專利名稱：：一種提高蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成胚率的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種提高蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成胚率的方法，屬于植物育種
技術領域：
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背景技術：
：游離小孢子培養(yǎng)是在花藥培養(yǎng)基礎上發(fā)展起來的一項新興技術，是植物細胞工程領域最活躍的研究課題之一。小孢子具有單倍性，這在作物育種上具有重要的應用價值，具體表現在(1)通過單倍體的染色體加倍即可獲得純合的二倍體，從而大幅度縮短育種所需的年限。一般常規(guī)育種至少需5-7年才能篩選出純合穩(wěn)定的自交系，而利用游離小孢子培養(yǎng)技術獲得純合自交系只需1-2年。(2)對單倍體或由其加倍而成的雙單倍體(DH)的選擇實質上是孢子選擇，這比常規(guī)育種從F2代群體中對一個特定基因型選擇的效果大為提高。尤其是倍性性狀的選擇，如對具有隱性基因個體，DH群體中頻率為1/64，而在F2群體中頻率僅為1/4096。單倍體植物的單套染色體不存在顯性基因掩蓋隱性基因的現象，因此單倍體植株的表現型和基因型是一致的，這在雜交育種和誘變育種中可避免"誤選"，從而大大提高工作效率。游離小孢子培養(yǎng)技術在自交系純化尤其是及縮短品種更新周期中發(fā)揮了重大作用。常規(guī)育種獲得一個遺傳穩(wěn)定的自交系一般需要5~8年的時間，而利用小孢子培養(yǎng)技術只需要12年。另外，游離小孢子培養(yǎng)技術也為現代基因工程研究提供了很好的受體材料。正是由于其上述優(yōu)點，故在許多作物中均開展工作了游離小孢子培養(yǎng)的研究工作。利用游離小孢子培養(yǎng)來加速育種材料快速純化的技術已在國外種苗公司廣泛用于十字花科作物育種上，幾乎成為一項常規(guī)的育種技術。而在我國，這項技術僅在甘藍型油菜、白菜等少數十字花科作物的品種選育上應用。比較突出的實例有2個，一個是北京巿農林科學院蔬菜研究中心利用這一技術選育出了"桔紅心"大白菜；另一個是河南省農科院利用DH群體選育成豫白菜7號。而在其他十字花科蔬菜作物如花椰菜、綠菜花、蘿卜等尚處于由試驗階段向育種實踐的應用中。蘿卜是異花授粉作物，其雜種優(yōu)勢十分明顯。利用游離小孢子培養(yǎng)技術可在較短時間內固定雜種優(yōu)勢。與常規(guī)育種技術相比，具有效率高、工作量小等優(yōu)點。從親緣關系上來講，蘿卜屬與蕓薹屬同屬于十字花科作物，具有一定的血緣關系。但該屬是十字花科作物中最不容易進行游離小孢子培養(yǎng)成功的材料之一。對其小孢子培養(yǎng)研究表明，該屬是十字花科作物中最不容易進行游離小孢子培養(yǎng)成功的材料，目前只見到2篇成功的報道。一篇是日本學者YoshihitoTakahata(1996)在日本蘿卜的6個品種中獲得了胚狀體，成胚率為0.2-8.3個/105個小孢子；另一篇為我課題組的報道，成胚率為16.0個/105個小孢子。從目前研究水平來看，蘿卜小孢子培養(yǎng)的成胚率較低，成胚基因型范圍狹窄，尤其在目標基因型中尚不能獲得胚狀體，這些嚴重限制了該技術在蘿卜育種上的應用。
發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種有效提高蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成胚率的方法。為實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案一種提高蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成胚率的方法，包括如下步驟(1)滅菌花蕾用60-80%酒精滅菌20—40秒(優(yōu)選30秒)，再用含1-3%(體積百分比濃度，優(yōu)選2%)有效氯離子的次氯酸鈉溶液滅菌10-20分鐘；在用無菌水沖洗2-4次(優(yōu)選3次)，每次2-6分鐘(優(yōu)選5分鐘)；(2)花藥預處理在無菌條件下取出花藥，接種在Bs-13(含13%蔗糖，添加甘露醇濃度15g/L)培養(yǎng)基和Bs-13(含13n/。蔗糖，添加加秋水仙素濃度20mg/L)培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)皿中接種30個花藥；將接種后的花藥在4'C低溫條件下低溫培養(yǎng)2-4天(優(yōu)選3天)；(3)分離小孢子將低溫處理后的花藥，在無菌條件下分別取出，在研缽中用研棒輕輕擠壓花藥使小孢子游離出來，經400目尼龍網過濾后收集在10ml的離心管中，用Bs-13培養(yǎng)基洗滌2-4次(優(yōu)選3次)，每次2-4分鐘(優(yōu)選3分鐘)；(4)小孢子培養(yǎng)將小孢子在1/2NLN液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用血球計數板將小孢子終濃度調整為12Xl()S個/ml，25。