專利名稱：人胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hES細(xì) 胞)的生物學(xué)特性，獲得類似早期胚胎的球體結(jié)構(gòu)一擬胚體(embryoid body, EB)，以地塞米松和人胰島素聯(lián)合I型膠原的方法，實現(xiàn)體外定向高效誘導(dǎo)人 胚胎干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的技術(shù)。
背景技術(shù)：
由各種原因(病毒、藥物、腫瘤及遺傳性疾病等)引發(fā)的終末期肝病嚴(yán)重 威脅人類健康。目前，它的治療主要依賴于原位肝移植，但是，供體的極度短 缺、移植及手術(shù)本身相關(guān)的死亡、終生服用免疫抑制劑及其所致的致死性并發(fā) 癥等一系列問題極大的限制了這一治療手段的廣泛開展。肝細(xì)胞移植和生物人 工肝作為肝移植的輔助方式，可以部分緩解上述問題，但其來源細(xì)胞同樣也面 臨著存活期短，難以大量擴增，特別是隨著培養(yǎng)時間的延長，肝功能逐漸降低 等問題，因此，尋求合適的肝細(xì)胞來源已屬迫在眉睫。通過胚胎千細(xì)胞分化定向誘導(dǎo)獲取肝細(xì)胞是解決肝細(xì)胞來源的有效途徑。從 不同角度來分，胚胎干細(xì)胞分化的分類方法有很多種，例如以誘導(dǎo)劑的不同分類、 以分化過程的不同分類等，其中，以分化過程可分為l.胚胎干細(xì)胞自發(fā)分化； 2.胚胎干細(xì)胞直接以誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)其分化；3.胚胎干細(xì)胞先形成擬胚體(即EB)， 之后將一個個球形EB (含有眾多細(xì)胞、具有三維結(jié)構(gòu))直接接種，再添加各種 誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)分化。其中，1998年，人ES細(xì)胞的成功建系打開了體外生產(chǎn)可供移 植治療的所有類型的人體細(xì)胞、組織乃至器官的大門。因此，體外定向誘導(dǎo)人ES 細(xì)胞分化為肝臟細(xì)胞成為目前研究的熱點(Lavon N, Benvenisty N. Study of hepatocyte differentiation using embryonic stem cells. Journal of Cellular Biochemistry, 2005, 96:1193—1202.)。EB是ES細(xì)胞在體外一定條件下自發(fā)形成的類似早期胚胎的球體結(jié)構(gòu)，其 三胚層的形成與分化基本模擬了體內(nèi)胚胎早期發(fā)育中組織細(xì)胞分化的過程，可 以作為研究哺乳動物胚胎發(fā)育尤其是早期譜系決定、胚層相互誘導(dǎo)等現(xiàn)象的理 想體外模型。然而，現(xiàn)有的誘導(dǎo)分化方法是將EB作為一個球體直接接種，這
樣會使細(xì)胞層疊，既不利于充分接觸，操作中也只能通過其周邊爬出的那些細(xì) 胞來進(jìn)行形態(tài)觀察，因此，現(xiàn)有的誘導(dǎo)分化方法還有必要改進(jìn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)的人胚胎干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為肝 細(xì)胞的方法。使該方法在操作中便于形態(tài)觀察，同時讓細(xì)胞與因子和胞外基 質(zhì)能夠充分接觸，從而能有效地以及快捷地誘導(dǎo)出肝細(xì)胞。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的方法， 采用以下步驟1) 擴增人胚胎干細(xì)胞；2) 形成成熟擬胚體；3) 將誘導(dǎo)的成熟擬胚體消化成單個細(xì)胞；4) 將單個細(xì)胞以條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，得到肝細(xì)胞。 上述方法中，更具體的步驟包括1) 采用膠原酶IV消化法對hESCs進(jìn)行傳代擴增，獲得大量干細(xì)胞；2) 將hESCs用擬胚體培養(yǎng)液懸浮、培養(yǎng)，接種到低吸附性的細(xì)菌皿中形成 成熟擬胚體EB;3) 將成熟的囊性EB用胰蛋白酶消化為單個細(xì)胞；4) 將單個細(xì)胞后接種到預(yù)先包被有I型膠原的組織培養(yǎng)皿，以含有地塞米 松和人胰島素的條件誘導(dǎo)液培養(yǎng)，通過觀察鑒定得到肝細(xì)胞。