專利名稱：一種低溫堿性磷脂酶a的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種編碼耐冷居泉沙雷氏菌的低溫堿性磷脂酶A1的基因序列及含有該酶基因的重組質(zhì)粒和表達相應(yīng)酶的重組菌株、衍生物。
背景技術(shù)：
磷脂酶是水解磷脂的酯鍵的酶。廣泛存在于真核生物和原核生物中，影響磷脂的分解代謝、生物膜的形成和重組，并且磷脂酶也涉及信號的級聯(lián)。根據(jù)磷脂酶分子攻擊的鍵的位置，已知有幾種類型的特異性不同的磷脂酶，其中磷脂酶A1(Phospholipase A1，3.1.1.32，簡稱PLA1)催化磷脂第一位酯酰鍵的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸。PLA1可以在細胞內(nèi)，也可以在細胞外；是膜結(jié)合的或者是可溶的。
磷脂酶在工業(yè)中有多種應(yīng)用，包括應(yīng)用于食品和非食品的磷脂乳化劑的修飾，增加油/水混合物的乳化；磷脂酶還可以被用于植物油加工過程中的油的脫膠。此外，磷脂酶在烘焙應(yīng)用中對于提高生面團或烘焙產(chǎn)品質(zhì)量特別有用。低溫磷脂酶A1的最適酶活溫度一般在40℃以下，它具有最適酶活溫度低，在低溫下具有更高的催化效率等特點，因而應(yīng)用于植物油脫膠和修飾磷脂乳化劑等工業(yè)生產(chǎn)中可簡化生產(chǎn)工藝、節(jié)能降耗、提高產(chǎn)品質(zhì)量、保護環(huán)境、降低生產(chǎn)成本，有著中溫磷脂酶A1無法取代的優(yōu)越性。
磷脂酶A已經(jīng)從動物、植物、真菌和細菌等許多不同的來源中獲得。來自于動物組織如大鼠肝臟(Biochemistry，104447～4450，1971)、心、腦(LipidRes，26104～114，1985)和人腦(Biosci.Biotechnol.Biochem，63(5)820～826，1999)以及牛腦(Biochem.Res.Commun，1951272～1279，1993)的細胞內(nèi)磷脂酶A1已被部分純化。通過凝膠過濾測得這些胞內(nèi)磷脂酶A1的分子量大于150kDa，它們在動物細胞中的含量很低。磷脂酶A最早是從蛇毒液和豬胰液中獲得(Journal of Biotechnology，72103～114，1999)。來源于豬胰腺(Biochem.Res.Commun，1951272～1279，1993)和Agkistrodon HalysBlomhoffii毒液的磷脂酶A的熱穩(wěn)定性比較高(Biochim.Biophys.Acta，159103，1968)。馬鈴薯塊莖儲藏蛋白(Patatins)的作用相當(dāng)于磷脂酶(Eur.J.Biochem，2685037～5044，2001)。與膜結(jié)合的微生物磷脂酶A已報道的有兩例E.coli的DR-磷脂酶A抗表面活性劑SDS，被Ca2+和Mg2+激活，被Fe3+抑制(J.Biochem，961645～1653，1984；J.Biochem，961655～1664，1984)；另一種來源于E.coli與細胞膜結(jié)合的PLA1，在SDS和一些有機溶劑中很穩(wěn)定，最適pH為8.4，在pH6.5可失去一半的酶活，酶反應(yīng)需要Ca2+(Biochemistry，104447～4456，1971)。來源于動物組織的磷脂酶A和與膜結(jié)合的微生物磷脂酶A來源都很有限，且價格昂貴，故微生物胞外磷脂酶A1的研究越來越受到重視。有關(guān)微生物胞外磷脂酶A1的酶學(xué)性質(zhì)的報道僅一篇，Kim報道的一株沙雷氏菌Serratia sp.MK1產(chǎn)生最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH為8.5，在70℃保溫1h仍然很穩(wěn)定的磷脂酶A1(Journal ofMicrobiology and Biotechnology，6(6)407～413，1996)。到目前為止，國內(nèi)外尚未見有關(guān)專利和文獻報道微生物低溫堿性磷脂酶A1。
目前，國內(nèi)外研究較多的是海洋、極地環(huán)境下的低溫微生物及其低溫酶，而對于內(nèi)陸高寒地區(qū)、冰川凍土的研究較少。低溫微生物產(chǎn)生的低溫磷脂酶A1具有優(yōu)良的低溫活性，所以研究、開發(fā)低溫磷脂酶具有重要意義。此外，有關(guān)既產(chǎn)生低溫磷脂酶又產(chǎn)生脂肪酶的沙雷氏菌的研究，國內(nèi)外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對目前國內(nèi)外尚未有微生物低溫磷脂酶A1的報道，及對于內(nèi)陸高寒地區(qū)、冰川凍土的研究較少，尚沒有從冰川凍土中分離到的低溫微生物資源涉及的酶基因克隆到受體菌，由受體菌在其培養(yǎng)條件下產(chǎn)生磷脂酶A1的報道的現(xiàn)狀。
本發(fā)明提供一種低溫磷脂酶A1產(chǎn)生菌株，編號為xjF1，其具有生產(chǎn)低溫堿性磷脂酶A1的優(yōu)良特性，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，屬于居泉沙雷氏菌株(Serratia fonticola)。
本發(fā)明同時提供了一種新型磷脂酶A1及其結(jié)構(gòu)基因、重組質(zhì)粒和重組菌體。該基因表達產(chǎn)物磷脂酶A1在低溫條件下顯示活性，應(yīng)用于磷脂乳化劑的修飾、油脂精練等工業(yè)過程中可節(jié)能降耗，簡化生產(chǎn)工藝。同時本發(fā)明提供了一種制備低溫磷脂酶A1的方法，就是通過培養(yǎng)耐冷居泉沙雷氏菌xjF1，或含有本發(fā)明的低溫磷脂酶A1編碼基因的工程菌獲得低溫磷脂酶A1。
新疆天山凍土屬于我國高海拔多年凍土，分布于烏魯木齊河源天山冰川站地區(qū)海拔3250m以上區(qū)域，年平均地溫為-4.95℃，凍土微生物被描述為“幸存著的群落”。本發(fā)明從天山凍土中分離耐冷菌，篩選出產(chǎn)低溫酶的菌株，其中耐冷居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)xjF1產(chǎn)生在低溫條件下具有良好的活性和穩(wěn)定性的低溫磷脂酶A1，其分泌的磷脂酶A1最適作用溫度為20～35℃，最適pH9.0。這不僅為研究極端環(huán)境下的生命特征和適應(yīng)機制提供了理想的材料，而且對于尋找具有獨特性質(zhì)的低溫酶，實現(xiàn)低溫酶產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。
本發(fā)明從居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)xjF1中獲得磷脂酶A1基因，它包含兩個開放閱讀框plA和plS。其中plA基因被證實編碼磷脂酶A1，該基因全長963bp，編碼320個氨基酸，酶蛋白理論分子量為33.9kDa。plS基因編碼磷脂酶A1的輔助蛋白，該基因包含756個核苷酸，編碼251個氨基酸，理論分子量為27.7kDa。
利用現(xiàn)有分子生物學(xué)方法可以得到不同的表達載體和細胞系。即獲得含有本發(fā)明基因的大腸桿菌重組質(zhì)粒以及重組大腸桿菌；獲得含有本發(fā)明基因的畢赤酵母重組質(zhì)粒以及重組酵母。
本發(fā)明具體提供了一種低溫堿性磷脂酶A1生產(chǎn)菌株，命名為xjF1，其能夠產(chǎn)生低溫堿性磷脂酶A1。參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)鑒定手冊》(《Bergey’sManual of Systematic Bacteriology》)第九版和《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》等對xjF1菌株進行形態(tài)學(xué)測定，生理生化檢測、G+C含量測定，確定xjF1菌株為沙雷氏菌屬(Serratia)中的成員。16SrRNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和細胞脂肪酸組分分析結(jié)果都表明xjF1菌株為居泉沙雷氏菌株(Serratiafonticola)，可簡稱S.fonticola xjF1。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期是2007年3月12日，保藏號是CGMCC No.1971。該菌株最適生長溫度范圍是20～30℃；優(yōu)先生長于LB培養(yǎng)基表面(培養(yǎng)基組分[g/L]為蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂粉15)，30℃下培養(yǎng)12小時可獲得單菌落。菌落稍大于E.coli，呈白色、半透明、粘稠狀。菌落表面凸起、邊緣整齊。該菌株具有周鞭毛可幫助其運動，兼性厭氧。細胞短桿狀，兩端圓，長度約0.9-2.0微米，直徑約0.5-0.8微米，為革蘭氏陰性菌。發(fā)酵并利用麥芽糖、衛(wèi)矛醇。胞外酶可以水解DNA，不水解脂肪、脲和明膠，發(fā)生硝酸和亞硝酸還原，VP反應(yīng)、吲哚產(chǎn)生實驗均呈陰性。通過BLAST同源比對，菌株xjF1的16SrRNA序列與S.fonticola種的16SrRNA序列的相似性最高，S.fonticola xjF1的G+C克分子％為52.5％。
