專利名稱：Knsl4的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能和預測乳腺癌患者預后的標志物用途及其應用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項目屬于已知基因的新功能、新用途和應用方法的發(fā)明。具體講是發(fā)現(xiàn)了已知基因KNSL4的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能，并可作為乳腺癌患者預后預測的基因標志；發(fā)明了基于KNSL4基因mRNA表達量預測乳腺癌患者預后的方法。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在歐美國家發(fā)病率高達10％，而低發(fā)的亞洲國家近年來發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)呈顯著的上升趨勢，我國大城市中乳腺癌發(fā)病率已居女性惡性腫瘤的首位，成為婦女健康的重大威脅。乳腺癌是全身性疾病，腫瘤細胞的淋巴道和血道播散導致的全身轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者治療失敗和死亡的關(guān)鍵所在。乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)將為轉(zhuǎn)移機制的研究提供線索，為轉(zhuǎn)移的早期診斷提供分子標志，為患者的預后評估提供客觀指征，為抗轉(zhuǎn)移治療提供基因靶點。
目前，關(guān)于驅(qū)動蛋白樣DNA結(jié)合蛋白基因(kinesin-like DNA bindingprotein，KNSL4，kinesin-like 4，KIF22，Accession No.NM_007317)及其蛋白產(chǎn)物Kid的研究報道都是關(guān)于分子結(jié)構(gòu)和基于分子結(jié)構(gòu)的生物學功能的研究，已知該基因編碼的Kid蛋白與微管結(jié)合驅(qū)動染色體的運動，在細胞有絲分裂中起關(guān)鍵作用。但KNSL4基因的改變對于細胞生物學行為的影響、與組織病理學改變的關(guān)系、基因表達量檢測方法和應用的研究還是空白。

發(fā)明內(nèi)容
為了篩選乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，采用Differential display RT-PCR(DDRT-PCR)方法，通過比較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌患者的原發(fā)癌和配對的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織基因表達的差異和實時定量RT-PCR方法驗證，發(fā)現(xiàn)了KNSL4的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的新功能。
建立了定量RT-PCR檢測KNSL4 mRNA表達量的方法；經(jīng)大樣本量的臨床病例檢測，發(fā)現(xiàn)KNSL4 mRNA水平與乳腺癌的多種臨床病理因素及轉(zhuǎn)移預后相關(guān)，與患者無轉(zhuǎn)移生存期呈負相關(guān)(P＜0.05)，因此，KNSL4mRNA可作為乳腺癌患者預后預測的分子標志物；確定了基于KNSL4mRNA表達量可以區(qū)分預后好和預后差的患者群的臨界值，高于臨界值的患者判斷判斷為預后好，低于臨界值的患者為預后差。
主要發(fā)明如下
驅(qū)動蛋白樣DNA結(jié)合蛋白(kinesin-like DNA binding protein，Kid，KIF22，Accession No.NP_015556)基因(kinesin-like 4，KNSL4，AccessionNo.NM_007317)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能。
KNSL4基因表達水平預測乳腺癌患者預后的標志物用途，基于KNSL4基因表達水平可以預測乳腺癌患者的預后，KNSL4表達水平高的患者預后好，表達水平低的患者預后差。
基于KNSL4基因表達水平預測乳腺癌患者預后的檢測及應用方法，a.提取腫瘤患者原發(fā)癌組織標本的細胞總RNA；以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA為模板，用KNSL4基因和管家基因的特異性引物和熒光標記探針進行實時定量PCR擴增，計算KNSL4基因mRNA的相對表達量為2-ΔCt，其中，ΔCt＝CtKNSL4-CtGAPDH(CT為實時定量PCR時熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的循環(huán)數(shù))；b.根據(jù)乳腺癌患者復發(fā)轉(zhuǎn)移陽性病例和復發(fā)轉(zhuǎn)移陰性病例的KNSL4 mRNA表達量，確定預后判斷的臨界值。KNSL4 mRNA表達量高于臨界值的患者預后好，而低于臨界值的患者預后差。
