專(zhuān)利名稱(chēng)：一種快速建立懸浮、高密度工程細(xì)胞株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，其技術(shù)屬于細(xì)胞生物學(xué)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法與 技術(shù)，特別是一類(lèi)貼壁低密度有血清細(xì)胞株的改良。
背景技術(shù)：
生物制藥包括疫苗、基因工程藥物、基因治療藥物、抗體藥物、蛋白 藥物以及動(dòng)物疫苗等生物制品，其中很大部分品種采用細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)，且 發(fā)展趨勢(shì)是利用細(xì)胞表達(dá)、分泌的生物制品越來(lái)越多。在我國(guó)，疫苗(包 括人用和動(dòng)物疫苗)的生產(chǎn)主要采用貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的生產(chǎn)方式，如培 養(yǎng)Vero細(xì)胞用于狂犬、乙腦、出血熱、甲肝疫苗的生產(chǎn)等，培養(yǎng)地鼠腎細(xì) 胞用于狂犬、乙腦疫苗的生產(chǎn)等，培養(yǎng)BHK21細(xì)胞用于口蹄疫疫苗的生產(chǎn)， 培養(yǎng)CHO細(xì)胞用于乙肝疫苗的生產(chǎn)，培養(yǎng)2BS細(xì)胞、KMB17細(xì)胞用于甲 肝疫苗的生產(chǎn)，培養(yǎng)2BS細(xì)胞、MRC5細(xì)胞用于水痘疫苗的生產(chǎn)，通過(guò)大 規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞是生產(chǎn)生物制品的有效方法。
由于細(xì)胞的生長(zhǎng)需在有血清的環(huán)境中，這樣就使大多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀 態(tài)多為貼壁狀態(tài)，在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)由于表面積有限，造成細(xì)胞的的密度低， 產(chǎn)量低，因此在進(jìn)行細(xì)胞改良的過(guò)程成中，首要的問(wèn)題是使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血 清的狀態(tài)。
動(dòng)物細(xì)胞是一種無(wú)細(xì)胞壁的真核細(xì)胞，生長(zhǎng)緩慢，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境十分敏 感。細(xì)胞的生長(zhǎng)需要一定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，用于維持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)稱(chēng)為 培養(yǎng)基，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng)、保存細(xì)胞用的物質(zhì)，就其本 意上講為人工模擬體內(nèi)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，使細(xì)胞在此環(huán)境中有生長(zhǎng)和繁殖 的能力。它是提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。細(xì)胞培養(yǎng)基 其組成成分主要有水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)離子及其他 一些核酸降解物、激素等。許多人用和獸用的重要蛋白質(zhì)藥物和疫苗，尤 其是那些相對(duì)較大、較復(fù)雜或糖基化的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是首選 的生產(chǎn)方式。無(wú)血清懸浮培養(yǎng)是用己知人源或動(dòng)物來(lái)源的蛋白或激素代替動(dòng)物血清 的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成 為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。
使用無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)
1、 增加確定性無(wú)血清中未知成分等干擾因素。
2、 生物安全性高可避免動(dòng)物血清中存在的潛在病原體污染。
3、 性能更加一致無(wú)批次間質(zhì)量差異。
4、 容易進(jìn)行純化和下游加工無(wú)動(dòng)物來(lái)源蛋白成分等干擾因素。

發(fā)明內(nèi)容
一種快速建立懸浮、高密度工程細(xì)胞株的方法，通過(guò)對(duì)原細(xì)胞株進(jìn)行 懸浮狀態(tài)適應(yīng)的馴化，獲得了適應(yīng)無(wú)血清、懸浮、高密度狀態(tài)的細(xì)胞株， 在細(xì)胞處理上是一種新的方法和應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
分幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基中，這種處理 方法對(duì)于細(xì)胞比較溫和。 1、適應(yīng)方瓶中的無(wú)血清狀態(tài)
1) 以2倍正常接種密度接種生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基 25%混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。
2) 當(dāng)細(xì)胞密度5xl()S細(xì)胞/ml時(shí)，以3xl()S細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在有血清培 養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基為50 : 50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
3) 達(dá)到3xl()S細(xì)胞/ml細(xì)胞密度時(shí)，25%有血清培養(yǎng)基和75%無(wú)血清培養(yǎng) 基中傳代培養(yǎng)。