C暗培養(yǎng)10-20天；培養(yǎng)中的小孢子經32-35°C(優(yōu)選33-C)熱激24小時后，于25。C進行暗培養(yǎng)，直至長出胚狀體。發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明經過了大量的實驗，對數據進行分析和優(yōu)選，最終獲得了提高蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成胚率的方法。本方法在進行蘿卜小孢子培養(yǎng)之前，將花藥離體，并在合適的培養(yǎng)基上進行低溫預處理，這種預處理對蘿卜小孢子培養(yǎng)產生兩方面的影響①使未成胚的蘿卜品種產生了胚狀體；②使成胚蘿卜品種的成胚率有所提高，從16.0個/105個小孢子提高到40.0個/105個小孢子，提高了2.5倍。利用該方法進行中國蘿卜游離小孢子培養(yǎng)，可獲得較高的頻率的胚狀體，解決了中國蘿卜游離小孢子培養(yǎng)胚狀體再生的難題。下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步說明，并非對本發(fā)明的限定，依照本領域公知的現有技術，本發(fā)明的實施方式并不限于此，因此凡依照本發(fā)明公開內容所作出的本領域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。圖1為未經預處理小孢子少量成胚或未成胚。圖2為花藥經低溫預處理后成胚率提高。圖3為花藥低溫處理使未成胚蘿卜品種形成胚狀體。圖4為花藥低溫處理使成胚蘿卜品種的成胚率提高。圖5為胚狀體正常綠化。圖6為胚狀體正常成苗。具體實施例方式實施例1:(1)滅菌取盛花期的花蕾，花蕾用70%酒精滅菌30秒，再用含2%有效氯離子的次氯酸鈉溶液滅菌15分鐘；在用無菌水沖洗3次，每次5分鐘。(2)花藥預處理在無菌條件下取出花藥，接種在Bs-13(含13%蔗糖，添加甘露醇濃度15g/L)培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)皿中接種30個花藥；將接種后的花藥在4t低溫條件下低溫培養(yǎng)3天。(3)分離小孢子將低溫處理后的花藥，在無菌條件下分別取出，在研缽中用研棒輕輕擠壓花藥使小孢子游離出來，經400目尼龍網過濾后收集在10ml的離心管中，用Bs-13培養(yǎng)基洗滌3次，每次2-4分鐘3分鐘。(4)小孢子培養(yǎng)將小孢子在1/2NLN液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用血球計數板將小孢子終濃度調整為l-2Xl()S個/m1,培養(yǎng)中的小孢子經33'C熱激24小時后，于25'C進行暗培養(yǎng)，直至長出胚狀體。將胚狀體轉至B5-2生芽培養(yǎng)基中，置于25'C的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長成小孢子植株；選擇生長正常的小孢子植株，切下腋芽，置于Bs-2生根培養(yǎng)基上生根，最終獲得小孢子植株再生苗。3周后統(tǒng)計出胚數。以不經低溫處理的花蕾為對照。統(tǒng)計結果見表l。表1<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明所述的各種培養(yǎng)基及其配制方法為本領域公知常識，典型成份如下B5-13培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含大量元素硝酸鉀(KN03)2527.5毫克，硫酸鎂(MgS04'7H20)246.5毫克，氯化f5(CaCl2'2H20)150毫克，硫酸銨((NH4)2S04)134毫克，磷酸二氫鈉(NaH2P04H20)150毫克；微量元素硫酸錳(MnS04H20)10毫克，硼酸(H3B03)3.0毫克，硫酸鋅(ZnS047H2O)2.0毫克，鉬酸鈉(Na2Mo04'2H2O)0.25毫克，硫酸銅(CuSO4'7&0)0.025毫克，氯化鈷(CoCl261120)0.025毫克，碘化鉀(KI)0.75毫克；有機物肌醇100毫克，煙酸1毫克，鹽酸吡哆醇l毫克，鹽酸硫胺素10毫克；EDTA鐵鈉鹽40毫克；蔗糖濃度13%。配制及滅菌方法Bs-2固體培養(yǎng)基大量元素、微量元素、有機物及鐵鹽含量均與B5-13相同，蔗糖濃度為2%，瓊脂濃度0.8%。