專利名稱：蕓香科花椒屬植物單面針的人工快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的說，涉及蕓香科花椒屬植物單面針的人工快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
單面針(Zanthoxylum Dissitum Hemsl)又名蜆殼花椒、山枇杷、大葉花椒、蚌殼花椒等，屬蕓香科花椒屬常綠攀援或蔓生木質(zhì)藤本灌木。根、莖及葉均可入藥，臨床上有祛風(fēng)活絡(luò)、散瘀止痛、解毒消腫之功效，主治牙痛、腰痛、婦女月經(jīng)過多，產(chǎn)后月經(jīng)不調(diào)等癥；民間用于治療腰腿疼痛、關(guān)節(jié)疼痛、跌打損傷等癥。主要分布于我國西南、廣東、廣西、湖南、湖北、陜西等地，在湖南省主要分布于湘西，近年來，由于中成藥生產(chǎn)規(guī)模日趨擴大，而單面針的自然繁殖率低下，生長也較為緩慢，致使該天然資源日趨貧乏，供不應(yīng)求，并逐漸威脅著相關(guān)藥廠的正常生產(chǎn)。因此，尋求適宜的人工繁殖途徑，迅速擴大單面針資源供給已勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蕓香科花椒屬植物單面針的人工快速繁殖方法。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種蕓香科花椒屬植物單面針的人工快速繁殖方法，包括如下步驟將單面針離體胚經(jīng)初代培養(yǎng)后，依次進行繼代培養(yǎng)、壯苗及生根培養(yǎng)和煉苗及移栽。
所述初代培養(yǎng)優(yōu)選以MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)40-60天，培養(yǎng)基中添加濃度為1～5mg/L的細胞分裂素和濃度為0.1～0.6mg/L的生長素，其中，所述細胞分裂素為6-BA或者KT，所述生長素為NAA或者IBA；所述細胞分裂素更優(yōu)選為6-BA，濃度為1mg/L；所述生長素更優(yōu)選為NAA，濃度為0.4mg/L。
所述繼代培養(yǎng)優(yōu)選以MS、WPM、B5或White培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度23～27℃，光強度30～40μmol·m-2·s-1，光照時間12h·d-1，培養(yǎng)40-60天，培養(yǎng)基中添加濃度為0.1～5mg/L的細胞分裂素和濃度為0.01～1.0mg/L的生長素，其中，所述細胞分裂素為6-芐基腺嘌呤(6-BA)、激動素(KT)、玉米素(ZT)、氯吡苯脲(CPPU)或者噻二唑苯基脲(TDZ)，所述生長素為萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)或者吲哚丁酸(IBA)，所述繼代培養(yǎng)更優(yōu)選以MS培養(yǎng)基培養(yǎng)。
所述壯苗及生根培養(yǎng)優(yōu)選為以壯苗培養(yǎng)基MS+ZT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L進行壯苗培養(yǎng)后，以1/2MS、1/2WPM、1/2B5或1/2White培養(yǎng)基生根培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23～27℃，光強度30～40μmol·m-2·s-1，光照時間12h·d-1，培養(yǎng)30-40天，培養(yǎng)基中添加濃度為0.1～5mg/L的細胞分裂素和濃度為0.01～1.0mg/L的生長素，其中，所述細胞分裂素為6-BA、KT、ZT、CPPU或者TDZ，所述生長素為NAA、IAA或者IBA，更優(yōu)選為以壯苗培養(yǎng)基MS+ZT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L進行壯苗培養(yǎng)后，以1/4MS并添加IBA 0.3mg/L和NAA 0.05mg/L生根培養(yǎng)。
其中在離體胚培養(yǎng)實驗中，對培養(yǎng)基在自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋中消毒25分鐘，用HgCl2對離體胚進行消毒。
該單面針的人工快速繁殖方法，簡便易行，操作可行，能有效地使單面針較野生的更快生長繁殖，從而提高單面針藥材的產(chǎn)量，擴大來源，可滿足市場上對于單面針藥材的需求。


