專利名稱:Hiv調(diào)節(jié)/輔助蛋白的融合蛋白的制作方法
HIV調(diào)節(jié)/輔助蛋白的融合蛋白
此案是申請日為2003年05月14日、中國申請?zhí)枮?3811119.5、 發(fā)明名稱為"HIV調(diào)節(jié)/輔助蛋白的融合蛋白"的發(fā)明申請的分案申請。
本發(fā)明涉及一種融合蛋白,所述蛋白包含選自Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat和Nef中的至少四種HIV蛋白的氨基酸序列或者一種或多種所述蛋白的 氨基酸序列的衍生物,其中所述融合蛋白不被加工成單獨的具有天然N和 C末端的HIV蛋白。本發(fā)明還涉及編碼所述蛋白的核酸,包含所述核酸的 載體,以及制備所述蛋白的方法。所述融合蛋白,核酸和載體可用作至少 部分預(yù)防HI V感染的疫苗。
背景技術(shù):
人免疫缺陷病毒(HIV)是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子。像 所有的逆轉(zhuǎn)錄病毒一樣,該病毒的基因組編碼Gag,Pol和Env蛋白。此外, 該病毒的基因組還編碼調(diào)節(jié)蛋白,即Tat和Rev,以及輔助蛋白,即Vpr, Vpx, Vpu,Vif和Nef。
盡管公共衛(wèi)生組織努力控制AIDS流行病的播散,新發(fā)感染的數(shù)目仍在 增長。世界衛(wèi)生組織估計2000年末,全球感染的人數(shù)達(dá)3.61千萬,比根據(jù) 十年前的數(shù)據(jù)預(yù)計的數(shù)目高50%(WHO&UNAIDS, UNAIDS, 2000)。從全球 來看,2000年新發(fā)HIV感染的數(shù)目在530萬。
由于該流行病的持續(xù)傳播,臨床上仍需要有效的疫苗?,F(xiàn)已發(fā)展出一 些不同的HIV-1疫苗遞送策略例如新的載體或者輔劑系統(tǒng),并在不同的前 臨床背景和臨床試驗中進(jìn)行了評估。進(jìn)入III期臨床實驗的第 一種候選疫苗 是以明礬中的包膜gpl20蛋白(Francis等,AIDS Res. Hum. Retroviruses 1998; 14 (Suppl 3) (5): S325-31))為基礎(chǔ)的。盡管該疫苗在較早的II期實驗中不是 很成功,其III期實驗還是已經(jīng)開始了。
多年來基于包膜抗原對預(yù)防性疫苗投入努力之后,最近更多的努力集 中在將調(diào)節(jié)蛋白例如Tat, Nef和Rev用作候選疫苗抗原上。這些調(diào)節(jié)性抗原
在治療中已經(jīng)使用了幾年(Miller等,Nature Medicine 1997, 3, 389-94, Calarota等,Lancet 1998, 351, 1320-5, Ayyavoo等,AIDS, 2000, 14, 1-9)。近 來,在小型臨床前實驗中對預(yù)防性疫苗的研究顯示,這些抗原的應(yīng)用很有 前途。使用Tat和Rev,或單獨的Tat作為候選的預(yù)防性疫苗顯示可控制 SIVmac(Osterhaus等,Vaccine 1999,17,2713-4)。此外,還表明針對該病毒早 期調(diào)節(jié)蛋白的CTL對于在該病毒產(chǎn)生高水平的成熟病毒粒前消除感染的細(xì) 胞很重要(van Baalen等,J. Gen. Virol 1997,78, 1913-8; Addo等,PNAS, 2001,98,1781-6)。
盡管HIV的調(diào)節(jié)/輔助蛋白誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答,但如果不是全部也是 大多數(shù)都有嚴(yán)重的副作用,從而限制了它們作為疫苗的用途Nef, Tat和Vpu 已顯示在下調(diào)CD4+和/或MHC I類分子的表達(dá)中起作用(Howcroft等, Science, 1993, 260, 1320-2; Schwartz等,Nature Med. 1996,2, 338-42; Swann 等,Virology, 2001, 282, 267-77; Janvier等,J.Virol., 2001, 78, 3971-6, Weissmann等,PNAS 1998, 95, 11601-6)。已知Tat介導(dǎo)體內(nèi)的急性免疫抑制 (Cohen等,PNAS, 1999, 96, 10842-10847)。還描述了 Vpr的免疫抑制作用 (Ayyavoo等,Nature Med., 1997,3 : 1117-1123)。已經(jīng)描述了 Vpr和Vpx在酵 母細(xì)胞中具有不同的細(xì)胞抑制和細(xì)胞毒性效果(Zhang等,Virology, 1997, 230,103-12)。因此,HIV的大多數(shù)輔助/調(diào)節(jié)蛋白似乎具有疫苗配方中不期 望的功能特性。
降低HIV蛋白的有害效果的試驗在WO 02/06303中描述。具體地, WO 02/06303公開了包含HIV Vif, Vpu和Nef的氨基酸序列的融合蛋白,其 中所述組成蛋白和另一種組成蛋白連續(xù),或者被非組成蛋白如氨基酸序列 分開,形成了蛋白水解的裂解位點。已知優(yōu)選使用包含位于組成蛋白之間 的蛋白水解位點的融合蛋白。由于所述組成蛋白被蛋白水解的裂解位點分 開,產(chǎn)生了已知有害的天然HIV蛋白。為降低由融合蛋白裂解產(chǎn)生的HIV 蛋白的任何有害影響,WO 02/06303提示使用減毒蛋白。因此,WO 02/06303 教導(dǎo)我們使用包含HIVVif, Vpr和Nef蛋白的融合蛋白,其中的裂解位點被 插入HIV蛋白之間,并且其中的HIV蛋白是減毒蛋白。然而,減毒蛋白的 缺點在于減毒蛋白的氨基酸序列和天然蛋白的氨基酸序列不同,使得利用 減毒蛋白進(jìn)行的免疫產(chǎn)生的免疫應(yīng)答只能微弱地識別天然蛋白或甚至根本 不識別天然蛋白。
發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是提供一種能夠產(chǎn)生對HIV的多種或所有調(diào)節(jié)/輔助蛋白