所述的檢測方法，以原發(fā)癌組織中KNSL4 mRNA表達量為1.40×10-3作為對腫瘤患者預后判斷的臨界值，高于該臨界值的患者則判斷為預后好，低于該臨界值則判斷為預后差。
所述的檢測方法，KNSL4基因?qū)崟r定量RT-PCR的引物和探針序列是上游引物5’-CAAGGAGGGAGTGGAATG-3’；下游引物5’-GGAGGTGGACGACGAGTAG-3’；特異性熒光標記探針序列5’(FAM)-GCGGCGATCTCAGGAGCTGGTCGCT-3’(TAMRA)。
所述的檢測方法，其熒光報告基團還可以是SYBR Green I、VIC、TETJOE、NED、TAMRA、Cy3、Cy5、ROX、Texas Red等熒光染料。


附圖是KNSL4 mRNA表達與患者生存期分析圖。
具體實施例方式
一、病例資料及標本取材1.病例資料108例乳腺原發(fā)癌組織均為2002年1月至2003年10月天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科收治的乳腺癌患者手術(shù)切除標本，組織學分型及臨床分期根據(jù)《中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范》第八分冊(乳腺癌)。年齡為29-73歲，中位年齡51歲；浸潤性非特殊型癌101例(單純癌60例、浸潤性導管癌24例、髓樣癌12例、腺癌5例)和浸潤性特殊型癌7例(乳頭狀癌3例、粘液癌癌2例、大汗腺癌2例)；臨床分期I期16例，II期63，III期25例，IV期4例；組織學分級I級12例、II級73例、III級23例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性52例，陽性56例；ER、PR采用免疫組化檢測，陽性細胞數(shù)達30％以上為陽性，ER陰性36例，陽性68例，PR陰性55例，陽性病例49例，4例ER、PR免疫組化資料缺失；雙乳癌3例；平均隨訪43個月，11例有遠處轉(zhuǎn)移，45例無遠處轉(zhuǎn)移，62例無隨訪結(jié)果。
2.標本取材組織標本取材分為兩部分，用于mRNA表達檢測的新鮮標本經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于組織病理學診斷和免疫組織化學檢測的標本經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋，制備4μm組織切片。
二、Real-time RT-PCR方法檢測KNSL4的mRNA表達1.細胞總RNA的提取采用Trizol一步法快速提取組織細胞總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。
2.cDNA的合成20μl SuperScript II(invitrogen公司)反應體系。其中包括5μg totalRNA，0.5μg Oligo(dT)，10nmol dNTP mix，65℃變性5分鐘，冰浴后加入First-Strand Buffer，0.2μmol DTT和40U RNA酶抑制劑，42℃溫育2分鐘后加入SuperScriptII 200U，42℃反應50分鐘。反應完成后70℃，15分鐘終止反應。
3.實時定量PCR檢測KNSL4的mRNA表達KNSL4引物采用oligo6.0和primer5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計并進行最大優(yōu)化，GAPDH引物參考文獻。引物和探針序列及片段長度見表1。實時定量PCR反應采用Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG試劑盒(Invitrogen公司)。20μl反應體系中包括由40ng total RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA，10μl Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG，10μM的上下游引物和TaqMan探針各0.4μl。PCR反應條件為50℃溫育2分鐘，95℃預變性2分鐘；95℃30秒，62℃1分鐘，45個循環(huán)。實時定量PCR過程中熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)為CT值，計算各個樣本KNSL4的CT值與管家基因GAPDH的CT值的差值ΔCT，2-□CT即為各個樣本中KNLS4相對于同一樣本中GAPDH的表達量。FAM(6-carboxy-fluorescein)為熒光報告基團，TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine)為熒光淬滅基團。熒光報告基團還可為SYBR GreenI、VIC、JOE、NED、TAMRA、Cy3、Cy5、ROX、Texas Red等熒光染料。