本發(fā)明通過S.fonticola xjF1發(fā)酵獲得磷脂酶和脂肪酶。該磷脂酶最適作用溫度為35℃，4℃時測定仍有一定的酶活力，這種低溫活性在工業(yè)上具有很重要的開發(fā)潛能。通過對發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化，選用廉價普通的營養(yǎng)成分，采用常規(guī)單批發(fā)酵方式，低溫磷脂酶發(fā)酵酶活達17.5U/mL，脂肪酶發(fā)酵酶活達4.0U/mL。本發(fā)明通過從S.fonticola xjF1中分離到的脂肪酶基因片段和磷脂酶基因，進一步確定了菌株xjF1產(chǎn)生兩種酶磷脂酶和脂肪酶。
本發(fā)明從耐冷居泉沙雷氏菌(S.fonticola xjF1)中提取總DNA。根據(jù)NCBI上已公布的細菌低溫脂肪酶和磷脂酶基因序列的保守區(qū)，設(shè)計了一對特異性引物，以S.fonticola xjF1的全基因組DNA為模板，用PCR方法擴增到約750bp的磷脂酶A1基因片段。根據(jù)磷脂酶A1基因的部分序列，又設(shè)計了嵌套的特異性引物，利用TAIL-PCR技術(shù)擴增得到750bp的部分基因序列的側(cè)翼序列，最后通過序列拼接獲得了完整的磷脂酶A1基因的核苷酸序列。測序結(jié)果表明，目的基因的核苷酸序列含有兩個開放閱讀框(plA和plS)。其中plA基因具有序列表中SEQ No.1所示的核苷酸序列，全長963bp，其中1～54bp編碼低溫堿性磷脂酶A1信號肽序列，55～963bp編碼低溫堿性磷脂酶A1成熟肽。plS基因具有序列表中SEQ No.3所示的核苷酸序列，由756個核苷酸組成，編碼一個由251個氨基酸組成的磷脂酶A1的輔助蛋白，是具有序列表中SEQ No.4氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明涉及的磷脂酶A1是一種低溫堿性磷脂酶A1，是具有序列表中SEQ No.2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ No.2由320個氨基酸殘基組成，其中自C末端1～18氨基酸為低溫堿性磷脂酶A1信號肽序列，19～320氨基酸為低溫堿性磷脂酶A1成熟肽序列，193～197氨基酸(-Gly-X1-Ser-X2-Gly-)為脂肪酶中最保守的、在部分磷脂酶中也有很高的保守性的序列。本發(fā)明涉及的磷脂酶A1是一新型的磷脂酶A1，其氨基酸序列與其它已報道的磷脂酶A1的氨基酸序列比較，相似性在59％～70％。plA基因的氨基酸序列與粘質(zhì)沙雷氏菌的磷脂酶A1基因的同源性為70.4％。plS基因的氨基酸序列與沙雷氏菌Serratia sp.MK1的輔助蛋白基因的同源性為62％。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本發(fā)明的磷脂酶A1基因所表達的酶分子的氨基酸進行一個或多個氨基酸替換、插入或缺失所得到的功能類似物也能達到本發(fā)明的目的。因而本發(fā)明也包括與SEQ No.2所示的氨基酸具有至少有80％的同源性，優(yōu)選具有至少90％的同源性，但同時具有磷脂酶A1的活性的功能類似物。
分析居泉沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1基因的核苷酸序列，可以看到plA和plS是兩個重疊基因，plS的起始密碼子位于plA的終止密碼子上游5bp的位置，這兩個可讀框可以單獨進行轉(zhuǎn)錄。為了探討輔助蛋白基因plS在磷脂酶A1基因的表達中的作用，分別構(gòu)建了含有兩個基因(plA和plS)的大腸桿菌重組質(zhì)粒pET-PL-AS和含有一個基因(plA)的大腸桿菌重組質(zhì)粒pET-PL-A。重組大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，分別取培養(yǎng)液和超聲波破碎后得到的細胞周質(zhì)測定磷脂酶A1活力。實驗結(jié)果表明含有兩個基因的重組大腸桿菌BL21/pET-PL-AS和含有一個基因的重組大腸桿菌BL21/pET-PL-A培養(yǎng)液中的磷脂酶A1活力均低于細胞周質(zhì)中的，表明磷脂酶A1基因在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物絕大部分位于細胞周質(zhì)中，只有少量在培養(yǎng)液中。同時還發(fā)現(xiàn)重組菌BL21/pET-PL-AS的磷脂酶A1的活力明顯高于重組菌BL21/pET-PL-A，表明輔助蛋白基因plS能夠提高plA基因在大腸桿菌中的表達量。將所有的可溶性蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明培養(yǎng)液無明顯的蛋白條帶；含有兩個基因的重組菌和含有一個基因的重組菌在分子量約35kDa的位置均出現(xiàn)了特異的表達蛋白條帶，而含有空質(zhì)粒的對照菌在同一位置上沒有特異性的條帶。由以上的酶活性測定結(jié)果和電泳分析結(jié)果可以得出結(jié)論居泉沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1基因能夠在大腸桿菌中進行有效的表達。
同時，通過PCR方法分別擴增含本發(fā)明的兩個基因(plA和plS)和一個基因(plA)的DNA片段(去除編碼信號肽的核苷酸序列后的基因序列)，以正確的可讀框插入畢赤酵母表達載體pPIC9，構(gòu)建了兩個畢赤酵母重組質(zhì)粒pPIC-PL-AS和pPIC-PL-A。用本領(lǐng)域熟知的電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母GS115細胞中，獲得兩個重組酵母GS115/pPIC-PL-AS和GS115/pPIC-PL-A。搖瓶發(fā)酵試驗的結(jié)果表明以上構(gòu)建的兩個重組酵母的發(fā)酵液上清中的磷脂酶A1活力比較接近，表明plS基因沒有提高plA基因在畢赤酵母中的表達量，plS基因在畢赤酵母表達磷脂酶A1中的作用，還有待于進一步探討。
重組酵母的發(fā)酵上清液通過透析、Sepharose Q Fast Flow柱層析和超濾管濃縮獲得分子量為35kDa，純度提高8.5倍的電泳均一的磷脂酶A1，這樣得到的酶制品比活力達到23.13U/mg。用以上的35kDa蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將電泳后的凝膠放在蛋黃固體瓊脂平板上，37℃反應(yīng)16h左右可看到平板上出現(xiàn)白色沉淀條帶。與SDS-PAGE凝膠上顯示的條帶比較，發(fā)現(xiàn)條帶的位置和數(shù)目相同，可以確定以上純化得到的35kDa蛋白確為磷脂酶。
在不同溫度下按常規(guī)法測定磷脂酶A1活力，由溫度-酶活力曲線可以看到畢赤酵母表達的磷脂酶A1的最適作用溫度范圍為20～35℃，在此范圍內(nèi)酶活力可保持在85％以上。10℃保溫30min后仍具有70％的酶活力，而55℃處理30min酶活力完全喪失。由60℃下酶活力變化曲線可以看出在60℃下熱處理10min，可導(dǎo)致酶活力損失86％，表明重組磷脂酶A1對熱較敏感，是典型的低溫磷脂酶。按常規(guī)法測定酶活力。由pH-酶活力曲線和pH穩(wěn)定性曲線可以看到重組磷脂酶A1的最適pH值為9.0；在pH6～10的范圍內(nèi)酶活力維持在75％以上?？梢娫撁笧榈蜏貕A性磷脂酶。實驗證明僅Ca2+對酶有激活作用，其它測試的金屬離子和化學(xué)試劑對酶都有不同程度的抑制作用。酶學(xué)性質(zhì)的測定結(jié)果證明重組酵母表達低溫堿性磷脂酶A1活性，其在低溫條件下具有良好的活性和穩(wěn)定性。該重組磷脂酶A1的最適反應(yīng)溫度為35℃，最適反應(yīng)pH為9.0，在作用溫度為20～35℃、pH6～10可水解卵磷脂產(chǎn)生溶血磷脂和脂肪酸。