產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答的疫苗,具體是有效的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答,其中所 述疫苗中或由疫苗產(chǎn)生的調(diào)節(jié)/輔助HIV蛋白比天然的單獨的調(diào)節(jié)/輔助蛋 白的功能低,從而使得與天然HIV蛋白相比,所述疫苗中的輔助/調(diào)節(jié)蛋白 產(chǎn)生不期望的副作用的危險性降低,并且其中較弱活性的HIV蛋白誘導(dǎo)與 天然HIV蛋白類似的免疫應(yīng)答。
發(fā)明內(nèi)容
通過提供一種融合蛋白實現(xiàn)了本發(fā)明的目的,所述融合蛋白包含選自 Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat和Nef中的至少四種HIV蛋白的氨基酸序列或者一種 或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物,其中所述融合蛋白不被加工成單 獨的具有天然N和C末端的HIV蛋白。具體地,本發(fā)明的目的已經(jīng)通過編 碼所述融合蛋白的核酸和載體實現(xiàn)了 。
如果融合蛋白在包括人細(xì)胞的動物細(xì)胞中產(chǎn)生,該融合蛋白被細(xì)胞蛋 白酶裂解的方式不會獲得具有天然N和C末端的輔助/調(diào)節(jié)蛋白。
由于作為融合蛋白一部分的HIV蛋白與單獨的HIV蛋白相比,其具有 改變的二級/三級結(jié)構(gòu),所述融合蛋白中的HIV蛋白比單獨的蛋白的功能弱, 甚至完全沒有功能。功能較弱甚至沒有功能的調(diào)節(jié)/輔助蛋白不具有天然構(gòu) 象的HIV蛋白的不良副作用。就免疫原性而言,所述融合蛋白的免疫源性 與形成融合蛋白的單獨的HIV調(diào)節(jié)/輔助蛋白的免疫源性相比基本沒有差 別。具體而言,由于呈遞給免疫系統(tǒng)的表位相同,就細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL) 應(yīng)答而言基本上沒有差別。當(dāng)將融合蛋白給藥患者時的考慮也一樣。
本發(fā)明術(shù)語"HIV"指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何HIV組,亞型(分化 抹),抹或分離林。具體地,HIV可以是HIV-1或HIV-2。 HIV-1被分成9種 亞型(分化才朱A到I),而HIV-2可以被分成5種亞型(A到E),均包含在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。本發(fā)明最優(yōu)選的HIV分化抹是HIV-1分化抹A, B和C。然而, 本發(fā)明不限于這些最優(yōu)選的分化抹。
HIV調(diào)節(jié)蛋白Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat, Vpx和Nef的蛋白序列是本領(lǐng)域 熟練技術(shù)人員已知的。通過實施例,且不限于所述的實施方案,可參考
genebank數(shù)據(jù)庫公開的各種序列,具體是Genebank登錄號為K03455的 HIV-l分離抹HXB2R的序列。在該genebank條目(entry)中,詳述了各種 HIV1基因的序列和所述基因編碼的蛋白的序列。
優(yōu)選形成所述融合蛋白的HIV蛋白來自同一分化抹。根據(jù)可選的實施 方案,形成融合蛋白的HIV蛋白來自兩種或更多種分化抹。也可能形成所 述融合蛋白的一種或多種HIV蛋白是HIV-1蛋白或HIV-2蛋白。
形成所述融合蛋白的HIV蛋白的氨基酸序列優(yōu)選是由已知HIV分離抹 編碼的序列,即所述融合蛋白中的HIV蛋白的氨基酸序列和天然存在的HIV 分離抹編碼的相應(yīng)蛋白的氨基酸序列相同。可選地,融合蛋白中的一種或 多種HIV蛋白的氨基酸序列可以是共有序列,即已知HIV分離抹中不會發(fā) 現(xiàn),但與多種或所有己知的HIV分離株顯示最佳同源性的序列-尤其就CTL 表位而言。計算共有序列的計算機算法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。
在可選的實施方案中,所述融合蛋白可以包含作為所述融合蛋白的一 部分的一種或多種HIV蛋白的氨基酸序列的衍生物。本發(fā)明術(shù)語"HIV蛋 白的氨基酸序列的衍生物"指與天然存在的相應(yīng)的HIV蛋白相比,具有改 變的氨基酸序列的HIV蛋白。改變的氨基酸序列可能是這樣的序列,其中 HIV蛋白的一種或多種氨基酸序列被替換,插入或刪除。更具體地,"HIV 蛋白的氨基酸序列的衍生物"是當(dāng)融合蛋白中的相應(yīng)氨基酸序列與已知的 IIIV分離抹的各HIV蛋白的氨基酸序列相比,顯示至少50。/。的同源性,更 優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%,最優(yōu)選至少卯%的同源性的氨基酸序列。 即使僅僅在一種HIV分離林的相應(yīng)蛋白中發(fā)現(xiàn)了同源性,氨基酸序列也被 認(rèn)為具有上述的序列同源性,而不考慮其它分離抹中可能有顯示較低同源 性的相應(yīng)蛋白。通過實施例,如果融合蛋白中的Vpr衍生物顯示與一種HIV 分離抹的Vpr序列具有95%的同源性,但與(所有)其它HIV分離抹僅僅有 50%-70%的同源性,所述Vpr衍生物的同源性被認(rèn)為是至少90%。
已指出與單獨的蛋白相比,融合蛋白中的HIV蛋白具有降低的活性,
或者甚至根本沒有活性,這是由于融合蛋白中的蛋白構(gòu)象和生物活性蛋白 的天然構(gòu)象不同。然而,可能需要進(jìn)一步降低融合蛋白中的HIV蛋白具有 生物活性這一危險性。為此,尤其優(yōu)選的作為融合蛋白的一部分的單獨的 HIV蛋白的"衍生物"是其中的多個氨基酸被去除,插入或替代的氨基酸
多個氨基酸更優(yōu)選不超過10個氨基酸,更優(yōu)選不超過5個氨基酸。本領(lǐng)域
熟練技術(shù)人員已知測定HIV蛋白是否具有降低的生物活性的方法。
對于病毒在活體內(nèi)的復(fù)制很重要的Vif蛋白的分子機制仍然是未知的, 但Vif具有強的自我結(jié)合(selfassociation)的傾向性。這種多聚化對Vif在病 毒生存周期中的功能是重要的(Yang S.等,J Biol Chem 2001; 276: 4889-4893)。此外,vif還和病毒核蛋白復(fù)合物特異性結(jié)合,并且可能具有功 能上的意義(KhanM,A.等,JVirol. 2001; 75 (16): 7252-65)。因此,具有降低 的活性的vif蛋白顯示降低的多聚化能力和/或降低的與核蛋白復(fù)合物的結(jié) 合。
