專利名稱：電化學(xué)發(fā)光樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗原/抗體免疫測試中使用的標(biāo)記物及其制備方法， 特別地，涉及用核酸和電化學(xué)發(fā)光分子的結(jié)合物對免疫檢測進(jìn)行多標(biāo) 記的方法。
背景技術(shù)：
免疫分析方法由于具有高度的特異性、快速、簡便等優(yōu)勢，已廣 泛的應(yīng)用于生命科學(xué)，藥物分析，臨床診斷及環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域。由于免 疫反應(yīng)自身產(chǎn)生的物理變化非常微弱，難于檢測，通常在抗原或抗體 上標(biāo)記產(chǎn)生特異信號的物質(zhì)或分子，稱為標(biāo)記物。根據(jù)產(chǎn)生信號的不 同，標(biāo)記物可分為放射性同位素、熒光染料、電化學(xué)分子、酶、化學(xué) 發(fā)光物、電化學(xué)發(fā)光物等，其中最后兩類標(biāo)記物對應(yīng)的免疫測試在目 前具有最高的檢測靈敏度。然而，隨著對低豐度蛋白檢測的需求日益 迫切，進(jìn)一步提高免疫試驗的靈敏度成為研究的熱點。在免疫分析方 法中，檢測靈敏度的提高主要采取兩種手段 一是體外擴(kuò)增低豐度蛋 白； 一是增加信號分子的數(shù)量。前者在實際運用中難以實現(xiàn)，因為目 前的技術(shù)條件難以使蛋白質(zhì)像核酸(例如DNA)那樣，采用多聚 酶鏈反應(yīng)在體外擴(kuò)增。因此，增加信號分子的數(shù)量就成為提高蛋白質(zhì) 檢測靈敏度的主要突破口。在免疫分析過程中，信號分子通常是標(biāo)記 于抗體或抗原上，如何將更多的信號分子標(biāo)記于同一個抗原或抗體 上，使檢測信號得到增強(qiáng)，同時不影響抗原或抗體的識別性能，是最 大的難點之一。按照標(biāo)記物和被標(biāo)記蛋白之間聯(lián)結(jié)方式的不同，標(biāo)記 方法可分為共價標(biāo)記和非共標(biāo)記兩類。而根據(jù)標(biāo)記物與蛋白聯(lián)結(jié)位 點的數(shù)目，又可分為多個位點標(biāo)記和單個位點標(biāo)記。 一般而言，共價標(biāo)記的制備難度大于非共價標(biāo)記，單個位點標(biāo)記難于多個位點標(biāo)記。 其中單個位點多標(biāo)記的蛋白標(biāo)記方法由于在一個蛋白分子上引入了 多個標(biāo)記物，可大幅度地提高檢測信號。同時由于在目標(biāo)蛋白上只涉 及單個聯(lián)結(jié)位點，可最大限度地減少標(biāo)記物對目標(biāo)蛋白免疫活性的干 擾，因此兼顧了免疫測試的信號強(qiáng)度和特異性。
采用核酸進(jìn)行免疫測試標(biāo)記，在專利和科研文章中已有描述或報
道。在美國專利US4748111 (
公開日1988-05-31)中，Dattagupta等 人描述了一個用核酸作為信號分子載體對免疫測試進(jìn)行多標(biāo)記的方 法，其中核酸的3'端與免疫測試的蛋白質(zhì)通過共價鍵連接。在美國專 利US4921788 (
公開日1990-05-01)中，Deutsch描述了一個免疫測 試分析物的單鏈核酸類似物，可是該類似物與抗體結(jié)合后，失去了與 互補(bǔ)核酸的雜交能力，導(dǎo)致與核酸雙鏈特異性結(jié)合的信號分子的信號 下降。在美國專利US6280933 (公開曰:2001-08-28)中，Glazer等 人描述了一個用雙鏈核酸作為熒光分子載體對免疫測試進(jìn)行多標(biāo)記 的方法，其中的熒光分子是核酸嵌入劑并帶兩個正電荷。在美國專利 US6117631 (
公開日2000-09-12)中，Nilsen描述了一個特定的樹枝 狀核酸(DNAdendrimer)對免疫測試進(jìn)行多標(biāo)記的方法。另外，在美 國專利US5665539 (