圖1是離體胚初代培養(yǎng)20天后的生長情況，培養(yǎng)基中NAA水平為0.4mg/L；圖2是離體胚初代培養(yǎng)20天后的生長情況，培養(yǎng)基中NAA水平為0.2mg/L。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1初代培養(yǎng)(無菌體系的建立)1.初代培養(yǎng)(無菌體系的建立)1.1材料選擇用解剖刀切破種殼，從胚囊中取出胚，然后用70％酒精進行消毒，再用0.1％氯化汞進行表面消毒，用無菌水漂洗3～4次，再用無菌濾紙或紗布吸干備用。
1.2培養(yǎng)基的制備根據(jù)培養(yǎng)的配方制備MS培養(yǎng)基，調(diào)pH值為5.8～6.0，用50mL三角瓶分裝，置于LDZX-40II型自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，于1.06kg/cm2的壓力下121℃消毒25分鐘。(常規(guī)制備)1.3不同激素及濃度對離體胚培養(yǎng)的影響實驗采用單面針離體胚做外植物，用MS固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加不同種類與濃度的細胞分裂素和生長素，觀察離體胚的發(fā)芽率，實驗結(jié)果見表1～3。從表1和表2的對比中可以看出，當保持NAA(奈乙酸)濃度一致，以6-BA(6-芐氨基嘌呤)作為激素時平均發(fā)芽率為48％，最高發(fā)芽率為65％。用KT(細胞分裂素)作為胚培養(yǎng)激素時平均發(fā)芽率只有39.2％，最高發(fā)芽率是60％。并且各濃度的6-BA對芽的誘導(dǎo)率都要比相應(yīng)濃度的KT的高，說明各濃度的6-BA對發(fā)芽率的影響要比KT的效果更為明顯。當每組6-BA的濃度保持一致時，取相同濃度的生長素NAA、IBA(吲哚丁酸)作對比實驗，從表1和表3的比較分析同樣可以得出NAA對發(fā)芽率的誘導(dǎo)要比IBA的效果好，因此在單面針離體胚培養(yǎng)過程中選用6-BA和NAA作為單面針離體胚培養(yǎng)激素是比較合適的。
表1 6-BA與NAA的組合


表2 KT與NAA的組合

表3 6-BA與IBA的組合

1.4最佳初代培養(yǎng)方案的確定實驗選擇6-BA、NAA、消毒時間(Time)因素3個，每個因素3水平，選用L9(33)正交表做正交實驗，并對實驗數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計軟件進行方差分析，同時用LSD法對每因素各水平之間進行多重比較。采用MS瓊脂培養(yǎng)基(含7.5g/L瓊脂，20g/L蔗糖，pH5.8)于25±1℃，2000lx光照培養(yǎng)，15d后統(tǒng)計發(fā)芽率，實驗結(jié)果見表4、5。
表4 正交實驗結(jié)果和直觀分析