Vpr蛋白在病毒生存周期中起重要作用。Vpr調(diào)節(jié)病毒前整合復(fù)合物的 核轉(zhuǎn)運,并4足進(jìn)非分裂細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞的感染(Agostini等,AIDS Res Hum Retroviruses 2002; 18 (4): 283-8)。此外,通過與LTR反應(yīng),它還可介導(dǎo)反式 激活活性(Vanitharani R.等,Virology 2001; 289 (2): 334-42)。因此,具有降低 的活性的vpr顯示降低的反式激活作用或者甚至不能反式激活和/或與病毒 前整合復(fù)合物反應(yīng)。
Vpx與Vpr高度同源,對于非分裂細(xì)胞中有效的病毒復(fù)制也很重要。 Vpx通過與gag前體多聚蛋白p6結(jié)構(gòu)域的相互作用而被包裝在病毒顆粒中。 和Vpr—樣,Vpx參與將前整合復(fù)合物轉(zhuǎn)運到核中(Mahalingam等,J. Virol 2001; 75 (1): 362-74)。因此,具有降低的活性的Vpx顯示降低的通過gag前 體與前整合復(fù)合物結(jié)合的能力。
Vpu蛋白已知和CD4的細(xì)胞質(zhì)尾相互作用并導(dǎo)致CD4降解(Bour等, Virology 1995; 69 (3): 1510-20)。因此,具有降低的活性的Vpu具有降低的 激發(fā)CD4降解的能力。
已知充分定性的Tat蛋白的相關(guān)生物活性是通過與反式激活反應(yīng)元件 (TAR)的相互作用進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的反式激活。已顯示Tat能夠反式激活缺乏除 TAR以外的HIV序列的異源性啟動子(Han P.等,Nucleic Acid Res 1991; 19 (25): 7225-9)。因此,具有降低活性的tat蛋白顯示降低的通過TAR元件來 反式;敫活啟動子。
Nef蛋白對于病毒復(fù)制而言非常重要,它通過誘導(dǎo)細(xì)胞表面CD4的下 調(diào)導(dǎo)致疾病的進(jìn)展(Lou T等,J Biomed Sci 1997; 4 (4): 132)。這種下調(diào)是由 CD4和Nef之間的直接作用引起的(Preusser A.等,Biochem Biophys Res
Commun 2002 ; 292 (3): 734-40)。因此,具有降4氐的功能的Nef蛋白顯示降 低的與CD4的相互作用。
Rev的相關(guān)作用是通過與病毒RNA的Rev-反應(yīng)元件(RRE)的相卑作用 啟動的轉(zhuǎn)錄后反式激活(Iwai等,1992; Nuceic Acids Res 1992; 20 (24): 6465-72)。因此,具有降低的活性的Rev顯示與RRE的降低的相互作用。
本發(fā)明的融合蛋白包含選自Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev, Tat和Nef中的至 少四種HIV蛋白的氨基酸序列。所述融合蛋白優(yōu)選包含5, 6或所有所述的 HIV蛋白。融合蛋白中HIV蛋白的順序不重要。
至少4種不同的HIV蛋白中的一種或多種可以以兩個或更多個拷貝包 含于融合蛋白中。因此,通過實施例,本發(fā)明的融合蛋白可包含Vif, Vpr, Vpu 和兩個拷貝的Rev。所述HIV蛋白的兩個或多個拷貝的氨基酸序列可以完 全相同??蛇x地,這些拷貝的氨基酸序列可以不同,尤其是使用來自不同 的HIV抹或分化抹的蛋白序列(例如,一拷貝的HIV-1 Rev和一拷貝的HIV-2 Rev)。
融合蛋白中相鄰的HIV蛋白可無需其它氨基酸而被融合,或者以融合 蛋白中兩個相鄰的HIV蛋白被至少一個其它氨基酸分離的方式融合。兩種 方式的組合也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如,在包含四種HIV蛋白的氨基酸 序列的融合蛋白中,兩個相鄰的HIV蛋白可以直接互相連接,而第三個和 第四個HIV蛋白可以通過其它氨基酸連接。術(shù)語"其它氨基酸"在本文的 實施方案中指在天然存在的HIV蛋白中的相應(yīng)位置上沒有發(fā)現(xiàn)的氨基酸。
因此,本發(fā)明的融合蛋白優(yōu)選具有以下通式
+P 1—-P2—-P3---P4-—P5*—P6*—P7*+
其中Pl-P7是不同的HIV蛋白,選自Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Tat, Rev和Nef, 其中所述融合蛋白包含至少四種不同的所述HIV蛋白,即Pl-P4和可選的 一種(P5",兩種(P5515—-P6"或三種(P5、--P6*-—P7^添加的所述HIV蛋白。 縮寫"——"獨立地表示1到n個加入的氨基酸。當(dāng)"—-,,代表0個氨基酸 時,相鄰的HIV蛋白無需其它氨基酸而直接相互融合。當(dāng)-"代表1到 n個氨基酸時,相鄰的HIV蛋白被一到n個氨基酸分離。加入的氨基酸的 上限,即整數(shù)n,有賴于細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生或表達(dá)的融合蛋白的最大體積。
根據(jù)一個實施方案,所有"--"獨立代表O到20,更優(yōu)選代表O到10, 更優(yōu)選1到5個其它氨基酸。
根據(jù)可選的實施方案,至少一個"--"代表其它蛋白質(zhì)的氨基酸序列
或其一部分,所述蛋白不是選自Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat和Nef的HIV 蛋白。因此,根據(jù)這一可選的實施方案,所述其它蛋白側(cè)接調(diào)節(jié)/輔助HIV 蛋白。該其它蛋白可以是任何蛋白。更優(yōu)選該其它蛋白包含可以幫助誘導(dǎo) 對HIV的更好的免疫反應(yīng)的其它表位。因此,所述其它蛋可以是HIVEnv, Gag,和/或Pol蛋白或其一部分。文中術(shù)語Env,Gag和Pol的"一部分"指 來自所述蛋白之一的氨基酸片段,其包含至少一個表位。更優(yōu)選該術(shù)語"一 部分"指來自所述蛋白的至少10個,更優(yōu)選至少20個,更優(yōu)選至少50個 氨基酸。根據(jù)相關(guān)的實施方案,至少一個"一"代表作為所述融合蛋白一 部分的蛋白Pl-P7的一種或幾種的氨基酸序列。因此,在這種情況下,所述 融合蛋白可以包含一個或多個拷貝的一種或多種所述蛋白,其是該融合蛋 白的一部分。已指出該蛋白的拷貝可以具有或可以不具有相同的氨基酸序 列。