公開日:1997-09-09)中，Sano等描述了一個稱 為免疫PCR(immuno-PCR)的方法，用核酸對免疫測試進(jìn)行標(biāo)記，然 后通過PCR對核酸標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增，最后通過核酸定量進(jìn)行免疫分析。 國內(nèi)目前還沒有這方面的專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要是針對現(xiàn)有技術(shù)以下幾個方面的不足進(jìn)行改進(jìn)1) 為了降低在抗體上標(biāo)記信號分子的難度，采用非共價的方式引入信號 分子載體；2)為了實現(xiàn)單個位點多標(biāo)記的策略，以核酸為信號分子 載體。簡言之，即是以核酸為信號分子載體，通過核酸的多個作用位 點引入大量的電化學(xué)發(fā)光信號分子，搭建一種由核酸/電化學(xué)發(fā)光分 子結(jié)合體構(gòu)成的鏈狀標(biāo)記物，用于免疫檢測。與常規(guī)的免疫測試比較， 本方法提供的標(biāo)記物中的信號分子不只一個，而是多個甚至幾十個，因此可以大幅度提高檢測信號的強(qiáng)度，明顯改善檢測靈敏度。與通過
化學(xué)合成方法制備的有機(jī)聚合物、樹枝狀有機(jī)分子(dendrimer)、無 機(jī)復(fù)合物和無機(jī)納米標(biāo)記物比較，本方法采用常規(guī)生化和化學(xué)試劑， 易于獲得，價格低廉，操作簡單，重復(fù)性好。
本發(fā)明的一個方面提供了一種樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物，其包含核酸、電 化學(xué)發(fā)光分子和蛋白質(zhì)/化合物，其中所述的電化學(xué)發(fā)光分子與作為 載體的核酸在多個位點結(jié)合形成信號標(biāo)記物，所述信號標(biāo)記物與蛋白 質(zhì)或化合物以非共價鍵方式連接，形成樹狀結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的第二個方面提供了所述樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的制備方法，其 包括下列步驟
(a) 提供核酸作為電化學(xué)發(fā)光分子的載體；
(b) 將多個電化學(xué)發(fā)光分子與所述核酸結(jié)合，形成高結(jié)合率的 結(jié)合物；和
(c) 將所述結(jié)合物作為信號標(biāo)記物，與蛋白質(zhì)或化合物以非共 價鍵方式聯(lián)結(jié)，用于免疫測試。
本發(fā)明的第三個方面提供了一種快速、簡便、有效且經(jīng)濟(jì)的免疫 分析方法，其除了本發(fā)明第二方面的步驟外，還包括下列步驟
(d) 測量標(biāo)記物的電化學(xué)發(fā)光信號，根據(jù)信號的強(qiáng)度對樣品進(jìn) 行定性或定量分析。
其代表性操作步驟是(見圖2):
(a) 按照常規(guī)操作，完成免疫反應(yīng)，其中最后一步的反應(yīng)物帶 有生物素標(biāo)記，
(b) 免疫反應(yīng)完成后，加入親和素或其類似物(avidin， streptavidin ， neutravidin )，
(c) 加入生物素修飾的核酸，通過生物素/親和素之間的非共價 鍵作用，完成對免疫測試的核酸標(biāo)記，
(d) 加入電化學(xué)發(fā)光核酸結(jié)合劑，如Ru(bpy)2(dppz)，使之與核 酸高比率地結(jié)合，完成對免疫測試的高標(biāo)記。
(e) 檢測電化學(xué)發(fā)光信號，根據(jù)信號強(qiáng)度的變化，對免疫測試 的樣品進(jìn)行定性或定量分析。本發(fā)明的第四個方面提供了一種以核酸/電化學(xué)發(fā)光分子結(jié)合物 為多標(biāo)記的免疫分析試劑盒，代表性試劑盒包括
(a) 生物素標(biāo)記的抗體或化合物；
(b) 親禾卩素或其類"[以物(avidin， streptavidin， neutravidin);
(c) 生物素修飾的核酸；
(d) 電化學(xué)發(fā)光核酸結(jié)合劑；和
(e) 用法說明書
在本發(fā)明的一個方面中，所提供的由核酸/電化學(xué)發(fā)光分子結(jié)合 物組成的樹狀免疫檢測標(biāo)記物，具有如下的特征