表5 L9(34)實驗結(jié)果方差分析

通過對表4數(shù)據(jù)的直觀分析得出各因素內(nèi)各水平之間的極差(R)的大小，極差的大小反映了該因素的影響程度，極差大的因素對實驗結(jié)果的影響大，從R的大小可知對發(fā)芽率影響因素的主次依次是6-BA＞NAA＞消毒時間(T，分鐘)，從表4還可得出各因素的最優(yōu)水平組合為A1B2C2，即6-BA取1mg/L，NAA取0.4mg/L，消毒時間8分鐘。最優(yōu)水平組合A1B2C2與正交實驗中實驗序號2的結(jié)果是一致的，該組合對離體胚培養(yǎng)的發(fā)芽率可達86.6％。
方差分析的結(jié)果表5說明因素A(6-BA)和因素(NAA)對胚的發(fā)芽率影響顯著(P≤0.05)，因素C各水平之間無顯著差異。由此可知在單面針的離體胚培養(yǎng)過程中，要得到較高的發(fā)芽率，應(yīng)當選用1mg/L的6-BA，生長素NAA濃度選用0.2或0.4mg/L對實驗影響不大，消毒時間6、8、10分鐘對實驗結(jié)果影響不明顯。
從正交實驗的方差分析可知，生長素NAA濃度在0.2～0.4mg/L范圍都是較適合胚的生長的，但從苗的生長速度來看，NAA為0.44mg/L時生長較好(見圖1、2)，因而激素NAA選用0.4mg/L較為適合。
綜合對正交實驗的直觀分析和方差分析結(jié)果，為了得到單面針胚培養(yǎng)較高的發(fā)芽率，6-BA、NAA、消毒時間三因素的最佳水平組合為A1B2C2，即MS+6-BA 1mg/L，NAA取0.4mg/L，消毒時間8分鐘。
實施例2繼代培養(yǎng)(組培苗的增殖培養(yǎng))1.1培養(yǎng)基的制備(常規(guī)制備)基本培養(yǎng)基MS、WPM、B5、White四種，附加成分BA、ZT、KT、CPPU、NAA、IAA、IBA添加物等，pH值為5.8～6.2，瓊脂7.5g/L，蔗糖濃度30g/L，附加成分按細胞分裂素與生長素不同的配比加入基本培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基用300mL的廣口瓶分裝，每瓶30mL封口膜包扎，在121℃于1.1kg/cm2的條件下，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌21分鐘。
1.2實驗材料將單面針離體培培養(yǎng)出的無菌苗作為外植體，將帶頂芽不帶腋芽的單芽無菌苗切成長度為1～1.5cm，接種到培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)為30d。
1.3不同基本培養(yǎng)基對組培苗增殖的影響設(shè)計MS、WPM、B5、White四種培養(yǎng)基，分別添加6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L。單因素試驗設(shè)計，4次重復(fù)，每個重復(fù)中各處理接種5瓶，繼代培養(yǎng)時每瓶接種5各條件基本一致的外植體，培養(yǎng)30d，觀察其生產(chǎn)情況，苗木的葉色及生長是否正常，并統(tǒng)計組培苗增殖系數(shù)。(增殖系數(shù)＝總芽數(shù)/接種芽數(shù))試驗結(jié)果見表6，經(jīng)方差分析，不同基本培養(yǎng)基因素F＝370.237，P(sig.＝0.000)＜0.01，說明不同的培養(yǎng)基對組培苗增殖的影響極顯著。用WPM處理的不定芽，增殖系數(shù)最高，達到2.5，但是生長不正常，長勢差，苗細長，葉微黃。用MS培養(yǎng)基的不定芽，增殖系數(shù)較高達到2.3，瓶苗生產(chǎn)健壯，莖節(jié)間長，粗壯，葉色較綠。White與B5培養(yǎng)基的增殖系數(shù)很低，不宜作為基本培養(yǎng)基。因此，MS培養(yǎng)基為增殖的最適基本培養(yǎng)基。
表6 不同基本培養(yǎng)基對組培苗增殖影響

1.4不同細胞分裂素對組培苗增殖的影響以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA、ZT、KT、CPPU、TDZ濃度為1.0mg/L。單因素試驗設(shè)計，4次重復(fù)，每個重復(fù)中各處理接種5瓶，繼代培養(yǎng)時每瓶接種5個條件基本一致的外植體培養(yǎng)30d，觀察長勢、葉色，并統(tǒng)計出增殖系數(shù)等。
不同細胞分裂素對組培苗增殖的影響試驗結(jié)果見表7，這5種細胞分裂素對單面針組培苗的長勢、葉色、高度等差異不大，所以僅對增殖系數(shù)數(shù)據(jù)進行分析。經(jīng)方差分析，不同的細胞分裂素對增殖的影響差異顯著F＝139.724，P(sig.＝0.000)＜0.01，見表8。6-BA與ZT沒有顯著差異，但是與KT、CPPU、TDZ存在顯著差異。6-BA與ZT處理的不定芽增殖系數(shù)高，從提高增殖系數(shù)與降低生產(chǎn)成本兩方面綜合考慮，選擇6-BA作為單面針組培苗增殖的細胞分類素。
表7 不同細胞分裂素對組培苗增殖影響