上述通式中,縮寫"+"獨立代表O到n個其它的末端氨基酸。因此, 本發(fā)明的融合蛋白在該蛋白的C和/或N末端可以包含或可以不包含其它氨 基酸。根據(jù)一個實施方案,至少一個"+"代表一種其它蛋白的氨基酸序列 或其一部分,所述蛋白不選自Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat和Nef。因此,根 據(jù)本發(fā)明的實施方案,所述融合蛋白包含位于C和/或N末端的其它蛋白, 所述蛋白不是選自Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat或Nef。該其它蛋白可以是任 何蛋白。更優(yōu)選該其它蛋白包含其它表位,可以幫助誘導(dǎo)對HIV的更好的 免疫應(yīng)答。例如,所述其它蛋白可以是HIVEnv, Gag和/或Pol蛋白或其一 部分。本文術(shù)語Env, Gag和/或Pol的"一部分"指來自所述蛋白之一的氨 基酸片段,其包含至少一個表位。更優(yōu)選術(shù)語"一部分"指至少10個,更 優(yōu)選至少20個,最優(yōu)選至少50個來自所述蛋白之一的氨基酸。
根據(jù)可選的實施方案,至少一個"+"代表使得該融合蛋白的檢測或純 化更容易的氨基酸序列。因此,至少一個"+"可以是例如一種標(biāo)記例如 His標(biāo)記。
根據(jù)本發(fā)明,所述融合蛋白不被加工成單獨的具有天然N和C末端的 HIV蛋白。更具體地,在人細(xì)胞中表達(dá)時,本發(fā)明的融合蛋白不被加工成 具有單獨的具有天然N和C末端的HIV蛋白。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知如 何檢測在人細(xì)胞中表達(dá)的融合蛋白是否被加工成單獨的具有天然N和C末
端的HIV蛋白的方法。本文提供的參考文獻(xiàn)是Ayyavoo等,AIDS 2000, 14,1-9,具體參考所述文獻(xiàn)的圖2中公開的試驗。簡言之,本領(lǐng)域熟練技術(shù) 人員可輕易地在人細(xì)胞例如Hela細(xì)胞中表達(dá)各融合蛋白;所述細(xì)胞隨后被 裂解并使用對單獨的HIV蛋白特異的抗體,對所述細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western 印跡實驗或者免疫沉淀實驗,所述單獨的HIV蛋白在一起形成各種HIV融 合蛋白。對于本發(fā)明的融合蛋白而言,沒有檢測到明顯量的大小對應(yīng)于單 獨的HIV調(diào)節(jié)/輔助蛋白的大小的HIV蛋白。
為保證本發(fā)明的融合蛋白不被加工成具有天然N末端和C末端的單獨 的HIV蛋白,所述融合蛋白不應(yīng)包含位于形成融合蛋白的HIV蛋白的氨基 酸序列之間的細(xì)胞蛋白酶的特定裂解序列,所述序列將導(dǎo)致產(chǎn)生具有天然N 和C末端的HIV蛋白。因此,上文通式中的縮寫形式"--"不包含細(xì)胞蛋 白酶的特定裂解序列,其可能導(dǎo)致產(chǎn)生具有天然N和C末端的HIV蛋白。 具體地,所述融合蛋白不包含位于形成融合蛋白的不同HIV蛋白的氨基酸 序列之間的裂解序列PEKRAVVG(單字母氨基酸密碼)。細(xì)胞蛋白的其它裂 解序列也是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。因此,本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以 輕易避免包含可能產(chǎn)生具有天然N和C末端的單獨的HIV蛋白的(細(xì)胞)蛋 白酶裂解序列。半胱氨酸蛋白酶的裂解序列的實例是Ile/Leu-X-Thr-X-Gly。
本發(fā)明的蛋白不包含生產(chǎn)同時具有天然N和C末端的HIV蛋白的特定 裂解序列。然而,只要這些裂解位點不能介導(dǎo)同時具有天然N末端和天然 C末端的HIV蛋白的產(chǎn)生,通常不排除融合蛋白中的蛋白之間的細(xì)胞蛋白 酶裂解位點的存在。具體地,上文通式中的縮寫氨基酸序列"--"可以包 含參與MHCI或MHCII上被呈遞的短肽的產(chǎn)生的蛋白酶的裂解位點。根 據(jù)該實施方案,裂解反應(yīng)的結(jié)果是產(chǎn)生優(yōu)選少于20個氨基酸的短肽片段, 其N或C末端可對應(yīng)于一個HIV輔助/調(diào)節(jié)蛋白的N或C末端。然而,當(dāng) 這些短肽在抗原呈遞的過程中被產(chǎn)生時,它們不具有其來源的HIV蛋白任 何的活性。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明定義的融合蛋白的核酸。所述核酸可以是 DNA或RNA。如果意圖通過使用例如質(zhì)?;蛞訢NA病毒為基礎(chǔ)的載體的 DNA載體,將核酸插入人細(xì)胞中,優(yōu)選所述核酸是DNA。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知構(gòu)建編碼本發(fā)明的融合蛋白的核酸的方法。 不必拘泥于下述方法,本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以從包含一種或多種調(diào)節(jié)/輔
助HIV蛋白的編碼序列的基因組HIV克隆,亞基因組HIV克隆,或者任何
起始原料例如質(zhì)粒開始。如果該調(diào)解/輔助蛋白的編碼序列位于連續(xù)的閱讀 框架中,所述編碼序列可通過適當(dāng)?shù)南拗菩悦噶呀獍鼍幋a序列的核
酸而分離。由此獲得的DNA片段可被用于進(jìn)一步的克隆??蛇x地,輔助/ 調(diào)節(jié)蛋白的編碼序列可通過使用適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得。 如果該調(diào)解/輔助蛋白由一種以上的外顯子編碼,如Tat和Rev那樣,需要 獨立地克隆不同的外顯子并將其融合產(chǎn)生調(diào)節(jié)/輔助蛋白的連續(xù)閱讀框架, 或者利用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)例如PT-PCR。