作為電化學(xué)發(fā)光信號分子載體的核酸是經(jīng)過修飾的脫氧核糖核 酸(ssDNA)，雙鏈脫氧核糖核酸(dsDNA)，單鏈核糖核酸(ssRNA)， 雙鏈核糖核酸(dsRNA)，雙鏈脫氧核糖核酸/核糖核酸(dsRNA/DNA)， 寡核苷酸(oligonucleotide)，核酸適配體(aptamer)，或肽核糖核酸 (peptide nucleic acid， PNA)。它們與被標(biāo)記的蛋白質(zhì)或化合物通過 非共價鍵方式連接。與美國專利4748111描述的共價連接比較，本方 法更具有普適性和可操作性。
在本發(fā)明的另一個方面中，所述結(jié)合物與蛋白質(zhì)或化合物的連結(jié) 方式為生物聯(lián)結(jié)。比如，可以通過生物素/親合素(biotin/avidin, biotin/streptavidin, biotin7neutravidin)之間的高特異性和高親和力的生 物結(jié)合作用，將核酸與蛋白質(zhì)或化合物連接。各種分子(包括核酸、 蛋白質(zhì)和化合物)的生物素(biotin)修飾已經(jīng)成為常規(guī)技術(shù)，操作 容易，費用低廉，結(jié)果重復(fù)可靠。
在本發(fā)明的又一個方面中，所述蛋白質(zhì)是抗原，半抗原，抗體及 或作為小分子抗原載體的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一個方面中，所述化合物為有機(jī)化合物、激素、類 固醇、碳水化合物、維生素、單糖、寡糖、脂類、氨基酸、肽、核苷、 核苷酸、寡核苷酸或其復(fù)合物。
在本發(fā)明的又一個方面中，所述的電化學(xué)發(fā)光分子為無機(jī)分子、 有機(jī)分子、無機(jī)/有機(jī)復(fù)合分子、無機(jī)聚合物、有機(jī)聚合物、無機(jī)/有機(jī)復(fù)合聚合物、無機(jī)顆粒物、有機(jī)顆粒物或無機(jī)/有機(jī)復(fù)合顆粒物。
在本發(fā)明的一個方面中，所述電化學(xué)發(fā)光分子為金屬/有機(jī)配體的 絡(luò)合物。在一個實施方案中，所述金屬/有機(jī)配體絡(luò)合物中的金屬為 釕或鋨。在另一個實施方案中，所述金屬/有機(jī)配體絡(luò)合物中的有機(jī)
配體為含氮的芳香族雜環(huán)(參見文獻(xiàn)Barton, JK. et al. /Jm.C/rem.Soc. 1990. 112:4960-4962.)。在本發(fā)明的一個實施方案中， 所述有機(jī)配體為聯(lián)吡啶、聯(lián)吡嗪、三聯(lián)吡啶、菲酚、酞氰染料、取代 的聯(lián)吡啶、取代的聯(lián)吡嗪、取代的三聯(lián)吡啶、取代的菲酚、二吡啶并 [3,2-a;2，，3，-c]吩嗪或鄰二單氮雜菲。
在本發(fā)明的一個方面中，所述電化學(xué)發(fā)光分子與核酸作用的結(jié)合 方式為嵌入、小溝結(jié)合、大溝結(jié)合或靜電作用。
本發(fā)明的核酸/電化學(xué)發(fā)光分子結(jié)合物可通過常規(guī)方法獲得，代表 性合成方法例子如下(如圖l所示)在一段核酸的末端連接9個連 續(xù)的脫氧胸腺嘧啶，再連接生物素。加入電化學(xué)發(fā)光核酸結(jié)合劑，如 RU(bpy)2(dppZ)，使之與核酸高比率地結(jié)合，形成以核酸為載體的高 標(biāo)記物。
利用本發(fā)明的方法標(biāo)記免疫測試的優(yōu)點是(1)以核酸為電化學(xué) 發(fā)光分子的載體，可大量引入信號分子，極大增強(qiáng)檢測的靈敏度；(2) 核酸與被標(biāo)記的蛋白質(zhì)或化合物通過非共價鍵方式連接，具有普適性 和可操作性；(3)蛋白質(zhì)單個位點的標(biāo)記可減少對其生物活性的影 響，極大地減少非特異性反應(yīng)；(4)核酸標(biāo)記物的制備方法簡單，實 驗成本低；(5)所有標(biāo)記試劑可單獨保存，使用前現(xiàn)配，可延長試劑 的保質(zhì)期。


圖1為核酸/電化學(xué)發(fā)光分子結(jié)合物。
圖2為核酸/電化學(xué)發(fā)光分子結(jié)合物作為標(biāo)記物用于免疫測試的示 意圖。
圖3是分別用核酸/電化學(xué)發(fā)光分子結(jié)合物作為信號標(biāo)記物，和用電 化學(xué)發(fā)光分子直接標(biāo)記，所得到的免疫測試結(jié)果。
具體實施例方式
實驗前材料準(zhǔn)備
1、 生物素標(biāo)記雙鏈寡核苷酸的制備