4) 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到3xl()S細(xì)胞/ml (接種后5天)，在100%無(wú)血清培養(yǎng)基 中傳代培養(yǎng)。
5) 每隔3天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到3xl(^細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90%時(shí)，凍存
部分細(xì)胞株。
細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，
用包含fbs的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基i : i (v : v)的混合培
養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量i : 2， i : 4， i : 16和100%替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí)，
傳代細(xì)胞2到3次。培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。 一開(kāi)始就使用 相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長(zhǎng)的延遲可能會(huì)發(fā)生，允許進(jìn)行3 次的傳代，使生長(zhǎng)率恢復(fù)到以前的水平。
2、以較高的密度轉(zhuǎn)至搖瓶，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，在搖瓶中適應(yīng)4代以上， 使其適應(yīng)搖瓶中無(wú)血清、懸浮的細(xì)胞株，細(xì)胞活率在90%時(shí)，凍存部分細(xì) 胞株。
實(shí)例說(shuō)明
本研究對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行了馴化，原CHO為貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，在含有10% 胎牛血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以下為馴化的具體步驟-
1、 適應(yīng)方瓶中的無(wú)血清狀態(tài)
1) 以2倍正常接種密度接種到75%有血清培養(yǎng)基25%混合培養(yǎng)基中，傳
代培養(yǎng)3次。
2) 當(dāng)細(xì)胞密度5xl()S細(xì)胞/ml時(shí)，以3xl()S細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在50%有血
清培養(yǎng)基50%無(wú)血清培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)3次。
3) 達(dá)到3xl(^細(xì)胞/ml細(xì)胞密度時(shí)，25%有血清培養(yǎng)基和75%無(wú)血清培養(yǎng) 基中傳代培養(yǎng)3次。
4) 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到3xl()S細(xì)胞/ml (接種后5天)，在100%無(wú)血清培養(yǎng)基 中傳代培養(yǎng)3次。
5) 每隔3天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到3xl()S細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90%時(shí)，凍存 部分細(xì)胞株。
2、 以較高的密度轉(zhuǎn)至搖瓶，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，在搖瓶中適應(yīng)4代以上， 使其適應(yīng)搖瓶中無(wú)血清、懸浮的細(xì)胞株，細(xì)胞活率在90%時(shí)，凍存部分細(xì) 胞株。
至此，獲得了無(wú)血清、懸浮的CHO細(xì)胞株。
以馴化后的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染率的檢測(cè)，通過(guò)免疫組化的方法測(cè)得轉(zhuǎn)染效率 在40%以上，通過(guò)ELISA的方法進(jìn)行檢測(cè)，目的蛋白的產(chǎn)量達(dá)到較高的水平。
用同樣的方法對(duì)Vero細(xì)胞進(jìn)行馴化，獲得了無(wú)血清懸浮的Vero細(xì)胞株。
權(quán)利要求
1、一種快速建立無(wú)血清、懸浮、高密度工程細(xì)胞株的方法。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法可用于馴化CHO細(xì)胞株。
3、 如權(quán)利要求1所述的方法可用于馴化Vero細(xì)胞株。
4、 如權(quán)利要求1所述的方法可用于馴化BHK21細(xì)胞株。
5、 利用權(quán)利1所述的方法可用于馴化一類(lèi)有重要意義的工程細(xì)胞株。
全文摘要
一種快速建立懸浮、高密度工程細(xì)胞株的方法，原細(xì)胞株為貼壁、低密度狀態(tài)，適應(yīng)在有血清培養(yǎng)基的環(huán)境中生長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)原細(xì)胞株進(jìn)行懸浮狀態(tài)適應(yīng)的馴化先接入方瓶，更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行傳代，連續(xù)傳代使其適應(yīng)在方瓶中的新環(huán)境，轉(zhuǎn)至搖瓶，連續(xù)傳代使之逐步適應(yīng)搖瓶中的懸浮狀態(tài)，獲得了適應(yīng)無(wú)血清、懸浮、高密度狀態(tài)的細(xì)胞株。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101302492SQ20071010711
公開(kāi)日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2007年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月8日
發(fā)明者丹 散, 李榮皓, 穎 王, 磊 石, 峰 高, 黎志良 申請(qǐng)人:中美奧達(dá)生物技術(shù)(北京)有限公司;北京涌泉萬(wàn)方生物技術(shù)有限公司