編碼序列也可以通過基因合成提供,例如通過使用一套互補的和/或重 疊寡核苷酸產(chǎn)生基因。
為獲得融合蛋白,編碼所述融合蛋白的核酸優(yōu)選包含連續(xù)閱讀框架。 因此,除最后一段編碼HIV蛋白或其它蛋白的序列以外,所有序列的終止 密碼子優(yōu)選被突變成編碼氨基酸的密碼子或者被完全刪除。優(yōu)選,如果PCR 使用特定的引物,其可無需終止密碼子擴增該編碼序列,可輕易實現(xiàn)所述 過程。換言之,根據(jù)該可選方案,下游引物不應(yīng)與終止密碼子互補。因此 擴增的DNA片段不包含終止密碼子并可被克隆進(jìn)入克隆載體中??蛇x地, 也可能將含有終止密碼子的編碼序列克隆到克隆載體中。所述終止密碼子 可在以后被消除,例如通過使用特異性核酸內(nèi)切酶或者通過誘變。
克隆步驟的結(jié)果可以產(chǎn)生編碼本發(fā)明的融合蛋白的連續(xù)閱讀框架。
獲得融合蛋白的表達(dá)必要的調(diào)節(jié)元件可以是任何驅(qū)動所需表達(dá)系統(tǒng)中 的表達(dá)的調(diào)控元件。如果意圖在原核細(xì)胞例如大腸桿菌中制備融合蛋白, 優(yōu)選使用細(xì)菌或噬菌體啟動子。如果意圖在真核細(xì)胞中表達(dá)該融合蛋白, 優(yōu)選使用真核或病毒啟動子/增強子。如果意圖通過使用痘病毒啟動子(見下 文)表達(dá)該融合蛋白,優(yōu)選使用例如7.5啟動子或AT I啟動子的痘病毒啟動 子。
如上述,該融合蛋白可包含融合配偶體,其不是選自Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev,Tat和Nef的HIV蛋白。因此,該融合蛋白可以包含其它蛋白的氨基酸 序列或其一部分。其它蛋白的實例是HIV Gag, Pol和Env蛋白。因此,本 發(fā)明的核酸也可包含一種或多種其它蛋白或其一部分的編碼序列,所述編 碼序列位于編碼至少四種調(diào)節(jié)/輔助HIV蛋白或其衍生物的開放閱讀框架 中。
本發(fā)明的另一實施方案中,所述核酸可進(jìn)一步包含獨立的表達(dá)盒,所述 表達(dá)盒編碼幫助進(jìn)一步增強對fflV的免疫應(yīng)答的其它蛋白。在優(yōu)選的實施方
案中,所述核酸還可包含一種表達(dá)盒,其含有選自Gag, Pol和Env中的至少 一種的其它HIV蛋白的編碼序列或其部分。更優(yōu)選地,所述核酸除了融合蛋 白的編碼序列以外,還可包含所有HIV蛋白Gag, Pol和Env的編碼序列。所 述核酸優(yōu)選是載體的一部分。所述核酸還可以是病毒基因組或病毒載體的其 一部分,優(yōu)選例如MVA的痘病毒載體。因此,可以從痘病毒載體中表達(dá)所 述融合蛋白以及其它HIV蛋白,例如選自Gag, Pol和Env的至少一種其它 HIV蛋白。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸的載體。術(shù)語"載體"指本領(lǐng)域熟練技 術(shù)人員已知的載體。載體可以是例如pBR322的質(zhì)粒載體或者pUC系列的載 體。更優(yōu)選的載體是病毒載體。本文術(shù)語"病毒載體,,指包含病毒基因組的 感染性和/或減毒病毒。在這種情況下,本發(fā)明的核酸是各病毒載體的病毒基 因組的一部分和/或構(gòu)成病毒基因組。所述重組載體可用來感染細(xì)胞或細(xì)胞 系,具體用于感染包括人在內(nèi)的活動物。本發(fā)明典型的病毒載體是腺病毒載 體,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,或者以腺伴隨病毒2(adeno associated virus 2)(AAV2) 為基礎(chǔ)的載體。更優(yōu)選痘病毒(poxvirus)載體。所述痘病毒優(yōu)選金絲雀痘病毒 (canarypox virus),禽痘病毒(fowlpoxvirus)或疰苗病毒(vacciniavirus)。更優(yōu)選 的是改良的安卡4立癥苗病毒(modified vaccinia virus Ankara)(MVA)(Sutter,G等 (1994), Vaccine 12:1032-40)。典型的MVA毒抹是MVA575,其于2000年12 月7日保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures) (Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJQ UK),保藏號是ECACC V00120707。更優(yōu)選的是MVA-BN或其衍生物,其在2001年11月22日提 交給歐洲專利局的PCT申請PCT/EP01/13628中描述,題目是"Modified Vaccinia Ankara Virus Variant"。 MVA-BN于2000年8月30日保藏在歐洲細(xì) 胞培養(yǎng)物保藏中心(Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJQ UK),保藏號是 ECACC V00083008。通過使用MVA-BN或其衍生物,解決了其它的技術(shù)問 題,以提供一種尤其安全的針對HTV的病毒疫苗,這是因為MVA-BN病毒載 體是完全減毒的病毒,其來自改良的安卡拉痘苗病毒,并且特征是其喪失了在 人細(xì)胞中再生性復(fù)制的能力。MVA-BN由于缺乏在人類中復(fù)制的能力,而比 已知的其它痘苗病毒抹更安全。在優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明涉及將MVA-BN 和MVA-BN的衍生物作為含有本發(fā)明的DNA的病毒載體。MVA-BN的特征,
能夠評估MVA是不是MVA-BN或其衍生物的生物試驗的描述,以及能夠
所述對比文件包含在文中作為參考。
因此,4艮據(jù)這些實施方案,本發(fā)明優(yōu)選涉及重組MVA,例如MVA-BN, 其病毒基因組中包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的表達(dá)盒。