其中，所述步驟l)具體過程為將人ES細(xì)胞系，接種在小鼠胚胎成纖維細(xì) 胞飼養(yǎng)層上，37°C， 5%<:02條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液為無血清人ES細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM 培養(yǎng)基、含20%血清替代物、1%非必需氨基酸、O.lmM卩-巰基乙醇、lmM谷氨酰 胺、4ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF、 50IU/mL青霉素、50IU/mL鏈霉素， 每天更換培養(yǎng)液；培養(yǎng)一周后，用lmg/mL膠原酶IV在37'C條件下孵育10 20分 鐘進(jìn)行消化傳代，離心，重懸，以1:4 1:6接種于新的培養(yǎng)皿，獲得匯合生長的 大量干細(xì)胞。所述步驟2)具體過程為將干細(xì)胞用膠原酶消化，離心，沉淀用擬胚體培 養(yǎng)液懸浮，細(xì)胞懸液移入100mm的低吸附性細(xì)菌培養(yǎng)皿中，37°C， 5%C02條件 下培養(yǎng)，每兩天更換l次培養(yǎng)液，所述擬胚體培養(yǎng)液為無血清人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng) 液撤除bFGF因子KnockoutDMEM培養(yǎng)基、20%血清替代物、1%非必需氨基酸、0.1mM(5-巰基乙醇、lmM谷氨酰胺、50IU/mL青霉素、50IU/mL鏈霉素；取呈集 落狀生長的人ES細(xì)胞，將其接種于低吸附性的細(xì)菌皿，1周左右成成熟EB。所述步驟3)具體過程為在顯微鏡下利用口吸管吸取技術(shù)選取培養(yǎng)7d的、 大小較為均一的EB，將其先后置于兩個含有PBS的細(xì)菌皿中洗滌兩遍，然后 顯微鏡下利用口吸管轉(zhuǎn)移至預(yù)先添加有0.25%胰蛋白酶的細(xì)菌皿中進(jìn)行消化， 37°C， 5%C02條件下孵育大約5分鐘，直至輕輕吹打可以全部形成單個細(xì)胞， 再以血清中止消化，用滴管轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，1000rpm，離心5分鐘，棄 上清，沉淀即為所需單個細(xì)胞。所述步驟4)具體過程為將挑選的單個細(xì)胞接種到預(yù)先包被有I型膠原 的培養(yǎng)板上，加入肝細(xì)胞誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液，37°C,5%C02條件下培養(yǎng)，每兩天 更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化進(jìn)程至獲得肝細(xì)胞；所述肝細(xì)胞誘導(dǎo)條件 培養(yǎng)液IMDM培養(yǎng)基，含20%胎牛血清，50nM地塞米松，0.0625U/ml人胰 島素。所述步驟4)中，誘導(dǎo)時間為21天。本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，利用人胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性，形成成熟 囊性擬胚體，通過地塞米松、人胰島素等因子聯(lián)合胞外基質(zhì)I型膠原從體外 定向誘導(dǎo)其分化為肝細(xì)胞。該方法用0. 25胰酶-O. 02% EDTA將EB消化為單 個細(xì)胞，再進(jìn)行接種并添加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，操作中便于形態(tài)觀察，同時單個細(xì) 胞與因子和胞外基質(zhì)能夠充分接觸，可以在20天左右誘導(dǎo)出肝細(xì)胞，較現(xiàn)有 方法提前一周左右。本發(fā)明提供了一種新的種子細(xì)胞來源的方法，為細(xì)胞移 植和生物人工肝的臨床替代治療等奠定了基礎(chǔ)。


圖l:為人ES細(xì)胞及形成的EB圖片。其中(a)生長旺盛的人ES細(xì)胞， 呈克隆樣生長，形似鳥巢狀(40x); (b d) 3d/7d(成熟)/14d(老化)的EB (100"。圖2:為細(xì)胞誘導(dǎo)分化后形態(tài)學(xué)觀察圖片。其中(e)光學(xué)顯微鏡下(40x)， 條件培養(yǎng)后分化出較多的上皮樣細(xì)胞。(f)透射式電鏡下，誘導(dǎo)14d后的細(xì)胞 其內(nèi)細(xì)胞器相當(dāng)豐富，可見大量線粒體、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、糖原顆粒、溶酶體等細(xì) 胞器，細(xì)胞表面出現(xiàn)類似指狀突起的微絨毛(分別由箭頭所示)。圖3: RT-PCR檢測肝臟細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。其中l(wèi)-6分別為DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)、AFP、 ALB、 CK19、 CYP1B1和p-actin的擴增結(jié)果，A、 B和C
