專利名稱：離子注入誘變甜菜早熟突變體的獲得及其驗(yàn)證技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)作物遺傳育種及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種利用離子注入誘變甜菜獲得早熟突變體及其驗(yàn)證技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國在80年代中期由中國科學(xué)院等離子體物理研究所余增亮研究員等一批科技工作者新開創(chuàng)的研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)了離子注入生命體的生物學(xué)效應(yīng)將各種不同離子注入細(xì)胞內(nèi)，通過電能質(zhì)的共同作用，不僅可以影響細(xì)胞的生理功能，更重要的是它可以使細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變；由于能量的作用和質(zhì)量的摻雜，會形成大量的自由基，能夠造成生命細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA氫鍵斷裂、雙鏈分開、染色體畸變等，從而誘導(dǎo)和激發(fā)細(xì)胞對DNA的修復(fù)和重組作用，導(dǎo)致生物體發(fā)生變異。是育種方法學(xué)的重要創(chuàng)新。
離子注入作物改良和生物效應(yīng)研究，是物理學(xué)和生物學(xué)相結(jié)合的新興的交叉學(xué)科，用離子注入對作物種子進(jìn)行離子束激發(fā)和誘變，可獲得損傷輕、突變率高、突變譜廣的統(tǒng)計結(jié)果，將預(yù)期的受控離子注入遺傳物質(zhì)某一薄層內(nèi)，通過能量交換、離子摻雜過程，引起基因突變和重組，在新的基礎(chǔ)上穩(wěn)定表達(dá)，以達(dá)到作物改良、獲得優(yōu)良品種的目的，這是一條提高作物產(chǎn)量、改進(jìn)品質(zhì)和抗性的行之有效的新途徑。近年來中國科學(xué)院等離子體物理研究所、安徽農(nóng)學(xué)院、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)等已將此技術(shù)應(yīng)用于水稻、棉花等育種領(lǐng)域，并有新品系通過鑒定并在生產(chǎn)上已推廣600萬畝，取得巨大經(jīng)濟(jì)效益。
中國科學(xué)院離子束生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室用離子束介導(dǎo)法將碳4循環(huán)紫玉米的總DNA導(dǎo)入水稻品種獲得了一批穩(wěn)定遺傳的變異株系，不僅根系發(fā)達(dá)，而且在莖干等部位表現(xiàn)出供體玉米的紫色性狀，其中農(nóng)藝性狀較好的8個株系的光合速率平均比早秈213提高84％。河南省離子束生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室用離子束介導(dǎo)法將兩個大豆品種的總DNA分別導(dǎo)入兩個小麥栽培品種獲得了兩個蛋白質(zhì)含量分別為20.46％和25.35％的高蛋白小麥株系。
實(shí)踐證明，離子束介導(dǎo)外源DNA的遺傳轉(zhuǎn)化為遠(yuǎn)緣、超遠(yuǎn)緣物種間的基因交流提供了一種途徑，為實(shí)現(xiàn)多基因的轉(zhuǎn)移和協(xié)調(diào)表達(dá)提供了可能性。
目前，由于諸多因素造成甜菜含糖量和產(chǎn)量下降，病害嚴(yán)重，為此急需解決提高甜菜產(chǎn)量、含糖量和抗病能力問題，解決早熟品種合理布局，但因甜菜育種種質(zhì)資源缺乏。甜菜育種通常通過雜交轉(zhuǎn)育產(chǎn)生新的基因源，存在周期太長，在沒有基因來源的情況下，無法獲得新的甜菜創(chuàng)新材料，這制約著甜菜育種的發(fā)展。在甜菜理化誘變領(lǐng)域，曾先后應(yīng)用航天、鈷60等誘變方法，但效果均不明顯。離子注入技術(shù)具有定向性、多樣性及安全性，有較高的突變率和較寬的突變譜。作為一種新的誘變源，在棉花、水稻、小麥、番茄、谷子等作物育種應(yīng)用上已取得了有效的進(jìn)展。在生物學(xué)研究領(lǐng)域中，如何優(yōu)化甜菜等經(jīng)濟(jì)作物種子，通過探討離子束作為誘變源，使甜菜種子內(nèi)部發(fā)生生理突變，提高突變酶活化，促使基因活化形成變異遺傳具有重要的意義。
DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)是通過利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA進(jìn)行間接選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)。該技術(shù)不僅可在早代進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，而且可克服再度利用隱性基因時的識別難問題，從而加速育種進(jìn)程，提高育種效率。歐美等國近年都投入巨資開展這方面的工作。已經(jīng)鑒定到水稻、小麥、玉米、棉花、大豆等作物的一些農(nóng)藝性狀分子標(biāo)記，利用分子標(biāo)記輔助選擇育種也取得進(jìn)展。對于探討離子束誘變甜菜后獲得的親本資源，通過分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證通過離子束誘變獲得親本資源的特性具有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前國內(nèi)外尚未對甜菜用離子束誘變技術(shù)進(jìn)行處理獲得相應(yīng)親本資源的現(xiàn)狀。本發(fā)明將離子注入誘變技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)有效地結(jié)合應(yīng)用在甜菜中，獲得甜菜早熟突變體親本基因源。
本發(fā)明提供了一種甜菜純合自交系7201親本材料，是一種多胚種子。
本發(fā)明還提供了一種利用離子注入誘變甜菜7201親本材料獲得優(yōu)良早熟突變體Y系-1材料及其驗(yàn)證技術(shù)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知，甜菜(Beta Vulgaris L)屬藜科(Chenopodiaceae)甜菜屬，是兩年生作物，栽培甜菜分為四個變種，分別為糖用、飼用、食用和葉用，根據(jù)甜菜類型的多樣性和植株形態(tài)、細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)特性所表現(xiàn)出的明顯差異，將其又分類為二倍體、單胚或多胚和花粉可育；四倍體、單胚或多胚和花粉可育。
具體的，本發(fā)明提供的甜菜7201親本材料，是經(jīng)發(fā)明人多年多點(diǎn)篩選出的穩(wěn)定的純合自交系、多胚種子，花粉可育，四倍體(4n＝36)，一般含糖率在16.1-17.3％，塊根產(chǎn)量3508kg/畝，生育期在185天左右，塊根根型為錐型，最大根莖為13.5cm左右(所在位置在塊根的1/4處)，根皮白色，根肉白色，根溝深淺中等，葉叢直立，葉片呈犁鏵型，葉緣中波，葉片綠色，葉叢高度63cm，葉片皺褶，千粒重29g，種株緊密型，花藥黃色。該純合自交系具有幼苗頂土能力強(qiáng)、易保苗、含糖率較高、適應(yīng)性較強(qiáng)的特點(diǎn)，是經(jīng)過多年育種工作選用的骨干自交系，其過氧化物酶同工酶譜圖和RAPD核酸電泳圖參見附圖1、2。
本發(fā)明提供的甜菜早熟突變體Y系-1按以下幾個步驟獲得(1)、通過不同的離子注入方式、能量和劑量應(yīng)用甜菜的試驗(yàn)，確定了獲得優(yōu)良甜菜早熟突變體的最佳離子注入方式、能量和劑量的具體方案；(2)、通過細(xì)胞學(xué)、過氧化物酶同工酶生理檢測和RAPD分子生物學(xué)的檢測、驗(yàn)證獲得甜菜親本資源屬早熟突變體。
本發(fā)明具體提供了一種利用離子注入誘變甜菜獲得優(yōu)良早熟突變體Y系-1材料。早熟突變體Y系-1材料獲得，通過利用提供的純合自交系7201親本材料，經(jīng)過上述提供的步驟而獲得甜菜早熟突變體。獲得的甜菜早熟突變體是一種四倍體(4n＝36)，含糖率在生育期165天時為17.3％，而對照為15.6％，與對照相比含糖積累提前20天，種株調(diào)查結(jié)果成熟期較對照純合自交系7201親本材料提前15-20天，其過氧化物酶同工酶譜圖和RAPD核酸電泳圖參見附圖1、2。