三、統(tǒng)計學處理統(tǒng)計學分析采用SPSS10.0軟件。兩組之間比較采用Student’st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，Kaplan-Meier法用于患者的生存期分析。
四、結(jié)果1.KNSL4 mRNA表達與臨床因素的關(guān)系乳腺原發(fā)癌中KNSL4的mRNA表達隨著腫瘤的進展總體呈下調(diào)趨勢，臨床分期III-IV期組KNSL4的mRNA表達低于I-II期組(t＝3.842，p＜0.001)，差異有顯著性，平均相對表達量下調(diào)50.0％；KNSL4的mRNA表達在ER和PR的陰性和陽性組之間比較，陰性組均低于陽性組，但差異無顯著性(t＝-1.245，p＝0.216；t＝-1.871，p＝0.065)；在不同年齡組、病理類型和組織學分級之間差異均無顯著性(p＞0.05)。檢測上述病例中76例c-erbB-2的蛋白表達，27例c-erbB-2的蛋白表達陽性，陽性率為35.5％。乳腺原發(fā)癌中KNSL4 mRNA表達在c-erbB-2陽性組低于陰性組(t＝3.215，p＜0.01)，相對表達量下調(diào)52.3％。見表2。
2.KNSL4 mRNA表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系乳腺原發(fā)癌中KNSL4的mRNA表達在淋巴結(jié)陽性數(shù)1-3個組高于陰性組1.5倍(p＜0.05)，還高于8個以上組2.6倍，差異有顯著性(p＜0.05)。將轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)分為0-3個組和大于3個組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移大于3個組KNSL4的mRNA表達低于0-3個組，差異有顯著性(p＜0.01)，平均相對表達量下調(diào)37.5％。見表3。
3.KNSL4 mRNA表達與患者生存期的關(guān)系根據(jù)乳腺癌患者復發(fā)轉(zhuǎn)移陽性病例和復發(fā)轉(zhuǎn)移陰性病例的KNSL4mRNA的相對表達量，將1.40×10-3作為預后分組的臨界值，有遠處轉(zhuǎn)移的病例KNSL4 mRNA的表達量小于1.40×10-3，與無遠處轉(zhuǎn)移病例比較差異有顯著性(p＜0.01)。見表4，圖1。KNSL4 mRNA表達量高于臨界值的患者預后好，而低于臨界值的患者預后差。
五、結(jié)論1.KNSL4表達水平與乳腺癌轉(zhuǎn)移和預后相關(guān)，具有轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能。
2.KNSL4 mRNA表達可以作為乳腺癌預后預測的基因標志。
3.建立了實時定量RT-PCR檢測KNSL4 mRNA相對表達量的方法，確定了用于乳腺癌預后判斷的臨界值。
六、補充說明1.用于乳腺癌預后判斷的KNSL4 mRNA相對表達量的臨界值可能由于今后應用樣本量的增加達到更優(yōu)化。
2.實時定量PCR的熒光標記也可為非特異的SYBR green I等熒光染料雙鏈DNA內(nèi)插式非特異性標記。
3.還可以采用絕對定量PCR擴增、分子雜交等方法檢測KNSL4基因的mRNA表達量，及免疫化學方法檢測KNSL4基因的蛋白表達量，用于乳腺癌患者預后預測。
4.采用不同的檢測方法其預后判斷的閾值不同。
表1 Real-time RT-PCR引物和Tagman探針序列及擴增片斷長度

表2 KNSL4的mRNA表達與臨床各因素的關(guān)系分組例數(shù)t/F P
年齡≤48 48 2.02±1.62＞48 60 1.76±2.09 0.703 ＞0.05病理類型單純癌60 1.78±1.72浸潤性導管癌 25 1.90±1.44髓樣癌12 2.20±3.09 0.282 ＞0.05腺癌 51.50±0.86其他 62.40±2.99臨床分期I-II 79 2.16±2.09III-IV29 1.10±0.77 3.842 ＜0.001組織學分級I 12 1.63±1.22II73 2.03±2.01 0.751 ＞0.05III 23 1.52±1.76ER陽性 68 2.09±2.12陰性 36 1.60±1.40 -1.245 ＞0.05PR陽性 49 2.29±2.24陰性 55 1.59±1.51 -1.871 ＞0.05c-erbB-2蛋白陰性 49 2.24±2.33陽性 27 1.09±0.69 3.215 ＜0.01