將本發(fā)明的核酸插入所述病毒基因組的方法和獲得重組病毒的方法是 本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。
在重組痘苗病毒中,本發(fā)明的DNA的表達(dá)優(yōu)選,但非排除性地,在痘 病毒啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下,所述啟動子更優(yōu)選為痘苗病毒啟動子。本發(fā) 明的DNA優(yōu)選插入到病毒基因組的非必要區(qū)(non-essential region)中。在本 發(fā)明的另 一優(yōu)選實施方案中,異源性核酸序列被插入痘病毒基因組天然存 在的缺失位點中(PCT/EP96/02926中公開)。然而,只要能得到重組痘苗病毒, 插入位點的性質(zhì)對本發(fā)明而言并不重要。因此,本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可輕 易構(gòu)想到其它適宜的插入位點。
優(yōu)選所述病毒載體,尤其是痘病毒載體的病毒基因組中除了包含本發(fā) 明的融合蛋白的編碼序列以外,還可以包含選自HIV Gag, Pol和Env基因 的其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基因。更優(yōu)選所述病毒載體,尤其是痘病毒載體,除了 包含本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列以外,還可以包含所有編碼HIV Gag, Pol 和Env的HIV基因。這些其它的基因可以被插入本發(fā)明相同的核酸中。根 據(jù)該實施方案,所有HIV基因可位于該病毒基因組的相同插入位點。在可 選的實施方案中,所述其它基因被插入該病毒基因組的不同位點上。
在優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明涉及將本發(fā)明的核酸,載體或融合蛋白 用作至少部分預(yù)防HIV感染和AIDS的疫苗。"疫苗"是一種化合物,即誘 導(dǎo)特定免疫應(yīng)答的核酸,融合蛋白,載體或病毒。
根據(jù)另一實施方案,本發(fā)明的"疫苗"以本發(fā)明的融合蛋白為基礎(chǔ)。
在優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的核酸,具體為DNA用作疫苗。本領(lǐng)域 熟練技術(shù)人員已知給藥本發(fā)明的包含真核表達(dá)盒的棵DNA,尤其肌肉內(nèi)給 藥所述DNA導(dǎo)致表達(dá)盒編碼的蛋白的表達(dá)。所述蛋白暴露給免疫系統(tǒng),并 激發(fā)了特定的免疫反應(yīng)。
在可選的實施方案中,通過將本發(fā)明的載體給藥來進(jìn)行疫苗接種,所 述載體具體是病毒載體,更優(yōu)選痘病毒載體,最優(yōu)選痘苗病毒載體,例如
MVA載體。
為制備以痘苗病毒為基礎(chǔ)的疫苗,將本發(fā)明的病毒轉(zhuǎn)化成生理可接受 的形式。這一過程可根據(jù)制備用作天花疫苗的痘病毒疫苗的經(jīng)驗進(jìn)行(如
Stickl, H.等[1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392所述)。例如,純化的病 毒以配置在約10mM Tris, 140mM NaCl Ph7;卞,S度為5 x 108 TCID50/ml 保藏在-8(TC。為制備疫苗丸,例如在存在2%的蛋白胨和1%的人白蛋白的 條件下,102-108的病毒顆粒在含有100ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的安瓿瓶(優(yōu) 選玻璃安瓿瓶)中凍干??蛇x地,所述疫苗丸可通過逐步冷凍-干燥配制劑中 的病毒制備。該配制劑可以含有適宜在活體內(nèi)給藥的其它添加物,例如甘 露醇,葡聚糖,糖,甘油,乳糖或聚乙烯吡咯烷酮,或者含有其它添加物 例如抗氧化劑或者惰性氣體,穩(wěn)定劑或者重組蛋白(例如人血清白蛋白)。所 述玻璃安瓿瓶隨后被密封,并可以在4。C和室溫之間保存幾個月。然而,一 般來說,安瓿瓶優(yōu)選儲存在-20。C以下。接種用的凍干物可以溶解在0.1 -0.5ml 的水溶液中,優(yōu)選生理鹽水或者丁ris緩沖液,并且可系統(tǒng)或局部地給藥, 即腸胃外,肌肉內(nèi)或者任何其它本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的給藥途徑。本 領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以已知的方式優(yōu)化給藥的方式,劑量和給藥次數(shù)。痘 病毒載體最優(yōu)選的是皮下或肌肉內(nèi)給藥。
如果疫苗是包含本發(fā)明的DNA的MVA-BN載體或其衍生物,本發(fā)明的 具體實施方案涉及在第一次接種("激發(fā)接種")和第二次接種("強化接種 ")中,給藥治療有效量的疫苗。
如果疫苗是包含本發(fā)明的DNA的MVA-BN載體或其衍生物,本發(fā)明的 具體實施方案涉及接種的試劑盒,所述試劑盒含有位于第 一 小瓶/容器中的 用于第一次接種("激發(fā)")的本發(fā)明的MVA-BN病毒載體和位于第二小瓶/ 容器中的用于第二次接種("強化")的本發(fā)明的MVA-BN病毒載體。
因此,本發(fā)明在疫苗實施方案中涉及包含本發(fā)明的核酸,載體或者融 合蛋白的疫苗,以及所述核酸,載體或蛋白在制備疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另 一 實施方案涉及通過將本發(fā)明的融合蛋白,本發(fā)明的核酸 或本發(fā)明的載體,給藥需要上述物質(zhì)的包括人在內(nèi)的動物,保護包括人在 內(nèi)的動物不受HIV的感染。
此外,本發(fā)明涉及制備本發(fā)明的蛋白的方法,包括以下步驟(i)使用 本發(fā)明的核酸或載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,或(ii)使用本發(fā)明的病毒載體感染宿主