具體的，本發(fā)明通過選用甜菜純合自交系7201親本材料多粒干種子。以能量選用30-60Kev的N+離子進(jìn)行甜菜種子注入，其注入劑量為2×1016N+/CM2-7×1016N+/CM2，脈沖次數(shù)為40-60次。多粒種進(jìn)行破殼和未破殼處理。處理后的種子裝入紗布袋，用20℃溫水浸種18小時，人工精量點(diǎn)播。生育期觀察記載形態(tài)變化，通過綜合觀測其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、葉片過氧化物酶同工酶。收獲時測定春播、夏播母根長、寬、重及糖度。并于片真葉期取第五片葉進(jìn)行觀察低劑量離子注入對甜菜植株酶性變化及酶帶出現(xiàn)情況，并進(jìn)行同功酶和RAPD分子生物學(xué)的檢測。
本發(fā)明具體通過離子注入誘變甜菜7201親本材料，將在離子的一定能量范圍，按不同注入方式、不同注入劑量，并且選用不同類型的離子對試驗(yàn)材料進(jìn)行多種樣本的注入試驗(yàn)，本發(fā)明具體選用不同的N+能量20Kev、25Kev、30Kev、35Kev、40Kev、45Kev、50Kev、55Kev、60Kev、65Kev、70Kev；選用注入不同的劑量2×1016N+/cm2、3×1016N+/cm2、4×1016N+/cm2、5×1016N+/cm2、6×1016N+/cm2、7x1016N+/cm2、8×1016N+/cm2；選用不同脈沖次數(shù)30、35、40、45、50、55、60、65、70分別注入誘變甜菜7201親本材料。研究和分析以上不同作法對甜菜的生物學(xué)特性及品質(zhì)產(chǎn)生的影響和誘變效果，確定離子束注入的方式、能量范圍、注入劑量。確定了甜菜親本材料在離子注入作用下的生物效應(yīng)和作物改良的關(guān)系。
本發(fā)明設(shè)置了“離子束一次處理試驗(yàn)”、“離子束親本材料處理試驗(yàn)”和“早熟親本材料鑒定試驗(yàn)”及采種試驗(yàn)，先后進(jìn)行了130個處理項次，取得了2670個試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行了研究分析，證明了通過離子注入誘變甜菜可獲得優(yōu)良早熟突變體。
本發(fā)明已證明，通過甜菜離子注入誘變獲得親本材料的早熟性是諸多變異中出現(xiàn)次數(shù)最多的一種突變。離子注入甜菜種子收獲時，發(fā)現(xiàn)Y系-1處理的種子成熟期較對照和其它材料提前15天左右，為此在其第二年二代進(jìn)行動態(tài)含糖積累狀況測定，結(jié)果表明，Y系-1處理的含糖率在每年的9月4日達(dá)到17.3％，每年的9月14日之后仍在緩慢上升為17.4 5％，每年的9月24日為18.96％，而對照7201每年的含糖率同期9月4日只有15.6％，9月14日為16.0％，到9月24日才能達(dá)到17.3％，Y系-1處理的含糖率積累時間較對照樣提前了20天。
本發(fā)明獲得早熟突變體具體的步驟如下(1)、N+離子注入能量、劑量、方式實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選確定N+離子注入甜菜的能量、劑量、方式。選擇N+離子在離子的低能范圍，采用7201(多粒)、7201-1(多粒)、等材料及相應(yīng)的對照，按連續(xù)或間斷不同的脈沖方式、不同的劑量進(jìn)行多種的注入試驗(yàn)。通過發(fā)芽率、發(fā)芽勢，第一次篩選劑量、能量范圍的分析驗(yàn)證，證明了采用N+離子的30Kev-60Kev，連續(xù)脈沖或間斷脈沖方式，以2.0×1016N+/CM2-7.0×1016N+/CM2劑量注入甜菜品種可獲得早熟甜菜親本材料Y系-1。
(2)、通過田間對比種植試驗(yàn)，確定最佳離子注入能量、劑量和方式。對多個處理樣本安排相同環(huán)境條件的比較種植試驗(yàn)，從播種到收獲詳細(xì)記載處理材料的農(nóng)藝性狀和生物學(xué)性狀，對品質(zhì)性狀進(jìn)行測試分析、以確定最佳的34Kev N+離子，注入方式為連續(xù)脈沖，注入能量為4.0×1016N+/CM2、脈沖次數(shù)為40次或注入能量為6.0×1016N+/CM2、脈沖次數(shù)為60次，獲得優(yōu)良早熟甜菜親本材料Y系-1。