分別為誘導(dǎo)14d后的細(xì)胞、正常人胎肝細(xì)胞(陽性對照)和人EB的擴增結(jié)果。 圖4:為免疫熒光化學(xué)檢測圖片。其中圈示處為雙核、多核細(xì)胞。 圖5:為ICG攝取試驗圖片。其中左邊箭頭示孵育30分鐘內(nèi)已攝取ICG的細(xì)胞，右邊箭頭示未攝取ICG的細(xì)胞。圖6:為PAS試驗圖片。其中箭頭示細(xì)胞內(nèi)貯存的糖原顆粒。圖7:為分化細(xì)胞尿素和白蛋白的8h分泌量的圖片。其中1.未經(jīng)誘導(dǎo)的人ES細(xì)胞；2. EB培養(yǎng)于條件誘導(dǎo)培養(yǎng)液14d; 3.陽性對照(正常人胎肝細(xì)胞)具體實施方式
實施例l、人ES細(xì)胞的培養(yǎng)及EB的形成將人ES細(xì)胞系H9 (外購于Wicdl公司)，接種在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層 (昆明小白鼠，血清、0.25胰酶-0.02% EDTA及DMEM培養(yǎng)基(外購于Hyclone公 司)(經(jīng)Y射線照射滅活有絲分裂活性，接種在0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿中)上，培 養(yǎng)液為無血清人ES細(xì)胞培養(yǎng)液KnockoutDMEM培養(yǎng)基(外購于Gibco公司)、含 20。/o血清替代物(外購于Gibco)、 0.1mM(3-巰基乙醇(外購于Gibco)、 lmM谷氨酰胺 (外購于Gibco)、 4ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF，外購于Chemicon)、 50IU/mL青霉素、50IU/mL鏈霉素，1。/。的非必需氨基酸(夕卜購于Gibco公司)。37°C, 5%。02條件下培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液。 一周左右細(xì)胞匯合生長，用lmg/mL膠原 酶IV(外購于Gibco)在37r條件下孵育10 20分鐘進(jìn)行消化傳代，500rpm離心 2min，重懸于新鮮制備的人ES細(xì)胞培養(yǎng)液中，以1:4 1:6的自身接種比率接種于 新的培養(yǎng)皿。匯合生長的細(xì)胞用膠原酶IV消化，500rpm離心2min，沉淀用擬胚體培養(yǎng)液(即 無血清人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液撤除bFGF因子)懸浮，細(xì)胞懸液移入100mm的低吸 附性細(xì)菌培養(yǎng)皿(Greiner)中，37°C， 5%C02條件下培養(yǎng)，每兩天更換l次培 養(yǎng)液。人ES細(xì)胞呈集落狀生長，如圖la，將其接種于低吸附性的細(xì)菌皿后，ES 細(xì)胞呈懸浮生長，逐漸聚集成小團(tuán)，如圖lb，約1周左右囊性變，如圖lc， 稱為成熟EB，繼續(xù)培養(yǎng)，光學(xué)顯微鏡下觀察，EB逐漸形成中空的囊狀，如圖 ld ，成為老化的EB。
實施例2、 EB消化為單個細(xì)胞在顯微鏡下利用口吸管吸取技術(shù)選取培養(yǎng)7d的、大小較為均一的EB，將 其先后置于兩含有磷酸緩沖液(PBS)的細(xì)菌皿中洗滌兩遍，然后轉(zhuǎn)移(顯微 鏡下利用口吸管轉(zhuǎn)移)至預(yù)先添加有0.25%胰蛋白酶(Amresco)的細(xì)菌皿中進(jìn) 行消化，37°C， 5%C02條件下孵育大約5分鐘，直至輕輕吹打可以全部形成 單個細(xì)胞，再加入含10%血清(HYCLONE)的培養(yǎng)基中止消化1分鐘，用滴 管將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，1000rpm，離心5分鐘，棄上清。實施例3、單個細(xì)胞向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化將實施例2中離心所得沉淀以肝細(xì)胞誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液重懸，該培養(yǎng)液成分 為IMDM培養(yǎng)基(Sigma)，含20。/。胎牛血清(Gibco)， 50nM地塞米松(Sigma)， 0.0625U/ml人胰島素(Lilly France S.A.S)。再接種到預(yù)先包被有I型膠原的培 養(yǎng)板上。37°C,5%C02條件下培養(yǎng)，每兩天更換培養(yǎng)液，觀察條件培養(yǎng)的定向 誘導(dǎo)分化作用。實施例4、誘導(dǎo)分化前后的細(xì)胞鑒定 1、細(xì)胞形態(tài)觀察光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后形態(tài)的變化，記錄細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過 程。