表8 不同細胞分裂素對組培苗增殖影響的方差分析

采用Duncan新復(fù)極差法進行平均數(shù)比較，同一欄內(nèi)不同小寫字母表示在P＜0.05水平不同處理之間存在顯著差異，以下相同。
1.5 6-BA濃度對組培苗增殖的影響以MS為基本培養(yǎng)基，分別設(shè)置6-BA 0.0、0.5、1.0、2.0、5.0mg/L五種濃度，附加NAA 0.1mg/L，蔗糖濃度30g/L，探討6-BA對組培苗增殖的影響。單因素試驗設(shè)計，4次重復(fù)，每個重復(fù)中各處理接種5瓶，繼代培養(yǎng)時每瓶接種5個條件基本一致的外植體，培養(yǎng)30d。觀察生產(chǎn)情況，統(tǒng)計增殖系數(shù)。
不同6-BA濃度對組培苗增殖的影響試驗結(jié)果見表9。方差分析結(jié)果表明，不同濃度的6-BA對組培苗增殖有顯著影響，并對試驗數(shù)據(jù)進行曲線估計和回歸分析，得曲線估計中擬合度最高得為二次函數(shù)，決定系數(shù)R2＝0.43，增殖系數(shù)得回歸方程為y＝5.05+5.7x-0.94x2，相關(guān)系數(shù)r＝0.63(F檢驗得概率P＝0.00，P＜0.01)，隨著6-BA濃度的升高，二者的變化曲線呈拋物線狀。但是從表9可以看出，隨著6-BA濃度的升高，單面針組苗生長高度在下降，由于6-BA濃度的升高，有利于增殖不利于苗長高。綜合苗高與增殖系數(shù)兩個因素考慮，6-BA適合濃度為0.5～1.0mg/L。
表9 6-BA濃度對不定芽增殖的影響的試驗結(jié)果

1.6不同生長素對組培苗增殖的影響在以上篩選出的基本培養(yǎng)基MS、細胞分裂素6-BA 0.5mg/L基礎(chǔ)上，分別添加生長素IBA、IAA、NAA附加濃度為1.0mg/L、蔗糖濃度為30g/L，單因素試驗設(shè)計，4次重復(fù)，每個重復(fù)中各處理接種5瓶，繼代培養(yǎng)時每瓶接種5個條件基本一致的外植體，培養(yǎng)30d。觀察生長情況，統(tǒng)計增殖系數(shù)。
不同種類的生長素對組培苗增殖的影響試驗結(jié)果見表10。經(jīng)方差分析F＝122.81，P(sig.＝0.000)＜0.01，不同細胞生長素對增殖的影響顯著。生長素NAA誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生的愈傷組織少。增殖系數(shù)高，葉色正常，長勢好。IBA與IAA誘導(dǎo)的不定芽產(chǎn)生愈傷組織、增殖系數(shù)低，并且葉色發(fā)黃。所以，選擇NAA為單面針組培苗增殖的細胞生長素。
表10 生長素種類對不定芽增殖的影響

1.7生長素濃度對不定芽增殖的影響MS+6-BA 0.5mg/L，分別添加不同濃度的NAA，濃度設(shè)為0.0(對照CK)、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0mg/L。蔗糖濃度為30g/L。單因素試驗設(shè)計，，4次重復(fù)，每個重復(fù)中各處理接種5瓶，繼代培養(yǎng)時每瓶接種5個條件基本一致的外植體，培養(yǎng)30d。觀察生長情況，統(tǒng)計增殖系數(shù)。
不同生長素濃度對組培苗增殖的影響試驗結(jié)果見表11，對試驗數(shù)據(jù)進行曲線估計與回歸分析，曲線估計分析中二次函數(shù)的決定系數(shù)R2＝0.144，增殖系數(shù)得回歸方程為y＝2.77x2+11.3x-7.5，相關(guān)系數(shù)r＝-0.57。這表明生長素濃度對單面針組織培養(yǎng)的增殖效果與不定芽生長的影響顯著。當NAA濃度高于0.1mg/L，不定芽的平均長度小于2.0cm，說明低濃度(0.05～0.1mg/L)的NAA比較適合單面針組培苗的增殖與生長，瓶苗的生長勢好，粗壯，挺拔，莖長，葉色翠綠；濃度過高，則誘導(dǎo)更多的愈傷組織形成，反而抑制了組培苗的生長和增殖。
表11 生長素濃度對不定芽增殖的影響

1.8生物素濃度對不定芽增殖的影響MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L培養(yǎng)基中附加生物素濃度分別為0.0(對照CK)、1.0、2.0、5.0mg/L，蔗糖濃度為30g/L。觀察生長情況，統(tǒng)計增殖系數(shù)。
生物素濃度對組培苗增殖的影響試驗結(jié)果見表12。經(jīng)方差分析表明生物素濃度對組培苗的增殖率和不定芽的生長的影響極顯著，說明在單面針增殖培養(yǎng)基中，適當?shù)募尤胩砑游镉欣诮M培苗的增殖和生長。多重比較結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中加入生物素比對照的增殖系數(shù)和生長量都極顯著增加，但生物素不同濃度的處理之間沒有明顯差異。從節(jié)約成本考慮，選擇1.0mg/L濃度的生長素比較適合單面針增殖的培養(yǎng)。
表12 添加物濃度對組培增殖的影響