細(xì)胞,(iii)在步驟(i)的轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞或者(ii)的感染后的宿主細(xì)胞中表達(dá) 所述融合蛋白,和(iv)回收所述融合蛋白。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的核酸或載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞或者使用本發(fā) 明的病毒載體感染的宿主細(xì)胞。
根據(jù)另一實施方案,所述融合蛋白可包含選自Vif, Vpr, Vpu, Rev,Vpx 和Tat中的至少三種不同的蛋白。所述融合蛋白優(yōu)選包含4, 5種或所有的 所述HIV蛋白。根據(jù)該實施方案,典型的融合蛋白包含HIV蛋白Vpr, Vif, Vpu, Rev和Tat的氨基酸序列或者一種或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍 生物。如上述,融合蛋白中HIV蛋白的順序不重要。上述所有優(yōu)選的實施 方案也適用于該可選的實施方案。
附圖簡述
圖1:寡核苷酸退火的圖解
該圖片顯示了四種寡核苷酸的退火。它們是單鏈的,并可以通過互補 的末端退火。缺口可以通過顯示校正活性的聚合酶(例如Pfx聚合酶)填補。 圖2:蛋白斑(blob)的四種基因的退火的圖解
vif基因顯示與vpr片段的重疊序列,vpu編碼片段顯示與rev基因(灰 色)的重疊序列。PCR片段變性后,重疊互補末段發(fā)生雜交。產(chǎn)生的缺口使 用Pfx聚合酶填補。Vif-vpr片段和vpu-rev片段的重疊序列融合,可再次用 于融合。
圖3:為把異源基因插入MVA基因組,克隆重組載體中本發(fā)明融合蛋 白的編碼序列的策略
融合的vif,vpr, vpu和rev多聚蛋白編碼區(qū)用包含Clal和Apal限制性位 點的引物擴增。所述pCR產(chǎn)物被克隆到Clal/Apal切割的載體pBNX65中, 所迷載體含有痘病毒ATI啟動子。Tat編碼區(qū)使用含有Acc651限制性位點 的引物通過PCR擴增,并連接到Acc651線性化的pBNX65+vif-rev。產(chǎn)生 的表達(dá)盒(AT1啟動子+編碼本發(fā)明的融合蛋白的序列)用Pacl限制性酶分離 并插入重組載體中,使得異源基因插入MVA基因組14L基因間區(qū) (pBNX39)。 PBNX39含有與MVA基因組插入位點側(cè)接的序列(F1 14L和F2 4L)同源的序列。為在MVA基因組和pBNX39同源重組以后篩選重組病毒, 所述載體還含有大腸桿菌gpt基因(磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因)。純化所述重組
病毒以后,通過Flank 1和Flank 1的重復(fù)序列(F1 rpt)之間的同源重組可消除 選擇盒。
圖4: MVA基因組的圖解
MVA含有線性基因組,其經(jīng)Hind III(A-O)限制后顯示特征性片段。14L 和15L基因之間的非功能區(qū)位于I片段中。使用pBNX39將異源基因插入 位置56767-56768。
實施例
編碼HIV Vif-Vpr-Vpu-Rev-Tat融合蛋白的DNA的生成 HIV基因組的單基因可通過使用標(biāo)準(zhǔn)PCR法通過PCR從基因組DNA 制備,或通過合成技術(shù)制備,該過程基于通過重疊序列的寡核苷酸退火并
填補產(chǎn)生的單^i缺口。
為產(chǎn)生以寡核苷酸為基礎(chǔ)的基因的編碼區(qū),從而將其插入編碼本發(fā)明 的融合蛋白的核酸中,設(shè)計了具有15bp重疊的40個核苷酸聚合的寡核苷 酸。所述寡核苷酸的序列基于來自IIIB抹的HIV1分離抹HXB2R的基因圖 語。退火反應(yīng)或PCR中用于分離所需序列的寡核苷酸的設(shè)計使得在產(chǎn)生的 編碼區(qū)中,用于終止翻譯的終止密碼子被消除。Tat基因是使用含有終止密 碼子的寡核苷酸合成6^4tt周將被插入編碼本發(fā)明的融合蛋白的核酸的 最后的位置,并因此應(yīng)當(dāng)含有正確終止多聚蛋白的翻譯的終止三聯(lián)密碼。
為進(jìn)行寡核苷酸退火反應(yīng),進(jìn)行了 10個循環(huán)的兩步Pfx聚合酶 (Gibco-BRL)反應(yīng)(95。C變性,并在68°C退火/延伸)。在該反應(yīng)中,寡核苷酸 的重疊序列退火,而且缺口也被Pfx校正聚合酶填補(圖1)。
為合成vif編碼區(qū),即編碼所述融合蛋白的核苷酸序列中的第 一 個被編 碼的基因,使用基因組HIVcDNA進(jìn)行了 PCR。 PCR的進(jìn)行使得vif編碼區(qū) 與隨后的vpr基因的前15bp融合,使得vif和vpr隨后退火。Vpr編碼區(qū)包 含HIV HXB2R基因組的堿基對5559-5847,通過IO種寡核苷酸的退火制備。 產(chǎn)生的缺口被填補,隨后的PCR用于擴增產(chǎn)物,該產(chǎn)物含有與vif和vpu 的側(cè)翼區(qū)融合的vpr編碼區(qū),其中vif和vpu的側(cè)翼區(qū)被插入在vpr的編碼 區(qū)之后。
使用與合成vif相同的cDNA通過PCR擴增Vpu編碼區(qū),生成的產(chǎn)物 含有用來與vpr和rev融合的側(cè)翼區(qū)。
通過14種寡核苷酸的退火合成rev編碼區(qū),其包含HIV HXB2R基因 組的堿基對5970-6045和8379-8650的區(qū),以及與vpu和tat退火的15個堿
基對的重疊序列。
tat編碼區(qū)通過使用IO種寡核苷酸產(chǎn)生,其包含HIVHXB2R基因組的 石成基對5831-6045和8379-8466。
vif和vpr編;馬區(qū)以及vpu和rev編碼區(qū)通過所述兩個片l殳的重疊序列 的退火以及兩步Pfx聚合酶反應(yīng)進(jìn)行融合(圖2)。對融合產(chǎn)物再進(jìn)行PCR以 后,所述片段經(jīng)純化,并經(jīng)vpr和vpu的重疊序列互相接連(圖2)。所得產(chǎn) 物(vif-vpr-vpu-rev的編碼序列)的PCR擴增后,tat編碼區(qū)通過位于含有痘病 毒ATI啟動子的pBluescriptKS +載體中相鄰的克隆位點克隆vif-vpr-vpu-rev 片段和tat而被融合(圖3, pBNX65)。完整的表達(dá)盒隨后通過Pacl限制性酶 分離并插入pBNX39中(圖3)。 PBNX39含有與MVA基因組同源的序列, A/v而可通過同源重組插入該基因組的非編碼區(qū)(14L)中。