(3)、通過離子注入誘變優(yōu)良甜菜品種前后的變化，通過獲得早熟突變體親本材料與對照樣對比進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、過氧化物酶同工酶生理檢測和RAPD分子生物學(xué)的檢測，逐步純化有益變異株系，獲得的優(yōu)良早熟突變體親本材料Y系-1。具體通過葉片過氧化物酶同工酶檢測，尋找離子注入生物體后，產(chǎn)生的生物效應(yīng)和作物改良之間的關(guān)系，結(jié)合品質(zhì)檢測，篩選有突出誘變效果的處理材料，將母根保存，第二年收獲的種子分別進(jìn)行一年生種植，品質(zhì)檢測和處理種子的繁殖保存，篩選具有優(yōu)異性狀的親本材料，證實(shí)了獲得的優(yōu)良早熟突變體親本材料Y系-1。
(4)、通過試驗(yàn)驗(yàn)證，通過甜菜離子注入誘變產(chǎn)生的早熟突變體不僅在田間有穩(wěn)定的突變表現(xiàn)，通過RAPD分析證實(shí)了在DNA水平上也同樣存在差異。
本領(lǐng)域所熟知，DNA分子標(biāo)記(DNA Molecular markers)是物種遺傳變異在DNA水平上的直接反映，與傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記相比，它具有既不受生物的組織、器官、細(xì)胞類型及發(fā)育時期的影響，且數(shù)量豐富，穩(wěn)定性好，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)而廣泛地在資源與育種研究中得到利用。DNA是形態(tài)學(xué)、同工酶、核型特征的遺傳基礎(chǔ)，其位點(diǎn)和數(shù)量十分豐富，是準(zhǔn)確進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定的依據(jù)。
本發(fā)明以離子注入誘變技術(shù)獲得的甜菜早熟突變體Y系-1和未做誘變處理的材料7201為對照材料，提取DNA并進(jìn)行RAPD分析，選取800條RAPD隨機(jī)引物對Y系-1和對照組7201進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，Y系-1和對照之間在DNA水平上存在差異。從800條隨機(jī)引物中篩選到45條在Y系-1和對照中存在差異，存在差異的引物占所用引物數(shù)的5.6％，表明Y系-1和對照組相似性很高。本發(fā)明以離子注入誘變獲得的早熟突變體和未經(jīng)誘變處理的對照材料7201，將為構(gòu)建分子標(biāo)記作圖群體，定位與早熟性狀相關(guān)的基因奠定了堅實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。
本發(fā)明充分利用新疆地區(qū)光照充足地域廣的優(yōu)勢，實(shí)驗(yàn)室與田間試驗(yàn)交替進(jìn)行。
本發(fā)明經(jīng)過多年的試驗(yàn)研究表明，離子注入對甜菜有明顯的誘變效果，并與其它理化誘變效應(yīng)有明顯的區(qū)別，離子注入甜菜種子后出現(xiàn)早熟變異性狀。
N+注入甜菜葉片中過氧化物酶同工酶的動態(tài)研究表明，在單粒種處理中，隨著脈沖次數(shù)增多，酶的著色逐漸變淺。而在多粒種處理中，隨著脈沖次數(shù)和注入劑量的增多，酶的著色逐漸變深，其糖度和其它性狀值都有明顯增加。說明N+注入引起植物過氧化物酶同工酶活性發(fā)生變化，導(dǎo)致植物體內(nèi)源激素改變。分子圖譜也相應(yīng)出現(xiàn)了與大田地對照不同的譜帶，證明了其種子遺傳物質(zhì)發(fā)生了變化。同時也證明了離子注入對甜菜獲得早熟突變體具有廣泛的大田實(shí)用性。
通過本發(fā)明的技術(shù)方案，證明了離子注入對甜菜有明顯的誘變效果，并與其它理化誘變效應(yīng)有明顯的區(qū)別，達(dá)到以下有益效果1、離子注入甜菜種子后出現(xiàn)早熟變異性狀，獲得早熟親本創(chuàng)新材料Y系-1，獲得早熟親本基因源，較目前最早熟品種親本提前15-20天。
2、首次開展了N+離子注入甜菜種子誘變親本資源材料的研究，并分析研究了離子注的最佳能量、劑量，為作物改良、創(chuàng)新親本基因源提供了理論依據(jù)。