1.9適宜繼代培養(yǎng)基的篩選在以上選出的基本培養(yǎng)基、生長素及其濃度范圍的基礎(chǔ)上，進行分裂素、生長素及生物素濃度配比試驗。設(shè)計正交實驗L9(33)，因素A為6-BA(0.5、1.0、1.5mg/L)，因素B為NAA(0.05、0.1、0.3mg/L)，因素C為生物素(1.0、2.0、5.0mg/L)。各因子均分為3個水平，共九個處理，每個處理接種25個從芽，試驗重復(fù)3次。30d后統(tǒng)計增殖系數(shù)，并進行方差分析。
正交試驗結(jié)果見表13。因素A(6-BA)，F(xiàn)＝936.42，P(sig.＝0.000)＜0.01，認為激素6-BA對單面針組培苗誘導(dǎo)增殖有顯著差異，增殖系數(shù)大小為濃度0.5mg/L＞1mg/L＞1.5mg/L。因素B為NAA濃度，F(xiàn)＝184.79，P(sig.＝0.000)＜0.01，認為NAA濃度對單面針組培苗誘導(dǎo)增殖有顯著差異，增殖系數(shù)大小為濃度0.05mg/L＞0.1mg/L＞0.15mg/L。因素C為生物素的濃度，F(xiàn)＝21.06，P(sig.＝0.000)＜0.01，認為生物素濃度對單面針組培苗誘導(dǎo)增殖有顯著差異，增殖系數(shù)大小為濃度1mg/L＞2mg/L＞3mg/L。其影響順序為η2(6-BA)(0.995)＞η2(NAA濃度)(0.976)＞η2(生物素)(0.824)，方差分析最優(yōu)組合的結(jié)果為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.04mg/L+生物素1.0mg/L。
表13 適宜繼代培養(yǎng)基的正交試驗篩選結(jié)果

1.10培養(yǎng)條件全部培養(yǎng)過程在控溫培養(yǎng)室中進行。培養(yǎng)溫度25±2℃，光強度30～40μmol·m-2·s-1，光照時間12h·d-1。
實施例3壯苗及生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)前須進行壯苗培養(yǎng)。壯苗培養(yǎng)基MS+ZT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L。
1.1基本培養(yǎng)基對組培苗生根的影響基本培養(yǎng)基為1/2MS、1/2WPM、1/2B5、1/2White，分別添加IBA1.0mg/L，選擇生長健壯的組培苗接種于四種培養(yǎng)基中，共5個處理，每個處理接種25個叢芽，試驗重復(fù)3次。30d后統(tǒng)計生根率，取平均值，進行單因子分析。
單個叢芽接種到附件IBA 1.0mg/L的4種不同基本培養(yǎng)基上15～20d后，在各培養(yǎng)基上均可見叢芽切口處產(chǎn)生保色的愈傷組織，但尚未分化不定根。隨著誘導(dǎo)時間的延長，逐漸有不定根形成。試驗結(jié)果經(jīng)方差分析表明(表14)不同基本培養(yǎng)基對組培苗生根有顯著影響，接種在1/2MS培養(yǎng)基上的組培苗生根率達64％，并且葉色正常，長勢好。其次為1/2WPM生根率30％，但是生產(chǎn)基本正常，但1/2B5與1/2White培養(yǎng)基生根率低于20％，葉色發(fā)黃。因此，最佳基本培養(yǎng)基為1/2MS。
表14 不同基本培養(yǎng)基蜆殼花椒組培苗生根影響的試驗結(jié)果

1.2生長素種類對組培苗生根的影響試驗以優(yōu)化的生根基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加2.0mg/L的IBA、NAA、IAA，共3個處理，每個處理接種25個叢芽，試驗重復(fù)3次。30d后統(tǒng)計生根率、平均根數(shù)，取平均值，進行單因子分析。
將組培苗接種到2.0mg/L的IBA、NAA、IAA的1/2MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d后，經(jīng)方差分析結(jié)果表明(表15)，不同生長素對單面針組培苗生根的影響極顯著，從表2可以看出，2.0mg/L的IBA處理生根率最高可達70％，而經(jīng)過NAA處理的組培苗，莖基部形成較多的愈傷組織，葉色發(fā)黃，掉葉，而IBA處理的組培苗葉色濃綠，IAA處理的組培苗生根率低、苗長勢弱。因此，誘導(dǎo)單面針組培苗生根的最適宜的生產(chǎn)素為IBA，其次為NAA，IAA不適用于單面針組培苗生根。
表15 不同生長素對蜆殼花椒細培苗生根的影響