表3 KNSL4 mRNA表達與轉(zhuǎn)移和預后的關(guān)系例數(shù)

t/F P
淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)(1)0 52 1.85±1.641-322 2.83±2.933.292＜0.05*4-714 1.63±1.20＞＝8 20 1.09±0.82淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)(2)0-374 2.14±2.132.727＜0.01＞329 1.10±0.77遠處轉(zhuǎn)移無遠處轉(zhuǎn)移組 64 2.00±1.96遠處轉(zhuǎn)移組 19 1.46±1.93 1.0340.304
*淋巴結(jié)陽性數(shù)1-3個組KNSL4的mRNA表達高于陰性組和大于8個組(p＜0.05)表4以KNSL4 mRNA量對表達1.40×10-3為臨界值對患者預后分組

權(quán)利要求
1.驅(qū)動蛋白樣DNA結(jié)合蛋白(kinesin-like DNA binding protein，Kid，KIF22，Accession No.NP_015556)基因(kinesin-like 4，KNSL4，AccessionNo.NM_007317)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能。
2.KNSL4基因表達水平預測乳腺癌患者預后的標志物用途，其特征在于基于KNSL4基因表達水平可以預測乳腺癌患者的預后，KNSL4表達水平高的患者預后好，表達水平低的患者預后差。
3.基于KNSL4基因表達水平預測乳腺癌患者預后的檢測及應用方法，其特征在于a.提取腫瘤患者原發(fā)癌組織標本的細胞總RNA；以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA為模板，用KNSL4基因和管家基因的特異性引物和熒光標記探針進行實時定量PCR擴增，計算KNSL4基因mRNA的相對表達量為2-ΔCt，其中，ΔCt＝CtKNSL4-CtGAPDH(CT為實時定量PCR時熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的循環(huán)數(shù))；b.根據(jù)乳腺癌患者復發(fā)轉(zhuǎn)移陽性病例和復發(fā)轉(zhuǎn)移陰性病例的KNSL4 mRNA表達量，確定預后判斷的臨界值，KNSL4 mRNA表達量高于臨界值的患者預后好，而低于臨界值的患者預后差。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于以原發(fā)癌組織中KNSL4 mRNA表達量為1.40×10-3作為對腫瘤患者預后判斷的臨界值，高于該臨界值的患者則判斷為預后好，低于該臨界值則判斷為預后差。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于KNSL4基因?qū)崟r定量RT-PCR的引物和探針序列是上游引物5’-CAAGGAGGGAGTGGAATG-3’；下游引物5’-GGAGGTGGACGACGAGTAG-3’；特異性熒光標記探針序列5’(FAM)-GCGGCGATCTCAGGAGCTGGTCGCT-3’(TAMRA)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于熒光報告基團還可以是SYBR Green I、VIC、TETJOE、NED、TAMRA、Cy3、Cy5、ROX、Texas Red等熒光染料。
全文摘要
本發(fā)明公開了①驅(qū)動蛋白樣DNA結(jié)合蛋白基因KNSL4具有轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的功能；②KNSL4基因表達水平預測乳腺癌患者預后的標志物用途；③基于KNSL4mRNA表達量用于乳腺癌患者預后判斷的應用方法建立了實時定量RT－PCR檢測KNSL4的mRNA表達水平的方法，根據(jù)患者復發(fā)轉(zhuǎn)移陽性病例和復發(fā)轉(zhuǎn)移陰性病例的KNSL4基因mRNA表達水平確定判斷患者預后的臨界值，KNSL4mRNA表達量高于臨界值的患者預后好，而低于臨界值的患者預后差。
文檔編號C12N15/11GK101089198SQ20071011163
公開日2007年12月19日 申請日期2007年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月4日 公開號200710111637.8
發(fā)明者馮玉梅, 李曉青, 萬艷芳 申請人:天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院