本發(fā)明涉及一種新的低溫堿性磷脂酶A1，在低溫下具有高的催化效率，適用于油脂精練和其他相關(guān)工業(yè)，可簡化生產(chǎn)工藝、節(jié)能降耗。構(gòu)建生產(chǎn)低溫堿性磷脂酶A1的工程菌為實現(xiàn)低溫酶產(chǎn)業(yè)化奠定了堅實的基礎(chǔ)。從耐冷居泉沙雷氏菌xjF1中獲得的磷脂酶A1基因由兩個開放閱讀框plA和plS組成。用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的重組DNA技術(shù)制備含有plA單基因的重組質(zhì)粒和含有plA、plS雙基因的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的這些重組質(zhì)粒用本領(lǐng)域熟知的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌和畢赤酵母，使重組大腸桿菌和重組酵母表達磷脂酶A1。因此本發(fā)明同時提供了一種通過遺傳工程和分子生物學(xué)手段，將本發(fā)明涉及的酶基因克隆到其它受體菌，由其它菌株在其它培養(yǎng)條件產(chǎn)生本發(fā)明涉及的磷脂酶A1。
按照本發(fā)明所述的磷脂酶A1，具有如下特性1.耐冷居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)xjF1或其它衍生菌產(chǎn)生。衍生菌是指轉(zhuǎn)化有本發(fā)明涉及的DNA片段的重組菌株。
2.具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列，編碼磷脂酶A1。
3.具有SEQ NO.2所示的氨基酸序列，是磷脂酶A1。
4.含有SEQ NO.1和SEQ NO.3所示的核苷酸序列的重組質(zhì)粒pET-PL-A、pET-PL-AS及重組大腸桿菌菌株BL21/pET-PL-A、BL21/pET-PL-AS。
5.含有SEQ NO.1和SEQ NO.3所示的核苷酸序列的重組質(zhì)粒pPIC-PL-A、pPIC-PL-AS及重組畢赤酵母GS115/pPIC-PL-A、GS115/pPIC-PL-AS。
6.具有磷脂酶A1活性，作用溫度20～35℃，pH9.0，分子量35000道爾頓。
本發(fā)明涉及的DNA序列，除了編碼本發(fā)明涉及的磷脂酶A1的SEQ NO.1外，還應(yīng)當(dāng)包括編碼對本發(fā)明的磷脂酶A1基因所表達的酶分子的氨基酸進行一個或多個氨基酸替換、插入或缺失所得到的功能類似物也能達到本發(fā)明所述的DNA核苷酸序列。因而本發(fā)明也包括編碼與SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性，優(yōu)選具有至少90％的同源性，但同時具有磷脂酶A1活性的功能類似物的DNA核苷酸序列。
通過實施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實現(xiàn)本發(fā)明內(nèi)容，可以達到以下有益效果1.定向篩選到一株磷脂酶A1產(chǎn)生菌-居泉沙雷氏菌xjF1，并克隆了其磷脂酶A1基因plA和plS。
2.含有兩個基因(plA和plS)的重組大腸桿菌的磷脂酶活力明顯高于含有一個基因(plA)的重組大腸桿菌，表明輔助蛋白基因plS能夠提高plA基因在大腸桿菌中的表達量。
3.構(gòu)建重組大腸桿菌BL21/pET-PL-AS和重組畢赤酵母GS115/pPIC-PL-AS，實現(xiàn)了磷脂酶A1基因在大腸桿菌和畢赤酵母中的成功表達，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)磷脂酶A1的表達量分別為7.1U/mL和41.8U/mL。
4.重組磷脂酶A1經(jīng)分離、純化和酶學(xué)特性的研究，證明是典型的低溫堿性磷脂酶A1。該酶的最適pH為9.0，最適作用溫度范圍為20～35℃，55℃保溫30min酶活力完全喪失。


圖1為居泉沙雷氏菌xjF1的系統(tǒng)進化樹。
圖2為PCR擴增居泉沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1基因片段的瓊脂糖凝膠電泳。
其中1代表雙引物擴增；2和3代表分別用兩個單引物進行的PCR擴增；4代表1kb DNA分子量標(biāo)準。
圖3A為居泉沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1基因的側(cè)翼序列的TAIL-PCR擴增產(chǎn)物。其中II、III分別為TAIL-PCR反應(yīng)中第2次反應(yīng)產(chǎn)物和第3次反應(yīng)產(chǎn)物，1-4顯示用4個不同的隨機簡并引物擴增得到的PCR產(chǎn)物。B為PCR擴增居泉沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1全長基因。
圖4為大腸桿菌重組質(zhì)粒pET-PL-AS和pET-PL-A的物理圖譜。
圖5為在大腸桿菌中表達的磷脂酶A1的SDS-PAGE。其中1代表蛋白標(biāo)準分子量；2代表含空質(zhì)粒的大腸桿菌對照菌；3代表含重組質(zhì)粒pET-PL-AS的大腸桿菌的細胞周質(zhì)部分；4代表含重組質(zhì)粒pET-PL-A的大腸桿菌的細胞周質(zhì)部分；箭頭示35kDa的表達蛋白條帶。
圖6為畢赤酵母重組質(zhì)粒pPIC-PL-AS和pPIC-PL-A的物理圖譜。
圖7為在畢赤酵母中表達的磷脂酶A1的SDS-PAGE。其中箭頭示分子量約35kDa的重組磷脂酶A1的表達蛋白條帶。
圖8為純化后的重組磷脂酶A1的SDS-PAGE電泳分析。其中M代表蛋白分子量標(biāo)準；1代表含重組質(zhì)粒pPIC-PL-AS的畢赤酵母發(fā)酵上清液；2代表純化后的重組磷脂酶A1。
圖9為磷脂酶A1的活性條帶印跡實驗。其中1代表活性染色；2代表考馬斯亮藍染色。箭頭示重組磷脂酶A1的表達蛋白條帶。
圖10A為溫度-酶活力曲線；B為60℃下酶活力變化曲線。
圖11A為pH-酶活力曲線；B為pH穩(wěn)定性曲線。
圖12為金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對重組磷脂酶A1活力的影響。
具體實施例實施例1低溫堿性磷脂酶A1產(chǎn)生菌的篩選1.菌種的分離篩選采集新疆天山一號冰川凍土，涂布于含有0.1％(NH4)2SO4，0.1％K2HPO4，1％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％FeSO4·7H2O，以1∶3比例混合的橄欖油和聚乙烯醇乳化液，2％瓊脂粉的油脂同化培養(yǎng)基上，20℃下培養(yǎng)24小時篩選到3株產(chǎn)生脂肪酶的菌株。挑選其中的細菌菌落涂布于蛋黃+TYSPN固體瓊脂培養(yǎng)基(4％葡萄糖，1％蛋白胨，5％酵母提取物，無菌蛋黃液，2％瓊脂粉，pH7.0)。菌株xjF1在油脂同化平板上形成黃色變色圈、在蛋黃+TYSPN固體瓊脂平板上形成不透明、云霧狀的暈圈。將菌株xjF1接入磷脂酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基(5.4％蛋白胨，2.6％酵母提取物，1.512％NaH2PO4·12H2O，0.3％K2HPO4，0.05％NaCl，0.0246％MgSO4·7H2O，0.00147％CaCl2，5×10-5％FeSO4·7H2O，0.1143％(NH4)2HPO4，0.5％木糖)和脂肪酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基(1.5％豆餅粉，3％玉米浸出液，0.5％葡萄糖，0.75％橄欖油，pH8.0)進行酶活性測定。實驗結(jié)果表明，菌株xjF1既有磷脂酶A1的活性，又有脂肪酶活性，它在不同的培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生磷脂酶和脂肪酶。