1.3IBA濃度對組培苗生根的影響以優(yōu)化的生根基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加0.1、0.5、1.0、1.5mg/LIBA，共4個處理，每個處理接種25個叢芽，試驗重復(fù)3次。30d后統(tǒng)計生根率、平均根數(shù)，取平均值，進行單因子分析。
方差分析結(jié)果表明(表16)，不同濃度的IBA對組培苗生根有顯著影響，并對試驗數(shù)據(jù)進行曲線估計與回歸分析，曲線估計分析中二次函數(shù)的決定系數(shù)R2＝9556，生根率的回歸方程為y＝26.67+22.3x-22.80x2，相關(guān)系數(shù)r＝-0.78*(F檢驗的概率P.＝0.02，P＜0.05)，隨著IBA濃度的升高，二者的變化曲線呈拋物線狀。對回歸方程求一階導(dǎo)數(shù)并令其等于零，求解極值點，可得出生根率取得極大值時的IBA濃度為0.5mg/L。
表16 IBA濃度對組培苗生根的影響結(jié)果

1.4NAA濃度對組培苗生根的影響表17 NAA濃度對組培苗生根的影響

試驗結(jié)果見表17，并對試驗數(shù)據(jù)進行曲線估計與回歸分析，回歸方程為y＝54.07+8.94x，相關(guān)系數(shù)r＝0.95*(F檢驗的概率P.＝0.006，P＜0.01)，NAA濃度對組培苗生根的影響極顯著，曲線估計為直線。試驗結(jié)果表明，當NAA濃度過高時會產(chǎn)生愈傷組織，而后在愈傷組織上誘導(dǎo)出不定根，當濃度高于0.1mg/L時會出現(xiàn)愈傷組織，濃度越高愈傷組織越多，雖然生根率隨NAA濃度的升高而增加，但是出現(xiàn)了黃葉、掉葉的現(xiàn)象，有的甚至死亡。因此，NAA的濃度不應(yīng)高于0.1mg/L。
1.5最佳生根培養(yǎng)基的篩選試驗在以上選出的基本培養(yǎng)基、生長素及其濃度范圍的基礎(chǔ)上，進行基本培養(yǎng)基種的大量元素與微量元素，生長素種類與濃度配比試驗。設(shè)計正交實驗L9(33)，因素A為MS(1/2MS、1/3MS、1/4MS)，因素B為IBA(0.3、0.5、0.7mg/L)，因素C為NAA(0、0.05、0.07)。各因子均分為3個水平，共九個處理，每個處理接種25個從芽，試驗重復(fù)3次。30d后統(tǒng)計生根率、平均根數(shù)，取平均值，并進行方差分析。
正交試驗結(jié)果與分析見表18、19。因素A(基本培養(yǎng)基)，F(xiàn)＝571.89，P(sig.＝0.000)＜0.01，認為基本培養(yǎng)基對單面針組培苗生根有顯著差異，增殖系數(shù)大小為1/4MS＞1/3MS＞1/2MS。因素B為IBA濃度，F(xiàn)＝3.63，P(sig.＝0.070)＞0.05，認為IBA濃度對單面針組培苗生根沒有差異。因素C為NAA濃度，F(xiàn)＝25.72，P(sig.＝0.000)＜0.01，認為NAA濃度對單面針組培苗生根有顯著差異，增殖系數(shù)大小為濃度0.05＞0.01＞0。其影響順序為η2(基本培養(yǎng)基)(0.992)＞η2(NAA濃度)(0.851)＞η2(IBA濃度)(0.447)，即基本培養(yǎng)基與NAA濃度為主效，IBA濃度對整個正交試驗的影響不大，方差分析最優(yōu)組合的結(jié)果為1/4MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.05mg/L。
表18 篩選適宜培養(yǎng)基的正交試驗結(jié)果