并取誘導(dǎo)分化21d的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，以PBS洗滌兩遍，在41:條件下以3% 戊二醛于培養(yǎng)板原位前固定2h，再以1%鋨酸后固定1 h，用蔗糖緩沖液反復(fù)漂洗， 梯度乙醇脫水、加入丙酮后，以樹脂滲透、包埋、聚合，用ULTRACUTE/S型切 片機超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色，Philips CM120透射電子顯微鏡觀察 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。光學(xué)顯微鏡下觀察到，在誘導(dǎo)之初，細(xì)胞處于旺盛的分裂狀態(tài)，細(xì)胞大，核 仁多個且明顯，圖2e為光學(xué)顯微鏡下觀察到，條件培養(yǎng)后分化出較多的上皮樣 細(xì)胞。隨著時間的推移，細(xì)胞逐漸由圓形變?yōu)殚L梭形或多角形，分化出較多的上 皮樣細(xì)胞，可見雙核和多核細(xì)胞。透射式電鏡下觀察到，誘導(dǎo)14d后的細(xì)胞其內(nèi) 細(xì)胞器相當(dāng)豐富，可見大量特征性的圓形或橢圓形、大小不一、嵴稀的線粒體、 分布于光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周圍的簇狀糖原顆粒、溶酶體、高爾基體等細(xì)胞器,，細(xì)胞表 面出現(xiàn)類似指狀突起的毛細(xì)膽管或微絨毛，符合肝細(xì)胞典型的超微結(jié)構(gòu)，如圖2f 所示。
2、 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測人ES細(xì)胞誘導(dǎo)前、后相關(guān)基因mRNA 的表達(dá)變化用TRIzol試劑(Invitrogen)提取誘導(dǎo)分化前及誘導(dǎo)分化21天(7天EB十14天條 件培養(yǎng))的細(xì)胞總RNA，分別用下述引物AFP (S: 5'-TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA-3'，A: 5'-CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA-3')， ALB ( S: 5'-TGCTTGAAGGTGCTGATGACAGGG-3'，A: 5'-AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3')， CK19 ( S: 5 '-ATGGCCGAGCAGAACCGGAA-3'，A: 5'CCATGAGCCGCTGGTACTCC-3')， CYPIBI( S: 5'-GAGAACGTACCGGCCACTATCACT-3'，A: 5 '-GTTAGGCCACTTCAGTGGGTCATGAT-3')， P-actin( S: 5'-GATCCACATCTGCTGGAAGG陽3'，A: 5 '-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3') 進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(反轉(zhuǎn)錄體系RNA1.5ul， oligodT2ul， lOmMdNTPmixture 2ul， RNAase抑制劑0.5ul， 5xAMV4ul， AMVase lul， DEPC7夂9ul;程序室 溫10分鐘，42。Cl小時，72。C10分鐘，4。C①)(PCR體系:引物2ul， cDNA2ul， 10xPCRbuffer2ul， 2.5mMdNTPmixture 1.6ul， rTaq0.5ul，水11.9ul;程序94。C 5分鐘，33個循環(huán)(94°C30秒，50°C-60°C 30秒，72°C 30秒)，72。C延伸10 分鐘)，PCR產(chǎn)物用l。/。瓊脂糖凝膠電泳，用AlphaImager3300軟件對結(jié)果進(jìn)行分 析。(所有RT-PCR應(yīng)用產(chǎn)品均購自Takara公司)電泳結(jié)果顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞弱表達(dá)原始肝細(xì)胞標(biāo)志AFP和成熟肝細(xì)胞標(biāo)志 ALB，而強表達(dá)CK19和細(xì)胞色素P450 (CYP) 1B1，結(jié)果見圖3。3、 間接免疫細(xì)胞化學(xué)檢測將誘導(dǎo)21d的細(xì)胞用PBS洗滌兩遍，4%多聚甲醛固定30分鐘，0.1X的Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)破膜15分鐘，山羊血清(中杉金橋生物技術(shù)有限 公司)室溫封閉抗原30分鐘后，分別與甲胎蛋白(alpha-fetoprotein， AFP) (R&D)、 細(xì)胞角蛋白18 (cytokeratin18， CK18， SantaCruz)標(biāo)記的一抗工作液(中杉金橋 生物技術(shù)有限公司)4t:孵育過夜，再以不同熒光素(FITC、 TRITC)標(biāo)記的二 抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)避光繼續(xù)孵育30分鐘，DAPI (4',6-二脒基-2-苯 基B引哚，Roche)襯染細(xì)胞核，置共聚焦顯微鏡下觀察，用Laser-Sharp 2000軟件 分析圖像。