將菌株xjF1接種至LB培養(yǎng)基，分別于10℃、20℃、30℃和37℃下培養(yǎng)，每天測量菌落直徑，比較不同溫度下菌株的生長情況，結(jié)果見表1，由表1可知菌株xjF1的最適生長溫度范圍在20～30℃，屬于耐冷菌。耐冷菌株xjF1經(jīng)搖瓶試驗測得磷脂酶A1活力為17.5U/mL，且在4℃測定仍具有一定的酶活力，說明菌株xjF1產(chǎn)生低溫磷脂酶A1。
表1 菌株xjF1的生長菌落直徑單位cm

2.菌種鑒定(1)生理生化檢測根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)鑒定手冊》(《Bergey’s Manual of SystematicBacterio-logy》)第九版對菌株xjF1的形狀、大小、生理生化反應(yīng)進行檢測，產(chǎn)生本發(fā)明的低溫堿性磷脂酶A1的微生物菌種Serratia fonticola xjF1的生物學(xué)特性如表2所示表2 菌株xjF1的生物學(xué)特性

采用反相高效液相色譜法進行G+C含量測定，具體方法參照林萬明的《細菌分子遺傳學(xué)分類鑒定法》。本發(fā)明的低溫堿性磷脂酶A1的產(chǎn)生微生物S.fonticola xjF1的G+C克分子％為52.5％。
(2)16SrRNA序列分析以S.fonticola xjF1的基因組DNA為模板，16sRNAEP15’-CCGGATCCGTCGACAGAGTTTGATCTTGGCTCAG-3’和16sRNAEP25’-CCAAGCTTCTAGACGGITACCTTGTTACGACTT-3’為引物，進行PCR擴增，獲得的16SrRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比對，結(jié)果本發(fā)明的低溫堿性磷脂酶A1產(chǎn)生菌與Serratia fonticola UTAD54相似性最高為99％，表明二者的親緣關(guān)系最近。S.fonticola xjF1的16SrRNA基因序列如下1GCGGCAGGCC TAACACATGC AAGTCGAGCG GTAGCACAGG GAGCTTGCTCCTGGGTGACG AGCGGCGGAC GGGTGAGTAA TGTCTGGGAA ACTGCCCGAT101 GGAGGAGGGG GATAACTACT GGAAACGGTA GCTAATACCG CATAACGTCTTCGGACCAAA GTGGGGGACC TTCGGGCCTC ACACCATCGG ATGTGCCCAG201 ATGGGATTAG CTAGTAGGTG AGGTAATGGC TCACCTAGGC GACGATCCCTAGCTGGTCTG AGAGGAGGAT GACCAGCCAC ACTGGAACTG AGACACGGTC301 CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA TATTGCACAA TGGGCGCAAGCCTGATGCAG CCATGCCGCG TGTGTGAAGA AGGCCTTCGG GTTGTAAAGC401 ACTTTCAGCG AGGAGGAAGG GTTCAGTGTT AATAGCACTG TTCATTGACGTTACTCGCAG AAGAAGCACC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT501 ACGGAGGGTG CAAGCGTTAA TCGGAATTAC TGGGCGTAAA GCGCACGCAGGCGGTTTGTT AATGCAGATG TGAAATCCCC GAGCTTAACT TGGGAACTGC601 ATTTGAAACT GGCAAGCTAG AGTCTTGTAG AGGGGGGTAG AATTCCAGGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATCTGGAGG AATACCGGTG GCGAAGGCGG701 CCCCCTGGAC AAAGACTGAC GCTCAGGTGC GAAAGCGTGG GAGCAAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTC CACGCTGTAA ACGATGTCGA CTTGGAGGTT801 GTGCCCTTGA GGCGTGGCTT CCGGAGCTAA CGCGTTAAGT CGACCGCCTGGGGAGTACGG CCGCAAGGTA AAACTCAAAT GAATTGACGG GGGCCCGCAC901 AAGCGGTGGA GCATGTGGTT TAATTCGATG CAACGCGAAG AACCTTACCTACTCTTGACA TCCACAGAAC TTTCCAGAGA TGGATTGGTG CCTTCGGGAA1001 CTGTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTT GTGAATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCTTA TCCTTTGTTG CCAGCGCGTC
1101 ATGGCGGGAA CTCAAGGAGA CTGCTGGTTG ATAAACCGGA GGAAGGTGGGATGACGTCAA GTCATCATGG CCCTTTACGA GTAGGGCCTA CACCACGTGC1201 TACAT各項實驗結(jié)果都表明菌株xjF1為居泉沙雷氏菌菌株(Serratia fonticola)中的成員，根據(jù)相鄰連接方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，參見附圖1。
實施例2S.fonticola xjF1產(chǎn)生的酶的活力測定低溫堿性磷脂酶A1活性測定采用KOH電位滴定法(即改良的Kawauchi法)。底物卵磷脂的配制也是參照Kawauchi法(Biochimica et Biophysica acta，142～159，1971)。卵磷脂500mg，溶于10mL乙醚中，加入雙蒸水20mL混勻，65℃水浴25min，以除去乙醚，再加入雙蒸水20mL，置于超聲波發(fā)生器中冰浴乳化40min，加入1mol/L NaCl 10mL，0.01mol/L CaCl210mL，0.01mol/L脫氧膽酸鈉10mL，攪拌溶解后用蒸餾水定容至100mL，最后用1.0mol/L NaOH將pH值調(diào)至8.2～8.5，置于4℃保存，時間不超過48h。每次測定取底物溶液10mL，待測酶液200uL，37℃反應(yīng)30min后，加入95％乙醇6mL終止反應(yīng)，以5mmol/L KOH標(biāo)準溶液滴定由酶釋放出的游離脂肪酸，至pH8.2為滴定終點。
磷脂酶活力(U/mL)＝(V1-V2)/V×N×1000式中V1-待測樣品消耗的KOH體積(mL)V2-空白對照消耗的KOH體積(mL)V-加入的待測酶液體積(200uL)N-KOH的摩爾濃度(5mmol/L)脂肪酶活性測定參照中華人民共和國輕工業(yè)部部頒標(biāo)準GB/T1803-93(2002)采用NaOH滴定法。發(fā)酵液經(jīng)12000rpm離心5min，以上清液作為粗酶液進行酶活力的測定。于100mL具塞三角瓶中分別加入5mL0.025mol/L磷酸緩沖液和4mL聚乙烯醇橄欖油乳化液，置于37℃水浴中保溫5min，然后在樣品瓶中加入1mL粗酶液，從加入酶液開始精確計算時間，繼續(xù)保溫15min，取出后立即加入95％乙醇15mL，以停止酶作用，再加酚酞指示劑3滴，用0.05N NaOH標(biāo)準溶液滴定至溶液微紅色并保持30sec不褪為其終點，記下消耗的NaOH的量。脂肪酶的活力單位采用國際單位(IU)在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1umol脂肪酸的酶量定義為-個酶活力單位。酶活力的計算公式如下脂肪酶活力(U/mL)＝10/3×(B-A)×n式中B-待測樣品消耗的NaOH體積(mL)A-空白對照消耗的NaOH體積(mL)n-稀釋倍數(shù)實施例3S.fonticola xjF1的磷脂酶A1基因的克隆1.居泉沙雷氏菌xjF1基因組DNA的提取用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備居泉沙雷氏菌xjF1的基因組DNA。居泉沙雷氏菌xjF1在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)16h后，離心棄上清。取50mg菌泥加500uL無菌水清洗。離心后的沉淀重懸于溶菌酶混合液，37℃溫育30min，再加入10％SDS至終濃度為2％。12000rpm離心5min后的上清用等體積酚、酚∶氯仿和氯仿依次抽提。取上層溶液加入異丙醇，室溫沉淀20min，12000rpm離心20min，棄上清，DNA沉淀用無菌水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.PCR擴增磷脂酶A1基因片段根據(jù)NCBI上已公布的細菌磷脂酶和脂肪酶的基因序列的保守區(qū)設(shè)計了-對特異性引物(5B5’-TGGCGTTACTGGCCAAGGACGT-3’和3b5’-CATGGTTTTTGCTCCGCCATCG-3’)，以居泉沙雷氏菌xjF1基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為94℃變性5min，1個循環(huán)；94℃變性30s，58℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。