用2xSSC(0.3M檸檬酸鈉，30mM氯化鈉，pH7.0)緩沖液等比例 混合生物素標(biāo)記單鏈脫氧核糖核酸(Invitrogen， Carlsbad, CA)及其 互補(bǔ)核酸鏈(Invitrogen， Carlsbad， CA)，例如兩條鏈分別為鏈A: biotin-5，-TTT TTT TTT GCG GGT AAC GTC AAT ATT AAC TTT ACT CCC-3'， 鏈B: 5，-GGG AGT AAA GTT AAT ATT GAC GTT ACC CGC-3'。 95。C變性5分鐘，自然冷卻至室溫，以分光光度計確定雜 交后核酸的濃度。
2、 電化學(xué)發(fā)光分子(Ru-NHS)直接標(biāo)記抗體或蛋白分子 溶于碳酸鹽緩沖液中(50mM碳酸鈉，50mM碳酸氫鈉，pH9.15)
的小鼠免疫球蛋白G (mlgG)，羊抗小鼠免疫球蛋白G和鏈親和素 (SA)分別按照1:5.6的摩爾比與溶于二甲基亞砜中(DMSO)的 Ru-NHS (5mgRu-NHS/mLDMSO)混合，室溫反應(yīng)4小時，采用聚 丙烯酰胺凝膠脫鹽柱(Pierce, Rockford,IL)純化標(biāo)記抗體，分光光 度計檢測抗體濃度及Ru-NHS的標(biāo)記率。
3、 活化的生物素標(biāo)記抗體
稱取適量活化的生物素即生物素-N-羧基丁二酰亞胺酯(BNHS) 溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，終濃度為20mg BNHS/ml DMF。羊抗小鼠免疫球蛋白G按照1:5.6的摩爾比與BNHS混合溶 于碳酸鹽緩沖液中(50mM碳酸鈉，50mM碳酸氫鈉,pH9.15)，室溫 反應(yīng)4小時，采用聚丙烯酰胺凝膠脫鹽柱(Pierce, Rockford,IL)純 化標(biāo)記抗體，分光光度計檢測抗體濃度，HABA/Avidin試劑盒(Sigma， St. Louis, MO)檢測抗體的生物素標(biāo)記率。實施例1、小鼠免疫球蛋白G的包被條件優(yōu)化
分別取100^1濃度為0、 0.3、 1、 3、 10、 30、 100嗎/mL的Ru-NHS 標(biāo)記的小鼠免疫球蛋白G (Ru-mlgG)溶于含有50 mM碳酸氫鈉， pH值為9.6的緩沖液中，按照每孔100^1的用量包被96孔板，4°C 過夜。用含有50mM3-羥甲基-氨基甲垸，50mM氯化鈉和0.1。/。吐 溫20， pH值為8.0的緩沖液沖洗3次后，以Ru的最佳電化學(xué)發(fā)光檢 測條件，檢測電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化，以指示Ru-mlgG的飽和濃度， 并以該飽和濃度作為未標(biāo)記的mlgG的包被濃度。
實施例2、生物素標(biāo)記的羊抗小鼠免疫球蛋白G的實驗條件優(yōu)化
以優(yōu)化的mlgG包被條件包被mlgG, 4"過夜。洗滌3次后，加 入300^1含有1%牛血清白蛋白的磷酸緩沖液中，4。C過夜。洗滌3 次后，加入100pl濃度分別為O、 1.0、 3.2、 9.7、 29.0、 87.1、 261.3、 784.0、 2352.0)ig/mLRu-NHS標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(Ru-Ab)， 37°C，空 氣浴恒溫200rpm振蕩2小時；洗滌3次后，以Ru的最佳電化學(xué)發(fā) 光檢測條件，檢測電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化，以指示Ru-Ab的飽和濃 度，并以該飽和濃度作為生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG (BT-Ab)的工 作濃度。
實施例3、鏈親和素的實驗條件優(yōu)化
以優(yōu)化條件包被mlgG和BT-Ab后，分別加入100^1濃度為0、 0.01、 0.03、 0.09、 0.27、 0.82、 2.47、 7.40、 22.2(ig/mL白勺Ru-NHS 標(biāo)記的鏈親和素(Ru-SA)， 37°C，空氣浴恒溫200rpm振蕩2小時； 洗滌3次后，以Ru的最佳電化學(xué)發(fā)光檢測條件，檢測電化學(xué)發(fā)光強(qiáng) 度的變化，以指示Ru-SA的飽和濃度，并以該飽和濃度作為未標(biāo)記 的鏈親和素的工作濃度。