間接免疫熒光結(jié)果從蛋白水平證實以肝細(xì)胞條件誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)后，部 分細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞早期標(biāo)志AFP與成熟肝細(xì)胞特異性標(biāo)志CK18(結(jié)果見圖4)。4、 靛青綠(indocyanine green， ICG) (Sigma)的攝取、排泌實驗 誘導(dǎo)分化21d的細(xì)胞用PBS充分洗滌后，加入l mg/mlICG于37"C孵育30分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞顏色的變化；再用PBS沖洗2遍，換回完全培養(yǎng)液繼續(xù)常規(guī)培 養(yǎng)，并觀察細(xì)胞顏色的變化。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后細(xì)胞約50%被染成深綠色，而其余的顏色無變化，見附圖 5;換回完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)6h之內(nèi)，著色細(xì)胞的顏色完全退去，說明誘導(dǎo)后的 細(xì)胞大約50%具有類似肝細(xì)胞的染料排泄功能。5、 糖原染色實驗即高碘酸-雪夫反應(yīng)(periodicacid-Schiff， PAS) PAS試劑盒(上海仁寶醫(yī)用試劑研究有限公司)用于檢測細(xì)胞內(nèi)的糖原。將涂片滴加固定液固定3 5分鐘，水洗，晾干；滴加過碘酸于涂片上氧化10分鐘，水 洗，晾干；放入雪夫氏溶液中，置37'C水浴箱5 10分鐘；取出后流水洗滌10 20分鐘，晾干，鏡檢。鏡檢誘導(dǎo)后細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，PAS陽性物呈紅色顆粒或彌散狀，定位于細(xì)胞漿中。 紅色的深度與所含糖原的量有關(guān)量少呈淡紅色，量多呈深紅色，結(jié)果見圖6， 說明誘導(dǎo)后細(xì)胞具備類似肝細(xì)胞的貯存糖原的能力。6、 誘導(dǎo)分化14d的細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗換用無血清的IMDM培養(yǎng)基，加入 0.15mol/LNH4Cl，常規(guī)培養(yǎng)8h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，在全自動生化分析儀 (Olympus， Tokyo, Japan)上檢測培養(yǎng)上清中尿素和ALB的分泌量。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化14d的細(xì)胞具有與正常肝細(xì)胞類似的分泌ALB和氨 基代謝生成尿素的功能，而未加以誘導(dǎo)的ES細(xì)胞組幾乎未測到尿素和ALB。以上實驗結(jié)果證明通過形成成熟擬胚體并將其消化為單個細(xì)胞，以細(xì)胞 因子(地塞米松+人胰島素)聯(lián)合胞外基質(zhì)(I型膠原)的方法能夠在21d 分化人胚胎干細(xì)胞為肝細(xì)胞，誘導(dǎo)分化高效，操作過程中易于觀察從而為進(jìn) 一步優(yōu)化誘導(dǎo)條件創(chuàng)造了條件。
權(quán)利要求
1、一種人胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的方法，采用以下步驟1)擴增人胚胎干細(xì)胞；2)形成成熟擬胚體；3)將誘導(dǎo)的成熟擬胚體消化成單個細(xì)胞；4)將單個細(xì)胞以條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，得到肝細(xì)胞。
2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，更具體步驟包括1) 采用膠原酶IV消化法對hESCs進(jìn)行傳代擴增，獲得大量干細(xì)胞；2) 將hESCs用擬胚體培養(yǎng)液懸浮、培養(yǎng)，接種到低吸附性的細(xì)菌皿中形成 成熟擬胚體EB;3) 將成熟的囊性EB用胰蛋白酶消化為單個細(xì)胞；4) 將單個細(xì)胞后接種到預(yù)先包被有I型膠原的組織培養(yǎng)皿，以含有地塞米 松和人胰島素的條件誘導(dǎo)液培養(yǎng)，通過觀察鑒定得到肝細(xì)胞。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟l)具體過程為-將人ES細(xì)胞系，接種在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞詞養(yǎng)層上，37。