將PCR擴增出的大小約為750bp的DNA片段連接到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選出陽性克隆子，再通過單酶切進行插入片段大小的驗證，最后用SP6和T7引物進行序列測定。測序結(jié)果表明，擴增的750bp的DNA片段確為磷脂酶A1基因片段，參見附圖2。
3.利用TAIL-PCR技術(shù)獲得磷脂酶A1全長基因根據(jù)已獲得的磷脂酶A1部分基因序列設(shè)計了6個與其邊界距離不等的嵌套的特異性引物T1-T6T1 5’-CTCATGCGCGAAAAGCCCTC-3’、T2 5’-GAAAGCCAGCACATAGTGCTGC-3’、T3 5’-GCAATCGCCACGGCATGATTG-3’、T4 5’-CCGATCATACTCTGAACCGTTTCG-3’、T5 5’-GATCGCAGCATGACGGCACATG-3’T6 5’-GATGGCGGAGCAAAAACAGAGAAAAGAACAT-3’)它們分別與11個隨機簡并引物(AD1-AD11)組合，以居泉沙雷氏菌xjF1基因組DNA為模板，進行TAIL-PCR反應(yīng)。經(jīng)過3次連續(xù)的PCR循環(huán)，利用不同的退火溫度選擇性擴增目標(biāo)片段，最后回收第3次PCR反應(yīng)的產(chǎn)物，直接送上海博亞生物技術(shù)公司測序。測序結(jié)果表明，引物T3、T2和T1分別與AD引物組合，通過分級反應(yīng)擴增得到的大小約為700bp和900bp的特異性片段都包含了750bp的已知序列和起始密碼子ATG所處的5’端序列。只改變不對稱溫度循環(huán)中的退火溫度，使用特異性引物T4、T5和T6進行的TAIL-PCR擴增得到1050bp和1150bp長度不同的特異性產(chǎn)物。經(jīng)序列測定，我們發(fā)現(xiàn)擴增的這些特異性片段都包含了750bp的已知序列和終止密碼子TGA所處的3’端序列。TAIL-PCR產(chǎn)物分析的結(jié)果參見附圖3A。將750bp已知序列和用TAIL-PCR方法擴增得到的750bp已知序列的兩側(cè)序列進行拼接，就獲得了完整的磷脂酶A1基因的核苷酸序列，參見附圖3B。
實施例4磷脂酶A1基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達1.大腸桿菌重組質(zhì)粒的構(gòu)建以S.fonticola xjF1的基因組DNA為模板，采用引物plAS-f(5’-GGAGATCTTATGAGTTTGCCTTTGAG-3’，含BglII酶切位點)和plA-r(5’-TAGCGGCCGCTTAGGCATTCGCCTT-3’，含Not I酶切位點)，PCR擴增含有plA基因的DNA片段。反應(yīng)條件為95℃變性3min，1個循環(huán)；94℃變性30sec，50℃復(fù)性30sec，72℃延伸2min，32個循環(huán)，再進行72℃延伸10min?；厥誔CR產(chǎn)物用BglII/NotI雙酶切，酶切片段回收純化后與經(jīng)BamH I/Not I雙酶切的pET-22b(+)載體連接，獲得大腸桿菌重組質(zhì)粒pET-PL-A，參見附圖4，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定后獲得陽性克隆BL21/pET-PL-A。
為了考察輔助蛋白基因(plS)在磷脂酶A1原核表達中的作用，以plAS-f和plAS-r(5’-TTTAAGCTTTCAAGGCTGAGTATAGTGC-3’，含HindIII酶切位點)為引物，PCR擴增包含plA和plS兩個基因的DNA片段。PCR反應(yīng)條件95℃變性3min，1個循環(huán)；94℃變性30sec，54℃復(fù)性30sec，72℃延伸2min10sec，32個循環(huán)，再進行72℃延伸10min?；厥誔CR產(chǎn)物用BglII/HindIII雙酶切，酶切片段回收純化后與經(jīng)BamH I/HindIII雙酶切的pET-22b(+)載體連接，獲得重組質(zhì)粒pET-PL-AS，參見附圖4，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，提質(zhì)粒和進行酶切鑒定，獲得陽性克隆BL21/pET-PL-AS。
2.磷脂酶A1基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達重組大腸桿菌在含有100ug/mL氨芐的LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，以1％接種量轉(zhuǎn)接于8mL的LB培養(yǎng)基中(含氨芐)，200rpm培養(yǎng)至OD600在0.6-0.8，再加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，離心收集菌體和上清液。上清液用于酶活性測定，菌體用50mmol/LTris-Cl(pH8.0)緩沖液懸浮，采用超聲波法破碎。破碎后的菌體再離心獲得的上清液用于酶活性測定和SDS-PAGE分析。酶活性測定結(jié)果見表3。
表3 重組大腸桿菌的酶活性測定結(jié)果

由表3可知含有兩個基因的重組大腸桿菌BL21/pET-PL-AS和含有一個基因的重組大腸桿菌BL21/pET-PL-A菌液上清中的磷脂酶活力均低于細胞周質(zhì)中的，表明磷脂酶A1基因在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物絕大部分位于細胞周質(zhì)中，只有少量在上清液中。由表3我們還可以看到無論是菌液上清還是細胞周質(zhì)中，含有兩個基因的重組大腸桿菌的磷脂酶活力都明顯高于含有一個基因的重組大腸桿菌，表明plS基因能夠提高plA基因在大腸桿菌中的表達量。
所有的可溶性蛋白進行SDS-PAGE電泳分析參見附圖5，結(jié)果表明上清液無明顯的蛋白條帶，而周質(zhì)部分有明顯的表達蛋白條帶。重組大腸桿菌BL21/pET-PL-AS和BL21/pET-PL-A經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在分子量約35kDa的位置均出現(xiàn)了特異的蛋白條帶，而含有pET-22b(+)空質(zhì)粒的對照菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在同一位置上沒有特異的條帶。以上的電泳分析結(jié)果和酶活性測定結(jié)果均證明磷脂酶A1基因在大腸桿菌中能有效地表達。
實施例5磷脂酶A1基因在畢赤酵母中的表達與分泌1.畢赤酵母重組質(zhì)粒的構(gòu)建以pplAS-f(5’TATACGTAGCTTCGTCACTCCCG-3’，含SnaB I酶切位點)和pplA-r(5’ATGCGGCCGCTTAGGCATTCGCCTT-3’，含Not I酶切位點)為引物，以S.fonticola xjF1基因組DNA為模板，采用高保真pfuTaq酶PCR擴增不帶信號肽的plA基因的DNA片段。PCR反應(yīng)條件95℃變性3min，1個循環(huán)；94℃變性30sec，53℃復(fù)性30sec，72℃延伸2min，32個循環(huán)，再進行72℃延伸10min?；厥誔CR產(chǎn)物用SnaB I/Not I雙酶切，與同樣雙酶切的pPIC9穿梭表達載體連接，構(gòu)建了畢赤酵母重組質(zhì)粒pPIC-PL-A，參見附圖6，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