3、甜菜離子注入誘變產(chǎn)生的早熟突變體，不僅在田間有穩(wěn)定的突變表現(xiàn)，通過RAPD分析證實(shí)了在DNA水平上也同樣存在差異。表明N+離子注入誘變確實(shí)引發(fā)了DNA水平上的改變，這種變異是可遺傳的。


圖1為早熟突變體甜菜的葉片過氧化物酶譜帶。
圖2為RAPD隨機(jī)引物篩選擴(kuò)增條帶，圖中的1、3、5、7、9為離子注入早熟突變體Y系-1，2、4、6、8、10為對照7201，Mmaker引物順次為I20 H4L7 T2 P16。
具體實(shí)施例方式
下面，舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，則％皆指重量百分比。
本發(fā)明中涉及到概念簡要解釋如下RAPDRandom Amplified PolymorphicDNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA；DNA脫氧核糖核酸；M1為純合自交系群體自交繁殖第一代；M2為純合自交系群體自交繁殖第二代。
實(shí)施例1離子注入在甜菜育種中的誘變試驗(yàn)一選用本發(fā)明人擁有的甜菜優(yōu)良親本7201、7201-1多粒種干種子，以能量為35Kev的N+離子對甜菜種子注入，其注入劑量范圍為2×1016N+/cm2-7×1016N+/cm2。脈沖次數(shù)范圍為40-60次，進(jìn)行破殼和未破殼處理，分別設(shè)單、多粒種對照。處理后的種子裝入紗布袋。用20℃溫水浸種18小時，人工精量點(diǎn)播。生育期觀察記載形態(tài)變化。收獲時測產(chǎn)測糖。并進(jìn)行同工酶檢測。
1材料與方法1.1供試材料每處理3行，行長6米，株行距50×20cm，間比排列。
1.2將M1代種子進(jìn)行田間觀察鑒定。參試材料9份，小區(qū)長6米，3行區(qū)，株行距50×20厘米，重復(fù)三次，隨機(jī)區(qū)組。
1.3將3份M0種子以能量為35Kev的N+進(jìn)行了二次處理，注入劑量同上，脈沖次數(shù)為60次。每份材料4個處理，共12份處理材料，設(shè)對照、行長、間距同上，間比排列。
1.4生育期觀察記載形態(tài)變化，收獲時測定產(chǎn)量、含糖率、產(chǎn)糖量。開始每隔10天就地取樣測糖，觀察動勢含糖積累情況。
2.結(jié)果與分析通過離子注入對M1代一年生出苗率及葉片生長過程分析得知，N+注入甜菜種子后當(dāng)代的輻照損傷表現(xiàn)較為明顯，種子的萌發(fā)受到抑制，目測出苗率明顯較對照低。7201-1處理后，隨著注入劑量與脈沖次數(shù)的增加，除葉片數(shù)有減少趨勢外，葉長、葉寬、葉片鮮重等性狀值都有明顯增加。7201處理后，葉片數(shù)、葉長、葉片鮮重有明顯增加，以葉片鮮重尤為突出，從性狀調(diào)查結(jié)果表明，以注入劑量4×1016和脈沖次數(shù)40次或注入劑量6×1016和脈沖次數(shù)60次對葉片生長勢和生長量促進(jìn)最大。表明通過離子注入7201、7201-1多粒種和單粒種親本材料可獲得早熟突變體親本材料，見表1。
表1離子注入對葉部的影響

實(shí)施例2離子注入在甜菜育種中的誘變試驗(yàn)二材料與方法1.供試材料為甜菜優(yōu)良親本材料為7201和7201-1干種子，以能量分別為20Kev、25Kev、30Kev、35Kev、40Kev、45Kev、50Kev、55Kev、60Kev、65Kev、70Kev不同的N+注入甜菜種子，選用注入分別為2×1016N+/cm2、3×1016N+/cm2、4×1016N+/cm2、5×1016N+/cm2、6×1016N+/cm2、7×1016N+/cm2、8×1016N+/cm2不同的劑量，脈沖次數(shù)分別選用為30、35、40、45、50、55、60、65、70次。每處理3行，行長6米，株行距50×20cm，間比排列。
2.將M1代種子進(jìn)行田間觀察鑒定。參試材料9份，小區(qū)長6米，3行區(qū)，株行距50×20厘米，重復(fù)三次，隨機(jī)區(qū)組。
3.將3份7201和7201-1一年生M1種子以能量按上述設(shè)定不同的N+進(jìn)行了二次處理，注入劑量和脈沖次數(shù)同上。每份材料4個處理，共12份處理材料，設(shè)對照、行長、間距同上，間比排列。