C,5。/。C02條件下培養(yǎng)， 培養(yǎng)液為無血清人ES細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)基、含20%血清替代物、1%非必 需氨基酸、0.1mM(3-巰基乙醇、lmM谷氨酰胺、4 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子 bFGF、 50IU/mL青霉素、50IU/mL鏈霉素，每天更換培養(yǎng)液；培養(yǎng)一周后，用 lmg/mL膠原酶IV在37nC條件下孵育10 20分鐘進(jìn)行消化傳代，離心，重懸，以 1:4 1:6接種于新的培養(yǎng)皿，獲得匯合生長的大量干細(xì)胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟2)具體過程為將 干細(xì)胞用膠原酶消化，離心，沉淀用擬胚體培養(yǎng)液懸浮，細(xì)胞懸液移入100mm的 低吸附性細(xì)菌培養(yǎng)皿中，37°C， 5%C02條件下培養(yǎng)，每兩天更換l次培養(yǎng)液， 所述擬胚體培養(yǎng)液為無血清人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液撤除bFGF因子Knockout DMEM培養(yǎng)基、20%血清替代物、1%非必需氨基酸、0.1mM(5-巰基乙醇、lmM 谷氨酰胺、50IU/mL青霉素、50IU/mL鏈霉素；取呈集落狀生長的人ES細(xì)胞，將 其接種于低吸附性的細(xì)菌皿，1周左右成成熟EB。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述步驟3) 具體過程為在顯微鏡下利用口吸管吸取技術(shù)選取培養(yǎng)7d的、大小較為均一 的EB，將其先后置于兩個含有PBS的細(xì)菌皿中洗滌兩遍，然后顯微鏡下利用 口吸管轉(zhuǎn)移至預(yù)先添加有0.25%胰蛋白酶的細(xì)菌皿中進(jìn)行消化，37°C， 5%C02 條件下孵育大約5分鐘，直至輕輕吹打可以全部形成單個細(xì)胞，再以血清中止 消化，用滴管轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，1000rpm，離心5分鐘，棄上清，沉淀即 為所需單個細(xì)胞。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟4)具體過程為 將挑選的單個細(xì)胞接種到預(yù)先包被有I型膠原的培養(yǎng)板上，加入肝細(xì)胞誘導(dǎo)條 件培養(yǎng)液，37°C,5%C02條件下培養(yǎng)，每兩天更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞定向誘導(dǎo) 分化進(jìn)程至獲得肝細(xì)胞；所述肝細(xì)胞誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液IMDM培養(yǎng)基，含20% 胎牛血清，50nM地塞米松，0.0625U/ml人胰島素。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟4)誘導(dǎo)時間為 21天。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人胚胎干細(xì)胞(hES)體外定向誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的方法，首先利用hES細(xì)胞的高度自我更新和增殖的生物學(xué)特性，采用膠原酶IV消化法進(jìn)行傳代擴增，獲得大量干細(xì)胞；再將hES細(xì)胞接種到低吸附性的細(xì)菌皿中形成成熟擬胚體(EB)；然后將成熟的囊性EB用0.25胰酶-0.02％EDTA消化為單個細(xì)胞后接種到預(yù)先包被有I型膠原的組織培養(yǎng)皿，以含有地塞米松和人胰島素的條件誘導(dǎo)液培養(yǎng)，并觀察鑒定其向肝細(xì)胞方向分化。本發(fā)明提供hES細(xì)胞高效分化為肝細(xì)胞的方法，同時此法使得后續(xù)的鑒定工作更加簡單、有效，為干細(xì)胞移植或生物人工肝治療重癥肝炎、肝衰竭等疾病奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/08GK101117626SQ20071011872
公開日2008年2月6日 申請日期2007年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日
發(fā)明者習(xí)佳飛, 劉雨瀟, 雪 南, 施雙雙, 楊印祥, 王韞芳, 白慈賢, 裴海云, 裴雪濤, 琳 陳 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所