通過PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒。使用兩個引物pplAS-f和pplAS-r(5’TAGCGGCCGCTCAAGGCTGAGTATA-3’，含Not I酶切位點)，以居泉沙雷氏菌xjF1基因組DNA為模板，PCR擴增不帶信號肽的含有plA和plS兩個基因的DNA片段。PCR反應(yīng)條件95℃變性3min，1個循環(huán)；94℃變性30sec，60℃復(fù)性30sec，72℃延伸3min30sec，32個循環(huán)，再進行72℃延伸10min?；厥誔CR產(chǎn)物用SnaB I/Not I雙酶切，與同樣雙酶切的pPIC9載體連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC-PL-AS，參見附圖6，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。通過PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒。
2.酵母的轉(zhuǎn)化和重組酵母的篩選將重組質(zhì)粒pPIC-PL-A和pPIC-PL-AS用Bgl II酶切線性化，以電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115中，在電轉(zhuǎn)化后的酵母細胞中加入500uL山梨醇溶液，涂布RDB平板。用無菌牙簽將RDB平板上單菌落酵母點種在MM和MD平板的相同位置上，30℃培養(yǎng)2d，在MD上生長良好而在MM上生長緩慢或不生長的克隆即為陽性克隆。從MD平板上挑取陽性克隆接種于BMGY液體培養(yǎng)基中，30℃、300rpm振蕩培養(yǎng)3d。5000rpm離心10min，去除BMGY培養(yǎng)液，菌體中加入原培養(yǎng)液1/3體積的誘導(dǎo)培養(yǎng)液BMMY(用0.5％甲醇代替BMGY中的甘油)，30℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3-5d。離心收集上清液，進行磷脂酶活力測定和SDS-PAGE電泳分析。酶活性測定結(jié)果表明不同的酵母陽性克隆在搖床水平上的表達量各不相同；含有兩個基因和含有一個基因的酵母陽性克隆GS115/pPIC-PL-AS和GS115/pPIC-PL-A的發(fā)酵液上清中磷脂酶活力較接近，表明plS基因沒有提高plA基因在畢赤酵母中的表達量，plS基因在畢赤酵母表達磷脂酶A1中的作用尚不十分清楚，還有待于進一步探討。
3.重組酵母產(chǎn)生磷脂酶A1的發(fā)酵培養(yǎng)將重組酵母接種在1L的三角瓶中培養(yǎng)28h后，添加0.5％甲醇誘導(dǎo)，每隔12小時取樣一次，測定菌體濕重和磷脂酶活力，并進行表達蛋白的SDS-PAGE電泳分析。試驗結(jié)果表明隨著誘導(dǎo)時間的延長發(fā)酵液中的磷脂酶活力逐漸提高，誘導(dǎo)60h左右發(fā)酵液中磷脂酶活力達到最高，為41.8U/mL。SDS-PAGE電泳分析，參見附圖7，表明發(fā)酵液中磷脂酶A1蛋白表達量隨著誘導(dǎo)時間的延長也在不斷積累，在分子量約35kDa處磷脂酶A1蛋白的表達條帶由不明顯逐漸變得明顯，參見附圖7。60h之后磷脂酶活力和表達產(chǎn)物積累量不再隨誘導(dǎo)時間的增加而增加，反而開始逐漸下降。兩個重組酵母GS115/pPIC-PL-A和GS115/pPIC-PL-AS的表達產(chǎn)物隨時間積累的曲線相同，說明磷脂酶A1的表達具有很好的穩(wěn)定性。
實施例6生產(chǎn)低溫堿性磷脂酶A1工程菌的核苷酸序列生產(chǎn)低溫堿性磷脂酶A1的工程菌，是含有下列核苷酸序列之一的原核細胞或真核細胞1)序列表中的SEQ NO.1和SEQ NO.3；2)編碼序列表中SEQ NO.2和SEQ NO.4蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ NO.1和SEQ NO.3限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在中度嚴謹條件下能與序列表中SEQ NO.1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
其中所述原核細胞或真核細胞優(yōu)選的為大腸桿菌和酵母細胞，也可以是其它的各種動植物細胞。可選用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種合適的表達載體，如市場銷售的各種質(zhì)粒、粘粒、噬菌體及病毒載體等?？梢灾苯訉⒌蜏貕A性磷脂酶A1基因序列直接連接于表達載體中表達調(diào)控序列下游，形成低溫堿性磷脂酶A1表達載體。包含本發(fā)明的分離的核酸分子的宿主細胞可以是常規(guī)使用的原核宿主細胞、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞等。
實施例7重組磷脂酶A1的柱層析純化重組酵母GS115/pPIC-PL-AS誘導(dǎo)培養(yǎng)60h后，收集發(fā)酵液上清，用25mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.8)4℃透析2天，其間更換4次緩沖溶液。將透析液以4℃、6000rpm離心20min，收集上清液。上樣至預(yù)先用Tris-HCl緩沖液清洗了2個柱床體積且平衡好的Sepharose Q Fast Flow層析柱上(10mL)，用含0至1.0mol/L NaCl的25mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.8)梯度洗脫20個柱床體積，洗脫速度為5.0mL/min，洗脫蛋白的保留體積為189.82mL。部分收集器分步收集洗脫液，每管約16mL，合并有酶活的各管。最后，用30kDa超濾管將合并酶液濃縮至200uL，進行SDS-PAGE電泳分析和活性染色分析。由附圖8可知重組酵母發(fā)酵液上清經(jīng)純化后，在分子量約35kDa的位置呈現(xiàn)單一的蛋白條帶。將純化的35kDa蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將電泳后的凝膠放在蛋黃固體瓊脂平板上，37℃反應(yīng)16h左右可觀察到白色沉淀條帶出現(xiàn)。與SDS-PAGE凝膠電泳顯示的條帶進行比較，它們的位置和數(shù)目相同，因此可以確定純化獲得的35kDa蛋白就是磷脂酶，參見附圖9。重組酵母的發(fā)酵液經(jīng)Sepharose Q Fast Flow柱層析一步法分離得到電泳均一的重組磷脂酶A1，比活力為23.13U/mg，純化倍數(shù)為8.5，酶活性得率為3.4％。
實施例8重組低溫磷脂酶A1酶學(xué)性質(zhì)的研究1.溫度對酶活力的影響和酶的熱穩(wěn)定性在pH9.0及分別在4℃、10℃、13℃、16℃、20℃、28℃、35℃、41℃、48℃、54℃、60℃、70℃、80℃和90℃溫度條件下，按常規(guī)方法測定酶活力。由附圖10A可見重組磷脂酶A1的最適作用溫度范圍為20～35℃。有趣的是，該酶在55℃保溫30min后完全失活，而在10℃保溫30min仍保持約70％的酶活力。
將酶液分別在40℃、50℃和60℃下保溫10min，15min，20min，30min，35min，40min，50min和60min，迅速冷卻，然后再調(diào)至35℃按常規(guī)法測定酶活力，與同時置于35℃的對照比較，求出剩余酶活。實驗結(jié)果表明50℃保溫15min，剩余酶活為16.9％，而60℃保溫15min，酶活力幾乎完全喪失。附圖10B顯示了重組磷脂酶A1在60℃下熱處理不同時間的酶活力變化，由附圖10B可知60℃下熱處理10min，可導(dǎo)致該酶活力損失86％。這說明重組磷脂酶A1對熱較敏感，屬于低溫磷脂酶A1。
2.pH對酶活力的影響和酶的pH穩(wěn)定性在pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和10.5的不同系列的緩沖液及35℃條件下，按常規(guī)方法分別測定酶活力，結(jié)果參見附圖11A。附圖11A表明重組磷脂酶A1最適作用pH為9.0。將酶液用不同pH值的緩沖液稀釋，在35℃保溫3h，再用pH9.0的Gly-NaOH緩沖液適當(dāng)稀釋，按常規(guī)法測定酶活力，以未保溫的相應(yīng)pH的稀釋酶液為對照。結(jié)果表明，在pH6-10的范圍內(nèi)重組磷脂酶A1的酶活力可維持在75％以上，參見附圖11B。可見重組磷脂酶A1是一種低溫堿性磷脂酶A1。
