)基，重懸細菌后，置于3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，然后用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上，置于3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;2)挑取在LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種至LB-Amp液體培養(yǎng)基中，在3(TC、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)24h;3)用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)步驟2)中培養(yǎng)得到的菌液涂布于LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上，在3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;4)挑取步驟3)中在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的20個單菌落，編號，并按次序將各單菌落分別接種在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板和LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;5)挑取步驟4)中只能在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上生長而不能同時在LB-Km固體培養(yǎng)平板上生長的單菌落，分別接種至LB-Amp液體培養(yǎng)基中，在30。C、200rpm下?lián)u'床培養(yǎng)24h;6)將步驟5)獲得的不同菌落的培養(yǎng)液各取lmL，離心，棄上清，用200ul無菌水重懸，將重懸的菌液置于沸水浴中水浴10分鐘，冷卻后，以該菌液為模板，在引物P5和P6的引導下，進行PCR擴增，擴增結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，能夠獲得大小約為836kbDNA片段的菌落為構建正確的敲除pcsF基因的尸se〃G^zo/73saer^7'/osaPA01突變株，將此突變株命名為/^eMbfflMasser喂'/jo3PACSS01。實施例8、用/^e"fifo/ro朋saen^y/7assPACSS01轉化月桂酸生產PHA的搖瓶實驗對實施例1獲得的基因工程菌/^e"ob;s朋ssaei7^i/7t^sPACSS01進行生產PHA的搖瓶實驗，具體方法如下1)將/^e"ob歷o/wsae27/^'/7osaPACSS01接種于LB-Km液體培養(yǎng)基中，在30'C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，再按5%(V/V)的比例將菌液接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)9h;2)將月桂酸加入到步驟1)中含有尸se"ob膨朋saer"^'/a^PACSS01的發(fā)酵液中，使得發(fā)酵液中月桂酸的濃度為12g/L，然后在30'C、200rpra下繼續(xù)搖床培養(yǎng)39h。培養(yǎng)結束后，按照與實施例2相同的方法檢測用上述方法發(fā)酵后的戶sew/，OTasaerw^力o5aPACSS01菌體細胞干重以及PHA含量、組成。檢測結果如表4所示，經發(fā)酵后PHA含量占細胞干重的4.6土0.8X，此外，所合成的PHA中的單體結構還與脂肪酸底物的結構高度一致，證明本發(fā)明的工程菌可能應用于PHA的發(fā)酵生產中。表4發(fā)酵后菌體細胞干重以及PHA含量、組成的檢測結果CDW菌株(碳源)raA含量PHA單體組成(mol%)(gL-0(wt%)HHxH0HDHDDPACSS01(C12)0.62±0.054.6±0.8Q19.6±0.657.2±0.523.2±0.9權利要求1、用于表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌，是抑制或敲除產聚羥基脂肪酸酯細菌中的與脂肪酸β氧化代謝途徑相關的一個或多個基因后得到的產聚羥基脂肪酸酯菌突變株。2、根據(jù)權利要求1所述的工程菌，其特征在于所述與脂肪酸P氧化代謝途徑相關的基因包括3-酮酰輔酶A硫解酶基因、3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因、3-酮酰輔酶A硫解酶基因、乙酰輔酶A?；D移酶基因和?；o酶A水合酶/異構酶。3、根據(jù)權利要求1或2所述的工程菌，其特征在于所述產聚羥基脂肪酸酯細菌為產一種或多種單體碳鏈長度不小于6的中長鏈單體羥基脂肪酸酯的菌株。4、根據(jù)權利要求3所述的工程菌，其特征在于所述產聚羥基脂肪酸酯細菌為尸5"ewo^膨ysspwtJ'ofeKT2442、尸sewc/湖o朋5"戸"daKT2440、尸5ewt/咖ci朋saer柳7o5^PA01、尸5"e〃G^/ffo朋51/由VaKCTC1639、尸sewfl^/ffo朋s取strain3Y2或y4ero衡朋s力/rfro沐734AK4。