專利名稱：：一種檢測食源性病毒的基因芯片及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測食源性病毒的基因芯片及試劑盒，屬于檢驗(yàn)檢疫
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景食品安全問題一直是國際社會和各國政府關(guān)注的熱點(diǎn)問題，據(jù)估計美國每年由于食物中毒導(dǎo)致76，000，000人發(fā)病，5000人死亡。目前已知有200種以上的疾病可通過食物傳播，并且有一半以上的食物中毒案例沒有找到病因，表明引起食物中毒的病因大大超過200種。在食品微生物中毒因素中，一直以來由于檢測手段的限制，通常只檢測細(xì)菌指標(biāo)，而不能對食品中的病毒污染進(jìn)行有效的監(jiān)控和中毒分析，據(jù)美國FDA估計，由病毒引起的食物中毒每年導(dǎo)致近10，000，000個病例，128人死亡；2006年日本發(fā)生諾瓦克病毒流行，導(dǎo)致300多萬人發(fā)病。今年以來，我國的廣東、北京、香港等地相繼出現(xiàn)諾瓦克病毒中毒事件，引起社會和我國政府的高度關(guān)注和重視。除了諾瓦克病毒外，食物源性病毒還包括甲肝病毒、輪狀病毒、腸道病毒和星狀病毒，主要存在于貝類等水產(chǎn)品和通過水源污染的食品中。據(jù)報道香港進(jìn)口的貝類產(chǎn)品中約10%含有諾瓦克病毒，美國已多次從我國進(jìn)口的水產(chǎn)品中檢出甲肝病毒(HAV)和諾瓦克病毒(Norovimses)，嚴(yán)重影響我國食品的正常出口，同時表明我國食品存在病毒污染問題。可以說，食源性病毒污染是一個世界性問題。由于食源性病毒的體外培養(yǎng)和分離非常困難，如食品中毒中最為常見和重要的諾瓦克病毒和甲肝病毒中，只有甲肝病毒能在寄主細(xì)胞內(nèi)繁殖，利用寄主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，但由于甲肝病毒在細(xì)胞中生長緩慢，需要培養(yǎng)3-4代才有可能出現(xiàn)可見病變，并且食品中往往病毒含量很低，因此，用培養(yǎng)法往往需要30-60天才能分離出甲肝病毒，不適合用于食品中甲肝病毒的檢測。諾瓦克病毒更不能在體外繁殖，也無動物模型，不能用組織培養(yǎng)法或動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分離檢測，同時其感染劑量非常低，估計為10、1(^感染單位，常規(guī)的電子顯微鏡法的檢出限量為105-106病毒顆粒/1111，其靈敏度不能滿足確保食品安全的要求。最近基于ELISA技術(shù)的放射免疫法(EIA)已經(jīng)用于諾瓦克病毒的臨床診斷，但由于檢測限量的限制不適合于食品中病毒的檢測。因此，建立快速、有效、可靠的食品中病毒檢測方法非常必要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的檢測食源性病毒的基因芯片。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測通量大、靈敏度高、檢測時間短、便于使用的檢測食源性病毒的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案-一種檢測食源性病毒的基因芯片，在固相載體表面固定有若干檢測探針和質(zhì)控對照探針，檢測探針由檢測甲肝病毒、星狀病毒、諾瓦克病毒G1型、諾瓦克病毒G2型、輪狀病毒、脊灰病毒1型、脊灰病毒2型和脊灰病毒3型的探針組成；質(zhì)控對照由點(diǎn)樣陽性質(zhì)控探針、芯片雜交陽性質(zhì)控探針和芯片陰性質(zhì)控探針組成。所述檢測探針具有序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.11所示的核苷酸序列，5'AminolinkerC6修飾。所述點(diǎn)樣陽性質(zhì)控探針具有序列表SEQIDNo.12所示的核苷酸序列，5'端進(jìn)行HEX修飾。所述芯片雜交陽性質(zhì)控探針具有序列表SEQIDNo.13所示的核苷酸序列，5'AminolinkerC6修飾。所述芯片陰性質(zhì)控探針為1X點(diǎn)樣液。這里我們的定義固定在基質(zhì)載體上的DNA被稱為探針(probe),而來自生物樣品的核酸被稱為耙標(biāo)(target)。探針的設(shè)計原理是:病毒基因組一般都有高保守而且種特異的區(qū)域，比如衣殼蛋白等?？