3.金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對酶活力的影響5mmol/L的各種金屬離子溶液和一定濃度的其它化學(xué)試劑分別與酶液混合在35℃保溫30min后，測定酶活力，以未加金屬離子和化學(xué)試劑的酶液為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5mmol/LCa2+對酶的激活作用最強，表明重組磷脂酶A1是Ca2+依賴型磷脂酶，其它測試的金屬離子和化學(xué)試劑對酶都有不同程度的抑制作用，參見附圖12。
4.重組磷脂酶A1的Km值及Vmax的測定根據(jù)實驗測定的磷脂酶A1的水解反應(yīng)初速度，確定測定磷脂酶A1的Km和Vmax的反應(yīng)時間為10min。重組磷脂酶A1與不同濃度的卵磷脂反應(yīng)10min后測定酶活力，卵磷脂濃度依次為2‰、1‰、0.5‰、0.25‰、0.125‰、0.0625‰和0.03125‰。按雙倒數(shù)作圖法(Lineweave-Burk法)將米氏方程改寫為1V=KmVmax×1[S]+1Vmax]]>以濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速度的倒數(shù)1/[v]為縱坐標(biāo)作圖，測得該重組磷脂酶A1對卵磷脂的Km值為1.82mg/mL，Vmax為9.09umol/mL·min。
序列表<110>新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所<120>一種低溫堿性磷脂酶A1及其編碼基因<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>963<212>DNA<213>居泉沙雷氏菌xjF1(Serratia fonticola xjF1)<400>1atgagtttgc ctttgagttt catctcgacg atgacgccca tcaccgctgc atctgcttcg60tcactcccgc ttcaagacgc aataaaacca gtccaaaccg acgagccaca ggtgacaaaa120gttgctgtgc cgctcccctc tgaaaatagt cgtaatgcac aaaacctgtt gaattcactg180actcgcgatc tctctgctgc ggtacctttg gccccaaggc tggagatgtc tcgtgggcaa240gagtctcagc agggcgatta ctctttggcg ctattggcca aggatgtcta caacctcact300gggcagggtg cagagggctt ttcgcgcatg agtgataacg atttgctgag tgttggcatt360gaccccgcaa gtttattgga tgcagcctca gggttacagg cgggtattta ttcgaataag420cagcactatg tgctggcttt cgctggtact aatgatatgc gcgattggct gagcaatgtg480cgtcaggcta cggggtacga cgatgtgcag tacaatcatg ccgtggcgat tgccaaaaat540gccaaagctg cgtttggtga cggcttagtg atcaccggcc attcgttggg gggagggttg600gcagcaacgg cggcgttggc aaccggttct ctggcggtaa cattcaacgc cgctggggtt660tccgatcata ctctgaaccg tttcggtatt aatccggctg cggcaaagca agatgcagaa720tctggcggga tccgtcgtta cagtgaacaa tacgatatgt tgacggggac gcaggagtcg780acctctctgc ttccagatgc tatcgggcat aaaataacca ttgccaacaa tgagactctg840agcggcactg atgcttggcg gccgagcaaa tatctcgatc gcagcatgac ggcacatggc900atcgataagg taatcagttc aatggcggaa cagaagccat gggagatcaa ggcgaatgcc960taa 963
<210>2<211>320<212>PRT<213>居泉沙雷氏菌xjF1(Serratia fonticola xjF1)<400>2Met Ser Leu Pro Leu Ser Phe Ile Ser Thr Met Thr Pro Ile Thr Ala15 10 15Ala Ser Ala Ser Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ile Lys Pro Val Gln20 25 30Thr Asp Glu Pro Gln Val Thr Lys Val Ala Val Pro Leu Pro Ser Glu35 40 45Asn Ser Arg Asn Ala Gln Asn Leu Leu Asn Ser Leu Thr Arg Asp Leu50 55 60Ser Ala Ala Val Pro Leu Ala Pro Arg Leu Glu Met Ser Arg Gly Gln65 70 75 80Glu Ser Gln Gln Gly Asp Tyr Ser Leu Ala Leu Leu Ala Lys Asp Val85 90 95Tyr Asn Leu Thr Gly Gln Gly Ala Glu Gly Phe Ser Arg Met Ser Asp100 105 110Asn Asp Leu Leu Ser Val Gly Ile Asp Pro Ala Ser Leu Leu Asp Ala115 120 125Ala Ser Gly Leu Gln Ala Gly Ile Tyr Ser Asn Lys Gln His Tyr Val130 135 140Leu Ala Phe Ala Gly Thr Asn Asp Met Arg Asp Trp Leu Ser Asn Val145 150 155 160Arg Gln Ala Thr Gly Tyr Asp Asp Val Gln Tyr Asn His Ala Val Ala165 170 175Ile Ala Lys Asn Ala Lys Ala Ala Phe Gly Asp Gly Leu Val Ile Thr180 185 190
Gly His Ser Leu Gly Gly Gly Leu Ala Ala Thr Ala Ala Leu Ala Thr195 200 205Gly Ser Leu Ala Val Thr Phe Asn Ala Ala Gly Val Ser Asp His Thr210 215 220Leu Asn Arg Phe Gly Ile Asn Pro Ala Ala Ala Lys Gln Asp Ala Glu225 230 235 240Ser Gly Gly Ile Arg Arg Tyr Ser Glu Gln Tyr Asp Met Leu Thr Gly245 250 255Thr Gln Glu Ser Thr Ser Leu Leu Pro Asp Ala Ile Gly His Lys Ile260 265 270Thr Ile Ala Asn Asn Glu Thr Leu Ser Gly Thr Asp Ala Trp Arg Pro275 280 285Ser Lys Tyr Leu Asp Arg Ser Met Thr Ala His Gly Ile Asp Lys Val290 295 300Ile Ser Ser Met Ala Glu Gln Lys Pro Trp Glu Ile Lys Ala Asn Ala305 310 315 320<210>3<211>756<212>DNA<213>居泉沙雷氏菌xjF1(Serratia fonticola xjF1)<400>3atgcctaaaa ggtggtgcag aggctgctgg atagcggctc tcgttttgcc cctgtttggg60atcgctggat tattgatggt agccaaggag cactatatgg aacagcaaac ttcgccattt120gcgggtaccg atatcctgtc tttatcacag gcggtggctg aagatgacgt ttggcaaatt180agccagcaag caacggctga acggcaacat gtgcggggag atttgcagat cacactgttg240cagtgggcga ttctgcagca gaggccaggc agtgtacagg cattgataca ggcgggggca300gatattgggc aaccaggtat ggagggcaac ggggcattgc atacggcggc gatggttaag360