權(quán)利要求
1.融合蛋白,其包含選自Vif,Vpr,Vpu,Vpx,Rev和Tat中的至少三種HIV蛋白的氨基酸序列或者一種或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物,其中所述融合蛋白在形成該融合蛋白的HIV蛋白氨基酸序列之間不包含細(xì)胞蛋白酶的特定裂解序列,所述序列將導(dǎo)致產(chǎn)生具有天然N和C末端的HIV蛋白,且當(dāng)將融合蛋白中的氨基酸序列的相應(yīng)部分和HIV分離株HXB2R(genebank登陸號K03455)中的各HIV蛋白的氨基酸序列相比較時,其中HIV蛋白的氨基酸序列的衍生物是顯示至少50%同源性的氨基酸序列。
2. 權(quán)利要求1的融合蛋白,其中所述同源性是至少80%。
3. 融合蛋白,其包含選自Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Rev和Tat中的至少三種 HIV蛋白的氨基酸序列或者一種或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物, 其中所述融合蛋白在形成該融合蛋白的HIV蛋白氨基酸序列之間不包含細(xì) 胞蛋白酶的特定裂解序列,所述序列將引發(fā)產(chǎn)生具有天然N和C末端的HIV 蛋白,并且其中作為所述融合蛋白一部分的各HIV蛋白衍生物是其中已刪 除、插入或取代不多于10個氨基酸而獲得的活性降低或完全不具活性的 HIV蛋白。
4. 權(quán)利要求l-3之一的融合蛋白,其中所述融合蛋白包含選自Vpr, Vif, Vpx, Vpu, Rev和Tat的4個、5個或者全部的HIV蛋白或一種或多種所述 HIV蛋白的氨基酸序列的衍生物。
5. 權(quán)利要求1-4之一的融合蛋白,其包含HIV蛋白Vif, Vpr, Vpu, Rev 和Tat的氨基酸序列或一種或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物。
6. 權(quán)利要求l-5之一的融合蛋白,其中至少兩種所述HIV蛋白的氨基 酸序列互相融合而無需其它氨基酸。
7. 權(quán)利要求l-6之一的融合蛋白,其中至少兩種所述HIV蛋白的氨基 酸序列被至少 一種其它的氨基酸分開。
8. 權(quán)利要求l-7之一的融合蛋白,其中至少一種所述HIV蛋白的氨基 酸序列和融合配偶體融合,所述融合配偶體不是選自Vif, Vpr, Vpx, Vpu, Rev, Tat和Nef的HIV蛋白。
9. 編碼權(quán)利要求l-8之一的融合蛋白的核酸。
10. 權(quán)利要求9的核酸,其中所述核酸是DNA。
11. 權(quán)利要求10的核酸,其中該融合蛋白從所述DNA中的表達(dá)受選 自真核細(xì)胞,原核細(xì)胞和病毒啟動子的調(diào)控元件控制。
12. 權(quán)利要求ll的核酸,其中所述病毒啟動子是痘病毒啟動子。
13. 權(quán)利要求9-12之一的核酸,其中所述核酸還包含選自Gag, Pol和 Env中至少 一種的其它HIV蛋白的編碼序列。
14. 權(quán)利要求13的核酸,其中所述核酸包含HIVGag, Pol和Erw蛋白 的編碼序列。
15. 包含權(quán)利要求9-14之一的核酸的載體。
16,權(quán)利要求15的載體,其中所述載體是病毒載體。
17. 權(quán)利要求16的載體,其中所述病毒載體是痘病毒載體,具體是痘 苗病毒載體。
18. 權(quán)利要求17的載體,其中所述痘苗病毒載體是改良的安卡拉痘苗 病毒(MVA)。
19. 權(quán)利要求18的載體,其中所述MVA選自保藏在歐洲動物細(xì)胞培 養(yǎng)物保藏中心(ECACC)的保藏號為V00120707的MVA-575,和保藏在 ECACC的保藏號為V00083008的MVA-BN。
20. 制備權(quán)利要求l-8之一的蛋白的方法,包含以下步驟 -使用權(quán)利要求9-14之一的核酸或權(quán)利要求15的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,或-使用權(quán)利要求16-19之一的病毒載體感染宿主細(xì)胞, -在轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞或感染后的宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白,和 -回收該融合蛋白。
21. —種宿主細(xì)胞,其由權(quán)利要求9-14之一的核酸或權(quán)利要求15的載 體轉(zhuǎn)染,或者由權(quán)利要求16-19之一的病毒載體轉(zhuǎn)染。
22. 權(quán)利要求1-8之一的融合蛋白,權(quán)利要求9-14之一的核酸或者權(quán) 利要求15-19之一的載體,其用作藥物。
23. 權(quán)利要求1-8之一的融合蛋白,權(quán)利要求9-14之一的核酸或者權(quán) 利要求15-19之一的載體,其用作疫苗。
24. —種疫苗,其包含權(quán)利要求1-8之一的融合蛋白,權(quán)利要求9-14 之一的核酸或者權(quán)利要求15-19之一的載體。
25. 權(quán)利要求1-8之一的融合蛋白,權(quán)利要求9-14之一的核酸或者權(quán) 利要求15-19之一的載體在制備疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種融合蛋白,所述蛋白包含選自Vif,Vpr,Vpu,Rev,Tat和Nef中的至少四種HIV蛋白的氨基酸序列或者一種或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物,其中所述融合蛋白不被加工成單獨的具有天然N和C末端的HIV蛋白。本發(fā)明還涉及編碼所述蛋白的核酸,包含所述核酸的載體,以及制備所述蛋白的方法。所述融合蛋白,核酸和載體可用作至少部分預(yù)防HIV感染的疫苗。
文檔編號C12N15/86GK101108882SQ20071010395
公開日2008年1月23日 申請日期2003年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月16日
發(fā)明者伊娃·費爾德, 保羅·豪利, 桑賈·利勒 申請人:巴法里安諾迪克有限公司