實施例4、生物素化雙鏈寡核苷酸及電化學(xué)發(fā)光分子的實驗條件優(yōu)化 以優(yōu)化條件包被mlgG、 BT-Ab和鏈親和素后，分別加入10(^1 濃度為0、 0.04、 0.12、 0.37、 1.11、 3.33、 10|aM的生物素化雙鏈寡核苷酸，37°C，空氣浴恒溫200rpm振蕩2小時；洗滌3次，分別加 入100ial濃度為O、 14、 27、 55、 110、 219、 438nM的電化學(xué)發(fā)光核 酸結(jié)合劑如Ru(bpy)2(dppz)，室溫，200rpm振蕩避光孵育IO分鐘。 或者按照一定比例預(yù)先混合生物素修飾的雙鏈DNA和核酸結(jié)合劑， 再與親和素在37T:，空氣浴恒溫200rpm振蕩反應(yīng)2小時。清洗多余 的結(jié)合劑。檢測電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化，以指示雙鏈寡核苷酸和電化 學(xué)發(fā)光結(jié)合劑的飽和濃度，并以此飽和濃度作為工作濃度。
實施例5、搭建免疫反應(yīng)體系
根據(jù)優(yōu)化條件，取30pig/mL小鼠免疫球蛋白G (mlgG)溶于含 有50mM碳酸氫鈉，pH值為9.6的緩沖液中，按照每孔100^1的用 量包被96孔板，4"C過夜。用含有50mM3-羥甲基-氨基甲烷，50 mM 氯化鈉和0.1%吐溫20，pH值為8.0的緩沖液沖洗3次后，加入300pl 含有1%牛血清白蛋白的磷酸緩沖液中，4。C過夜。洗滌3次后，加入 100^1生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG， 37°C，空氣浴恒溫200rpm振蕩2 小時；洗滌3次后，加入lOO[il親和素，37°C，空氣浴恒溫200rpm 振蕩2小時；洗滌3次。
實施例6、含有核酸/電化學(xué)發(fā)光分子結(jié)合物的標(biāo)記物與分析物反應(yīng)
洗滌后，加入100^1生物素修飾的雙鏈DNA， 37°C，空氣浴恒 溫200rpm振蕩2小時；洗滌3次，加入10(^1電化學(xué)發(fā)光核酸結(jié)合 劑如Ru(bpy)2(dppz)，室溫，200rpm振蕩避光孵育10分鐘。或者按 照一定比例預(yù)先混合生物素修飾的雙鏈DNA和電化學(xué)發(fā)光核酸結(jié)合 劑，再與親和素在37。C，空氣浴恒溫200rpm振蕩反應(yīng)2小時。
實施例7、以電化學(xué)發(fā)光分子直接標(biāo)記的鏈親和素檢測生物素化的羊 抗小鼠IgG作為實驗體系對照
按照實施例5的實驗步驟，取30ng/mL小鼠免疫球蛋白G (mlgG)溶于含有50mM碳酸氫鈉，pH值為9.6的緩沖液中，按照 每孔100W的用量包被96孔板，4"C過夜。用含有50mM3-羥甲基-氨基甲烷，50 mM氯化鈉和0.1。/。吐溫20， pH值為8.0的緩沖液沖 洗3次后，加入30(V1含有1%牛血清白蛋白的磷酸緩沖液中，4。C過 夜。洗滌3次后，加入100pl生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG， 37°C，空 氣浴恒溫200rpm振蕩2小時；洗滌3次后，加入100^1電化學(xué)發(fā)光 分子直接標(biāo)記的鏈親和素，37°C，空氣浴恒溫200rpm振蕩2小時； 洗漆3次。
實施例8、電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度檢測
清洗多余的電化學(xué)發(fā)光結(jié)合劑，檢測電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化，以 指示生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG的濃度。由圖三可見，檢測的電化學(xué) 發(fā)光信號強(qiáng)度與羊抗小鼠IgG的濃度之間存在對應(yīng)關(guān)系，而且用核酸 /電化學(xué)發(fā)光分子結(jié)合物作為信號標(biāo)記物，比用電化學(xué)發(fā)光分子直接 標(biāo)記，信號強(qiáng)度高出IO倍左右。
權(quán)利要求