表19 實驗結(jié)果方差分析

*顯著水平P＝0.051.6培養(yǎng)條件全部培養(yǎng)過程在控溫培養(yǎng)室中進行。培養(yǎng)溫度25±2℃，光強度30～40μmol·m-2·s-1，光照時間12h·d-1。
1.7正交試驗結(jié)果的驗證經(jīng)過正交試驗放分析得出最適培養(yǎng)基1/4MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.05mg/L與試驗中增殖系數(shù)最高的培養(yǎng)基1/3MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L進行比較，有3個重復(fù)，每個重復(fù)接種5瓶。比較結(jié)果如表20，分析表明，1/4MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.05mg/L的生根率(0.70)低于1/3MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L的生根率(0.75)，可能是由于三個正交試驗因素存在交互作用，正交試驗分析出來的最優(yōu)組合1/4MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.05mg/L并不比1/3MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L的生根率高。
表20 兩種培養(yǎng)基的生根率比較試驗結(jié)果

1.8活性炭對單面針組培苗生根的影響將單面針組培苗接種到培養(yǎng)基為1/3MS+IBA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L，附加活性炭200mg/L，30d后統(tǒng)計結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加活性炭對單面針組培苗不定根的誘導(dǎo)并無促進作用，在不添加活性炭的情況下，組培苗生根率能達到78％，而在添加活性炭的條件下，組培苗生根率不足5％?？赡苁怯捎诨钚蕴坎粌H能吸附有害物質(zhì)，而且也能吸附培養(yǎng)基中的生長素，從而不能發(fā)揮誘導(dǎo)生根的作用。
研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基、生長素的種類及濃度對單面針組培苗生根有較大影響，基本培養(yǎng)基中大量元素含量降低能促進不定根的產(chǎn)生，以1/3為最佳，培養(yǎng)基中單獨添加NAA、IBA即可誘導(dǎo)單面針組培苗生根，但試驗結(jié)果亦表明，生長素NAA與IBA配合使用對蜆殼花椒組培苗的不定根誘導(dǎo)比單獨使用效果更佳。
即最佳生根培養(yǎng)基為1/3MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L。一般15～20就會有誘導(dǎo)出根，培養(yǎng)周期40天，組培苗根長約2cm左右即可移栽。
實施例4移栽1.1基質(zhì)的調(diào)配選用泥炭土、珍珠巖、糠殼灰、黃泥、細沙等，按比例搭配，泥炭土∶珍珠巖＝1∶3；或糠殼灰∶黃泥∶細沙＝2∶1.5∶1(以上均為體積比)。按以上比例稱取基質(zhì)，混勻，用800倍液百菌清噴濕(消毒)，放置3天后使用，使用前用1000倍液百菌清進行二次消毒，分裝到一次性塑料杯中，裝入基質(zhì)體積約為一次性塑料杯體積的1/3。
1.2移栽方法用鑷子將組培苗從培養(yǎng)基中取出放入清水中，用清水輕輕洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，同時將根剪至1cm左右，靠近根部的葉片剪掉。
將修剪好后的單面針在1000倍液的百菌清溶液中浸泡2min，然后取出晾10min方可進行移栽。
取一次性杯子，裝入半杯配好的基質(zhì)，移植時用一個筷子粗的竹簽在基質(zhì)中插一個小孔，然后將小苗插入(注意幼苗較嫩，防止弄傷)，栽后把苗周圍基質(zhì)壓實，栽好后再澆適量的百菌清溶液，澆透為止，保持濕度在80～90％，放入大棚中培養(yǎng)。
1.3培養(yǎng)條件大棚溫度20～30℃，溫室內(nèi)濕試驗為80％，每20min噴水一次，生長30～45天后揭膜，光照不能太強，要有良好的通風(fēng)措施。定期施肥，肥料選用生長中常用的復(fù)合肥，濃度為800倍液為宜，每周一次。用此方法成活率能達到95％左右(如發(fā)現(xiàn)有病蟲害可噴施1000倍液百菌清或瑞毒霉)。
權(quán)利要求
1.蕓香科花椒屬植物單面針的人工快速繁殖方法，包括如下步驟將單面針離體胚初代培養(yǎng)后，依次進行繼代培養(yǎng)、壯苗及生根培養(yǎng)和煉苗及移栽。