1/2NLN培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含大量元素硝酸鉀(KN03)62.5毫克，硫酸鎂(MgS04'7H20)62.5毫克，硝酸鈣(Ca(N03)24H2O)250毫克，磷酸二氫鉀(101204)62.5毫克；微量元素硫酸錳(MnS04'4H20)22.3毫克，硼酸(H3B03)6.2毫克，硫酸鋅(ZnS04*7H20)8.6毫克，鉬酸鈉(Na2Mo04'2H20)0.25毫克，硫酸銅(CuS04'5820)0.025毫克，氯化鈷(CoCl26H2O)0.025毫克；有機物甘氨酸2毫克，煙酸5毫克，鹽酸吡哆醇0.5毫克，鹽酸硫胺素0.5毫克，葉酸0.5毫克，生物素0.05毫克，肌醇100毫克，還原型谷胱甘肽30毫克，谷氨酰胺800毫克，絲氨酸100毫克；EDTA鐵鈉40毫克；蔗糖濃度13%。權利要求1.一種提高蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成胚率的方法，其特征在于包括如下步驟(1)滅菌花蕾用60-80％酒精滅菌20-40秒，再用含1-3％有效氯離子的次氯酸鈉溶液滅菌10-20分鐘；在用無菌水沖洗2-4次，每次2-6分鐘；(2)花藥預處理在無菌條件下取出花藥，接種在B5-13(含13％蔗糖，添加甘露醇濃度15g/L)培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)皿中接種30個花藥；將接種后的花藥在4℃低溫條件下低溫培養(yǎng)2-4天；(3)分離小孢子將低溫處理后的花藥，在無菌條件下分別取出，在研缽中用研棒輕輕擠壓花藥使小孢子游離出來，經400目尼龍網過濾后收集在10ml的離心管中，用B5-13培養(yǎng)基洗滌2-4次，每次2-4分鐘；(4)小孢子培養(yǎng)將小孢子在1/2NLN液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用血球計數板將小孢子終濃度調整為1～2×105個/ml，25℃暗培養(yǎng)10-20天；培養(yǎng)中的小孢子經32-35℃熱激24小時后，于25℃進行暗培養(yǎng)，直至長出胚狀體。2.根據權利要求1所述的一種提高蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成胚率的方法，其特征在于所述(1)滅菌花蕾用70%酒精滅菌30秒，再用含2%有效氯離子的次氯酸鈉溶液滅菌15分鐘；在用無菌水沖洗3次，每次5分鐘。3.根據權利要求1所述的一種提高蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成胚率的方法，其特征在于所述(2)花藥預處理在無菌條件下取出花藥，接種在B5-13(含13%蔗糖，添加甘露醇濃度15g/L)培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)皿中接種30個花藥；將接種后的花藥在4℃低溫條件下低溫培養(yǎng)3天。4.根據權利要求1所述的一種提高蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成胚率的方法，其特征在于所述(3)分離小孢子將低溫處理后的花藥，在無菌條件下分別取出，在研缽中用研棒輕輕擠壓花藥使小孢子游離出來，經400目尼龍網過濾后收集在10ml的離心管中，用B5-13培養(yǎng)基洗滌3次，每次3分鐘。5.根據權利要求1所述的一種提高蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成胚率的方法，其特征在于所述(4)小孢子培養(yǎng)將小孢子在1/2NLN液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用血球計數板將小孢子終濃度調整為12X105個/ml，25℃暗培養(yǎng)15天，；培養(yǎng)中的小孢子經33℃熱激24小時后，于25℃進行暗培養(yǎng)，直至長出胚狀體。全文摘要本發(fā)明公開了一種提高蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成胚率的方法，屬于植物育種
技術領域：
。該方法包括如下步驟(1)滅菌；(2)花藥預處理；(3)分離小孢子；(4)小孢子培養(yǎng)。發(fā)明的優(yōu)點是本方法在進行蘿卜小孢子培養(yǎng)之前，將花藥離體，并在合適的培養(yǎng)基上進行低溫預處理，這種預處理對蘿卜小孢子培養(yǎng)產生兩方面的影響①使未成胚的蘿卜品種產生了胚狀體；②使成胚蘿卜品種的成胚率有所提高，從16.0個/10⁵個小孢子提高到40.0個/10⁵個小孢子，提高了2.5倍。利用該方法進行中國蘿卜游離小孢子培養(yǎng)，可獲得較高的頻率的胚狀體，解決了中國蘿卜游離小孢子培養(yǎng)胚狀體再生的難題。文檔編號C12N5/04GK101343619SQ200710118650公開日2009年1月14日申請日期2007年7月11日優(yōu)先權日2007年7月11日發(fā)明者付傳翠,麗張,白小娟申請人:北京市農林科學院