1. 一種樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物，包含核酸、電化學(xué)發(fā)光分子和蛋白質(zhì)/化合物，其中所述的電化學(xué)發(fā)光分子與作為載體的核酸在多個位點結(jié)合形成信號標(biāo)記物，所述信號標(biāo)記物與蛋白質(zhì)或化合物以非共價鍵方式連接，形成樹狀結(jié)構(gòu)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物，其中所述核酸為單鏈脫氧核糖核酸，雙鏈脫氧核糖核酸，單鏈核糖核酸，雙鏈核糖核酸， 雙鏈脫氧核糖核酸/核糖核酸，寡核苷酸，核酸適配體，或肽核糖核
3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物，其中所述蛋白質(zhì)是抗 原，半抗原，抗體及或作為小分子抗原載體的蛋白質(zhì)；所述化合物為 有機(jī)化合物、激素、類固醇、碳水化合物、維生素、單糖、寡糖、脂 類、氨基酸、肽、核苷、核苷酸、寡核苷酸或其復(fù)合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物，其中所述結(jié)合物與蛋 白質(zhì)或化合物的連結(jié)方式為生物連結(jié)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物，其特征在于，所述結(jié) 合物與蛋白質(zhì)或化合物的連結(jié)方式為通過生物素/親合素的生物連 結(jié)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物，其中所述的電化學(xué) 發(fā)光分子為金屬/有機(jī)配體的絡(luò)合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物，其特征在于，所述 的金屬/有機(jī)配體絡(luò)合物中的金屬為釕或鋨。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物，其中所述電化學(xué)發(fā) 光分子與核酸作用的結(jié)合方式為嵌入、小溝結(jié)合、大溝結(jié)合或靜電作 用。
9. 一種制備權(quán)利要求l-8任意一項中的樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的方法，其包括下列步驟(a) 提供核酸作為電化學(xué)發(fā)光分子的載體；(b) 將多個電化學(xué)發(fā)光分子與所述核酸結(jié)合，形成高結(jié)合率的結(jié)合物；和(C)將所述結(jié)合物作為信號標(biāo)記物，與蛋白質(zhì)或化合物以非共 價鍵方式聯(lián)結(jié)，用于免疫測試。
10. —種用于免疫分析的試劑盒，其包括(a) 生物素修飾的抗體或化合物；(b) 親和素或其類似物； (C)生物素修飾的核酸(d) 電化學(xué)發(fā)光核酸結(jié)合劑；和(e) 用法說明書。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包含核酸、電化學(xué)發(fā)光分子和蛋白質(zhì)/化合物的樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物；制備該樹狀結(jié)構(gòu)分子的方法；以及形成該樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的免疫檢測試劑盒。其中所述的電化學(xué)發(fā)光分子與作為載體的核酸在多個位點結(jié)合形成高標(biāo)記率的信號標(biāo)記物，所述信號標(biāo)記物與蛋白質(zhì)或化合物以非共價鍵方式連接，形成樹狀結(jié)構(gòu)；所述的標(biāo)記方法可用于所有免疫測試(腫瘤標(biāo)志物、傳染性疾病、激素、心臟疾病、食品污染物、環(huán)境污染物等)，能顯著增加免疫檢測中信號分子的數(shù)目，大幅度提高檢測靈敏度。
文檔編號C12Q1/68GK101285833SQ20071010070
公開日2008年10月15日 申請日期2007年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月14日
發(fā)明者郭良宏 申請人:郭良宏