2.如權(quán)利要求1所述的人工快速繁殖方法，其特征在于，所述初代培養(yǎng)優(yōu)選MS固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)40-60天，培養(yǎng)基中添加濃度為1～5mg/L的細胞分裂素和濃度為0.1～0.6mg/L的生長素，其中，所述細胞分裂素為6-BA或者KT，所述生長素為NAA或者IBA。
3.如權(quán)利要求1或2所述的人工快速繁殖方法，其特征在于，在初代培養(yǎng)前對離體胚用0.1％氯化汞消毒處理8分鐘，并且其中所述的細胞分裂素為6-BA，濃度為1mg/L；所述生長素為NAA，濃度為0.4mg/L。
4.如權(quán)利要求1所述的人工快速繁殖方法，其特征在于，所述繼代培養(yǎng)以MS、WPM、B5或White培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度23～27℃，光強度30～40μmol·m-2·s-1，光照時間12h·d-1，培養(yǎng)40-60天培養(yǎng)基中添加濃度為0.1～5mg/L的細胞分裂素和濃度為0.01～1.0mg/L的生長素，其中，所述細胞分裂素為6-BA、KT、ZT、CPPU或者TDZ，所述生長素為NAA、IAA或者IBA。
5.如權(quán)利要求4所述的人工快速繁殖方法，其特征在于，所述繼代培養(yǎng)使用下述培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.04mg/L+生物素1.0mg/L。
6.如權(quán)利要求1所述的人工快速繁殖方法，其特征在于，所述壯苗及生根培養(yǎng)為以壯苗培養(yǎng)基MS、ZT 2.0mg/L和NAA 0.2mg/L進行壯苗培養(yǎng)后，以1/2MS、1/2WPM、1/2B5或1/2White培養(yǎng)基生根培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23～27℃，光強度30～40μmol·m-2·s-1，光照時間12h·d-1，培養(yǎng)30-40天，培養(yǎng)基中添加濃度為0.1～5mg/L的細胞分裂素和濃度為0.01～1.0mg/L的生長素，其中，所述細胞分裂素為6-BA、KT、ZT、CPPU或者TDZ，所述生長素為NAA、IAA或者IBA。
7.如權(quán)利要求6所述的人工快速繁殖方法，其特征在于，所述壯苗及生根培養(yǎng)為以壯苗培養(yǎng)基MS、ZT 2.0mg/L和NAA 0.2mg/L進行壯苗培養(yǎng)后，以1/4MS并添加IBA 0.3mg/L和NAA 0.05mg/L生根培養(yǎng)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，移栽的方法是取組培苗洗去根部培養(yǎng)基，將根短剪，并去掉靠近根部的葉，消毒，將培養(yǎng)基質(zhì)上做上與根大小相適應(yīng)的小孔，將根插入，壓實基質(zhì)，移入大棚培養(yǎng)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，移入大棚后培養(yǎng)溫度控制在20～30℃，濕度控制在80％。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的基質(zhì)為按體積比1∶3的泥炭土和珍珠巖混合物，或按體積比為2∶1.5∶1的糠殼灰、黃泥和細沙混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及蕓香科花椒屬植物單面針的人工快速繁殖方法，該方法采用組培培養(yǎng)技術(shù)，將單面針離體胚消毒后經(jīng)初代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)、壯苗及生根培養(yǎng)獲得了大量的組培苗，經(jīng)煉苗后移栽可實現(xiàn)單面針快速繁殖，特別是本發(fā)明針對單面針組織培養(yǎng)設(shè)計了一系列培養(yǎng)基，大大提高了離體胚的發(fā)芽率以及組培苗的繁殖系數(shù)和生根率。由于中成藥對單面針藥材用量不斷增長，而單面針的自然繁殖率低下，生長也較為緩慢，使野生單面針藥材資源日益枯竭，供不應(yīng)求。本發(fā)明方法簡便易行，培養(yǎng)基成分配方獨特，操作可行，推廣應(yīng)用該方法可實現(xiàn)單面針人工快速育苗，滿足市場上對于單面針藥材的需求。
文檔編號C12N5/04GK101057559SQ20071010030
公開日2007年10月24日 申請日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日
發(fā)明者王平, 左之文, 馬英姿, 顏利玲 申請人:株洲千金藥業(yè)股份有限公司 被以下專利引用 (1),