5、根據(jù)權利要求4所述的工程菌，其特征在于所述用于表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌為尸./"Wc/aKT0Y06、尸.p"z^'ofeKT0Y06-1、尸.p〃W^KT0Y06-2或尸.3er柳'/205V3PACSS01。6、一種構建權利要求l所述的用于表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌的方法，包括以下步驟1)構建含有一個或多個與脂肪酸P氧化代謝途徑相關基因的重組自殺載體；2)將步驟l)構建的重組自殺載體導入產聚羥基脂肪酸酯細菌，得到表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌。7、根據(jù)權利要求6所示的構建方法，其特征在于所述步驟l)中用于構建含有一個或多個與脂肪酸0氧化代謝途徑相關基因的重組自殺載體的出發(fā)載體為pK18mobSacB、pGMB151、pXL275、pCVD442、pMW1823、pSUP202、pJK102或pSZ36;以pK18mobSacB為出發(fā)載體，構建的含有來源于/^ewt/咖OTaspw^VaKT2442菌株的3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因及3-酮酰輔酶A硫解酶基因的重組自殺載體為pSPKll;以pK18mobSacB為出發(fā)載體，構建的含有來源于/^ew/側朋^;wz^VfeKT2442或/^e"o^w朋sKT2440菌株的3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因的重組自殺載體為pSPK13;以pK18mobSacB為出發(fā)載體，構建的含有來源于尸5"ewA膨朋saer收i加saPA01菌株的3-酮酰輔酶A硫解酶基因的重組自殺載體為pSPK15。8、根據(jù)權利要求6所示的構建方法，其特征在于所述步驟2)中將步驟l)構建的重組自殺載體通過轉化有所述重組自殺載體的Ah'S17-1導入產聚羥基脂肪酸酯細菌；用于構建本發(fā)明產聚羥基脂肪酸酯的工程菌的出發(fā)菌株為尸SM^^O/^Spwtio^KT2442、尸sew/o/HO/a51pi/tit/aKT2440、尸sei/c/o/zo;3a5"aer^g7'/205"aPAOl、尸sewc/ci/z7(m351pw&'cfeKCTC1639、尸sewo^。膨朋s5/.strain3Y2或^er。歷。朋51力yrfr。p力j7a4AK4。9、根據(jù)權利要求8所示的構建方法，其特征在于所述以/^ew/o/^"M，"AKT2442為出發(fā)菌株，構建的敲除3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因及3-酮酰輔酶A硫解酶基因的產聚羥基脂肪酸酯的工程菌為尸./w^VaKT0Y06;以Z^ewob/z7朋as，。VaKT2442為出發(fā)菌株，構建的敲除3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因的產聚羥基脂肪酸酯的工程菌為尸.p〃"o^KT0Y06-1;以/^e〃ob歷o朋s/wOVaKT2440為出發(fā)菌株，構建的敲除3-羥基酯酰輔酶A脫氫酶基因的產聚羥基脂肪酸酯的工程菌為尸.KT0Y06-2;以尸5"ew/咖o/jaaer收&osaPA01為出發(fā)菌株，構建的敲除3-酮酰輔酶A硫解酶基因的產聚羥基脂肪酸酯的工程菌為尸.serz^眾osaPACSS01。10、一種表達聚羥基脂肪酸酯的方法，是用含有濃度5-20g/L的碳鏈長度為5-18的脂肪酸的發(fā)酵培養(yǎng)基對權利要求1-5任一項所述的用于表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌進行發(fā)酵，得到聚羥基脂肪酸酯。全文摘要本發(fā)明公開了聚羥基脂肪酸酯的一種表達方法及其專用工程菌。該用于表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌是抑制或敲除產聚羥基脂肪酸酯細菌中的與脂肪酸β氧化代謝途徑相關的一個或多個基因后得到的產聚羥基脂肪酸酯菌突變株。一種表達聚羥基脂肪酸酯的方法，是用含有濃度5-20g/L的碳鏈長度為5-18的脂肪酸的發(fā)酵培養(yǎng)基對本發(fā)明的用于表達聚羥基脂肪酸酯的工程菌進行發(fā)酵，得到聚羥基脂肪酸酯。本發(fā)明的聚羥基脂肪酸酯高產細菌突變株的構建方法簡單，用其發(fā)酵生產PHA將具有操作簡單、產量高、成本低廉及生產周期短的優(yōu)點。基于上述優(yōu)點，本發(fā)明的工程菌將在聚羥基脂肪酸酯中的生產中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。文檔編號C12P7/62GK101096651SQ20071010015公開日2008年1月2日申請日期2007年6月5日優(yōu)先權日2007年6月5日發(fā)明者倩劉,歐陽少平,陳國強,陳思思申請人:清華大學