gatgcgcaat atttacgctt gttattgcaa caggctcccc aggttaatat gcgtaatctg420gtcactgctg ctacgccatt agccgctgcc gtgctggcgg ggcgggagga gcaggtgcgt480atgctgttga atgccggggc tgatagtaca ttgagtgaca gagtggggga tacgcccttg540cacctggccg caaaaatcaa cgcaccacag ttggcgctgc tcctgttaca aacgggggct600gatgccaagg cacaaaatca gcaagggaga acgttccagt attactttgc ccagacgcca660gtgcatttgc agaatagtga gttgcgtgag cagtaccgtc aattggagag ctggctcaaa720agtcagcaat tggccgggca ctatactcag ccttga 756<210>4<211>251<212>PRT<213>居泉沙雷氏菌xjF1(Serratia fonticola xjF1)<400>4Met Pro Lys Arg Trp Cys Arg Gly Cys Trp Ile Ala Ala Leu Val Leu15 10 15Pro Leu Phe Gly Ile Ala Gly Leu Leu Met Val Ala Lys Glu His Tyr20 25 30Met Glu Gln Gln Thr Ser Pro Phe Ala Gly Thr Asp Ile Leu Ser Leu35 40 45Ser Gln Ala Val Ala Glu Asp Asp Val Trp Gln Ile Ser Gln Gln Ala50 55 60Thr Ala Glu Arg Gln His Val Arg Gly Asp Leu Gln Ile Thr Leu Leu65 70 75 80Gln Trp Ala Ile Leu Gln Gln Arg Pro Gly Ser Val Gln Ala Leu Ile85 90 95Gln Ala Gly Ala Asp Ile Gly Gln Pro Gly Met Glu Gly Asn Gly Ala100 105 110Leu His Thr Ala Ala Met Val Lys Asp Ala Gln Tyr Leu Arg Leu Leu115 120 125
Leu Gln Gln Ala Pro Gln Val Asn Met Arg Asn Leu Val Thr Ala Ala130 135 140Thr Pro Leu Ala Ala Ala Val Leu Ala Gly Arg Glu Glu Gln Val Arg145 150 155 160Met Leu Leu Asn Ala Gly Ala Asp Ser Thr Leu Ser Asp Arg Val Gly165 170 175Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Ile Asn Ala Pro Gln Leu Ala180 185 190Leu Leu Leu Leu Gln Thr Gly Ala Asp Ala Lys Ala Gln Asn Gln Gln195 200 205Gly Arg Thr Phe Gln Tyr Tyr Phe Ala Gln Thr Pro Val His Leu Gln210 215 220Asn Ser Glu Leu Arg Glu Gln Tur Arg Gln Leu Glu Ser Trp Leu Lys225 230 235 240Ser Gln Gln Leu Ala Gly His Tyr Thr Gln Pro245 250
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生低溫堿性磷脂酶A1的耐冷居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)CGMCC.No.1971及其衍生菌。
2.一種低溫堿性磷脂酶A1，其特性在于，該低溫堿性磷脂酶A1分子量為35000道爾頓，最適作用溫度20～35℃，55℃保溫30min酶活力完全喪失；最適pH9.0，pH6～10可水解卵磷脂產(chǎn)生溶血磷脂和脂肪酸；Ca2+依賴型磷脂酶，其它金屬離子和化學(xué)試劑對酶都有抑制作用；對卵磷脂的Km值為1.82mg/mL，Vmax為9.09umol/mL·min。
3.一種低溫堿性磷脂酶A1基因序列，其特征在于如權(quán)利要求2所述的編碼磷脂酶A1，包含兩個開放閱讀框plA和plS，其中plA基因被證實編碼磷脂酶A1；plS基因編碼磷脂酶A1的輔助蛋白；plA和plS是兩個重疊基因，plS的起始密碼子位于plA的終止密碼子上游5bp的位置，兩個可讀框可以單獨進行轉(zhuǎn)錄。
4.一種如權(quán)利要求3所述SEQ NO.1核苷酸序列，其特征在于，plA基因全長963bp，編碼320個氨基酸，酶蛋白理論分子量為33.9kDa，其中1～54bp編碼低溫堿性磷脂酶A1信號肽，55～963bp編碼低溫堿性磷脂酶A1成熟肽。
5.一種如權(quán)利要求3所述SEQ NO.3核苷酸序列，其特征在于，plS基因編碼磷脂酶A1的輔助蛋白，包含756個核苷酸，編碼251個氨基酸，理論分子量為27.7kDa。
6.一種具有SEQ NO.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其特征在于，序列由320個氨基酸殘基組成，其中自C末端1～18氨基酸為低溫堿性磷脂酶A1信號肽序列，19～320氨基酸為低溫堿性磷脂酶A1成熟肽序列，193～197氨基酸(-Gly-X1-Ser-X2-Gly-)為脂肪酶和部分磷脂酶的保守五肽序列。
7.由SEQ NO.2衍生且與其氨基酸序列相同活性的蛋白質(zhì)，其特征在于，SEQNO.2氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加獲得。
8.具有SEQ No.2所示氨基酸80％以上同源性的氨基酸序列。
9.優(yōu)選與權(quán)利要求8所示氨基酸90％以上同源性的氨基酸序列，且具有與SEQNO.2相同活性的功能類似物。
10.低溫堿性磷脂酶A1基因在受體菌中表達獲得的重組質(zhì)粒和重組菌株。
11.含有如權(quán)利要求10中SEQ NO.1所示的重組質(zhì)粒和重組菌株，其特征在于，耐冷居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)CGMCC.No.1971的磷脂酶A1基因在大腸桿菌中表達并獲得大腸桿菌重組質(zhì)粒和重組菌株。
12.含有如權(quán)利要求10中SEQ NO.1所示的重組質(zhì)粒和重組菌株，其特征在于，耐冷居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)CGMCC.No.1971的磷脂酶A1基因在畢赤酵母中表達并獲得畢赤酵母重組質(zhì)粒和重組菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種耐冷居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)xjF1 CGMCC No.1971，通過對菌株特性、產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)的研究，探明了新的磷脂酶A
文檔編號C12N1/19GK101070530SQ20071010048
公開日2007年11月14日 申請日期2007年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月13日
發(fā)明者付建紅, 姚斌, 石玉瑚, 孟昆, 歐陽平凱, 袁鐵錚 申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所