生育期觀察記載形態(tài)變化，收獲時測定產(chǎn)量、含糖率、產(chǎn)糖量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析早熟性是諸多變異中出現(xiàn)次數(shù)最多的一種突變。離子注入甜菜種子M1種子收獲時，發(fā)現(xiàn)Y系-1處理的紅眼期較對照和其它材料提前15天左右，為此在其二代M2進(jìn)行動態(tài)含糖積累狀況測定，結(jié)果表明，Y系-1含糖率在每年的9月4日達(dá)到17.3％，之后仍在緩慢上升為17.45％、18.96％，而對照7201含糖率每年的9月4日只有15.6％，每年的9月14日時16.0％，到每年的9月24日才達(dá)到17.3％，Y系-1處理的含糖率積累時間較對照提前了20天。但從產(chǎn)量性狀看，其最終產(chǎn)量較對照下降28.6％。說明離子注入種子后，會出現(xiàn)電荷，能量、質(zhì)量的沉積，從而打破有機(jī)生物固有的統(tǒng)一平衡。
本試驗(yàn)及相關(guān)系列試驗(yàn)表明，通過按照不同的N+離子能量，不同的注入劑量，不同的脈沖次數(shù)注入甜菜進(jìn)行對比分析獲得的親本材料。確定以N+離子的能量為30-60Kev，注入劑量為2×1016N+/CM2-7×1016N+/CM2，脈沖次數(shù)為40-60次注入甜菜可明顯獲得甜菜早熟突變體。
實(shí)施例3葉片中過氧化物酶、同工酶和N+注入的關(guān)系過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶，它與作物的生長代謝有密切關(guān)系，從甜菜葉片的過氧化物酶譜帶的分析中，發(fā)現(xiàn)N+注入與對照的酶帶存在明顯差異，參見附圖1。從附圖1的圖譜上看，以字母編號B(單)4×1016、40次，C(單)4×1016、60次，H(多)6×1016、40次，I(多)4×1016、60次，L(多破)4×1016、60次處理均多了2條帶，G(多)4×1016、40次，M(多破)6×1016、60次處理多幾條帶。在單粒種處理中，隨著脈沖次數(shù)增多，酶的著色逐漸變淺。而在多粒種處理中，隨著脈沖次數(shù)和注入劑量的增多，酶的著色逐漸變深。無論是單粒種處理或多粒處理，都有雙帶增加的現(xiàn)象，其糖度和其它性狀值都有明顯增加。說明N+注入引起植物過氧化物酶同工酶活性發(fā)生變化，導(dǎo)致植物體內(nèi)源激素改變。
實(shí)施例4甜菜離子注入誘變早熟突變體的RAPD分子標(biāo)記篩選材料甜菜離子注入誘變早熟體Y系-1，未經(jīng)誘變的種質(zhì)材料7201和7201-1。
方法1.采用本領(lǐng)域熟知的CTAB法作為甜菜RAPD分子標(biāo)記研究的DNA提取方法。
2.PCR反應(yīng)采用常規(guī)PCR反應(yīng)程序，終反應(yīng)體積為25ul，95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性1min，37℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，44個循環(huán)后，在72℃條件下再延伸5min，達(dá)到了PCR擴(kuò)增。4℃條件下保存?zhèn)溆谩?br> 3.電泳及染色電泳條件采用1％瓊脂糖凝膠電泳；電壓3.5v/cm，溴乙錠染色，在Bio-Rad自動凝膠成像儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果。
4.統(tǒng)計以0、1為標(biāo)記，建立EXCEL分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫，0表示無條帶，1表示有條帶。
結(jié)果分析1.總DNA提取結(jié)果的檢測采用此方法其主帶整齊一致，無降解現(xiàn)象，符合進(jìn)行RAPD分析。
2.RAPD隨機(jī)引物篩選以Y系-1和對照7201為材料，采用本發(fā)明建立的的甜菜RAPD分子標(biāo)記技術(shù)體系，從800條RAPD引物中篩選出擴(kuò)增帶型有差異且清晰、穩(wěn)定的45條引物，參見附圖2。
參見附圖2可以看出離子注入誘變早熟體Y系-1在用引物AL17和BD3擴(kuò)增的結(jié)果有顯著的不同，表明Y系-1和7201存在著DNA水平上的差異。
3.帶型統(tǒng)計分析利用RAPD引物對實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行“指紋”分析。在相同遷移率位置上，以1、0標(biāo)記擴(kuò)增片段的有和無，形成每個材料對應(yīng)的指紋數(shù)碼。錄入EXCEL數(shù)據(jù)庫并管理，為甜菜分子標(biāo)記作準(zhǔn)備。
結(jié)論利用RAPD分子標(biāo)記擴(kuò)增Y系-1的DNA，經(jīng)多次重復(fù)，得出RAPD技術(shù)在甜菜研究中具有一定的穩(wěn)定性，可以作為構(gòu)建連鎖遺傳圖譜的分子標(biāo)記。
作為一種新的誘變源，離子注入誘變已在多種作物上取得成效。甜菜離子注入誘變產(chǎn)生的早熟突變體Y系-1，不僅在田間有穩(wěn)定的突變表現(xiàn)，通過RAPD分析證實(shí)了在DNA水平上也同樣存在差異。表明離子注入誘變確實(shí)引發(fā)了DNA水平上的改變，這種變異是可遺傳的。
在選用的800條引物中，只有45條在Y系-1和7201種表現(xiàn)出多態(tài)性，占所選引物的5.6％，這說明離子注入誘變并沒有引起誘變體廣泛的變異。
權(quán)利要求
1.一種甜菜純合自交系7201親本材料。
2.一種利用離子注入誘變權(quán)利要求1所述的親本材料獲得早熟突變體Y系-1。
3.如權(quán)利要求2所述的甜菜早熟突變體Y系-1，其特征在于，以N+離子的能量為30-60Kev，注入劑量為2×1016N+/CM2-7×1016N+/CM2，脈沖次數(shù)為40-60次注入甜菜而獲得甜菜早熟突變體。
4.如權(quán)利要求3所述的甜菜早熟突變體Y系-1，其特征在于，以N+離子的能量優(yōu)選為35Kev，注入劑量為4×1016N+/CM2，脈沖次數(shù)為40次注入甜菜而獲得優(yōu)良甜菜早熟突變體。
5.如權(quán)利要求3所述的甜菜早熟突變體Y系-1，其特征在于，以N+離子的能量優(yōu)選為35Kev，注入劑量為6×1016N+/CM2，脈沖次數(shù)為60次注入甜菜而獲得優(yōu)良甜菜早熟突變體。
6.如權(quán)利要求4或5任意所述獲得的優(yōu)良早熟突變體親本材料，其特征在于，通過葉片過氧化物酶同工酶檢測，結(jié)合品質(zhì)檢測，篩選有突出誘變效果的處理材料，將母根保存，第二年收獲的種子分別進(jìn)行一年生種植，品質(zhì)檢測和處理種子的繁殖保存，篩選具有優(yōu)異性狀的親本材料，逐步純化有益變異株系而獲得優(yōu)良早熟突變體親本材料。
7.一種優(yōu)良早熟突變體材料的驗(yàn)證技術(shù)，其特征在于，以N+離子注入誘變技術(shù)獲得的甜菜早熟突變體，不僅在田間有穩(wěn)定的突變表現(xiàn)，通過RAPD分析證實(shí)了在DNA水平上也同樣存在差異，離子注入誘變甜菜引發(fā)了DNA水平上的改變，這種變異是可遺傳的。
全文摘要
本發(fā)明提供了甜菜純合自交系7201親本材料，并公開了一種利用離子注入誘變甜菜7201親本材料獲得早熟突變體，通過離子注入甜菜種子后的田間種植獲得早熟突變體親本材料，不僅在田間有穩(wěn)定的突變表現(xiàn)，通過RAPD分析驗(yàn)證了在DNA水平存在差異，離子注入誘變甜菜確實(shí)引發(fā)了DNA水平上的改變。本發(fā)明具體通過在甜菜作物上開展離子注入誘變，探索了離子注入甜菜種子的最佳能量和最佳劑量對雜交種、親本材料的影響，獲得優(yōu)良甜菜早熟突變體，為甜菜產(chǎn)區(qū)合理布局急需工藝早熟性品種提供了珍貴的基因源親本，也為選育甜菜新品種、創(chuàng)新親本材料資源開辟了一條新途徑。
文檔編號C12N13/00GK101092615SQ20071010338
公開日2007年12月26日 申請日期2007年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月19日
發(fā)明者王燕飛, 曾憲賢, 符子華, 劉華君, 沙紅, 張立明, 曲延英, 高衛(wèi)時, 劉軍, 高文偉, 楊洪澤, 白曉山 申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所