梢葬槍@些區(qū)域設(shè)計特異探針，達(dá)到檢測病毒所屬種的目的。根據(jù)基因型和血清型的已知對應(yīng)關(guān)系，可通過判讀探針對應(yīng)的基因型來進(jìn)一步確定此病毒的血清型。本發(fā)明從從NCBI的Taxonomybrowser中下載5種指定病毒的所有序列(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.htm1/)J吏用的數(shù)據(jù)截至2005-10-14。1.Astrovirus星狀病毒TaxonomyID:12702;Rank:species;共368條。從其中10條全長序列的比對結(jié)果看，病毒在ORF2區(qū)域序列的保守性不好，而ORFl區(qū)域的保守性遠(yuǎn)高于ORF2，適合用來設(shè)計此病毒的探針。ORF2區(qū)域更適合用來區(qū)分此病毒的不同血清型。星狀病毒的序列中與0RF1相關(guān)的序列有68條，這些序列大致定位于ORF1區(qū)域上6個獨(dú)立的序列片段。針對其中序列保守性較好的一個區(qū)域設(shè)計了一對引物，進(jìn)而針對PCR產(chǎn)物的同一個位置設(shè)計了4條探針，分別針對不同的序列亞型。2.rotavirus輪狀病毒:TaxonomyID:10941/10942/10943;分別是1741,42,89;還有3條HumanrotavirusADRV-N的，共1875條。未見報道能同時擴(kuò)增三組rotavirus的通用引物，經(jīng)過分析，認(rèn)為很難找到rotavirus的A，B，C各組的共有探針，只能按三個種來做，根據(jù)發(fā)病率，先考慮A組。3.Poliovirus脊髓灰質(zhì)炎病毒TaxonomyID:138953;共1784條。在結(jié)構(gòu)蛋白VP1設(shè)計引物和探針。引物序列系文獻(xiàn)報道，經(jīng)檢驗(yàn)，認(rèn)為符合種特異型引物的要求。然后在此引物擴(kuò)增區(qū)設(shè)計出一條探針。4.HumanhepatitisAvirus甲肝病毒TaxonomyID:208726;共76條。序歹U庫其中注釋為"5'non-codingregion"的序列普遍在100bp左右，不便于設(shè)計，所以使用注釋為"polyprotein"的長度約為1700bp的18條序列進(jìn)行引物、探針設(shè)計。5.Norovirus諾瓦克病毒Norovirusgenogroup1，TaxonomyID:122928;共76條；Norovirusgenogroup2，TaxonomyID:122929;共357條。根據(jù)InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses網(wǎng)站上的病毒分類，下載了NCBI上的Norwalkvirus種下面的Hawaiicalicivirus、Norovirusgenogroup1、Norovirusgenogroup2的全部序歹(J，同時也根據(jù)ICTV網(wǎng)站的注釋下載了Mexicovirus的序列U22498。在設(shè)計探針的時候基于上面的序列進(jìn)行。引物系文獻(xiàn)報道，然后直接針對genogroup1和genogroup2分別設(shè)計了特異探針，其中針對genogroup2設(shè)計的探針也能與Hawaiicalicivirus、Mexicovirus雜交。委托英駿生物技術(shù)有限公司合成探針。要在醛基化表面固定的DNA分子必須具有一個伯胺基。5'-氨基，又稱為連接氨基，具有通過6-12個碳原子間隔臂連接在5'核苷酸的磷酸基團(tuán)上的一個伯胺基。而為了使探針分子在芯片上伸展開來，利于靶標(biāo)探針的雜交，故合成時在每個探針的5'加上了一個氨基和15個T。合成好的探針先溶解在雙蒸水中，終濃度為40pM，然后加入到晶芯^基因芯片點(diǎn)樣液(博奧生物，產(chǎn)品目錄號440010)中。使用方法1.配制寡聚核苷酸水溶液G060^M);2.轉(zhuǎn)5nl上述核酸溶液到384孔板或96孔板中，加入5pl2X基因芯片點(diǎn)樣液，并用移液器充分混合后，即可用于基因芯片點(diǎn)樣；3.帶DNA樣品的點(diǎn)樣板使用完畢可置于-2(TC保存。合成的寡聚核苷酸探針使用5'連接氨基直接連接在醛基化載體表面上。鍵合發(fā)生于連接氨基上的非鍵電子對親核進(jìn)攻醛基基團(tuán)上電正性的碳原子時。隨后的脫水步驟在多數(shù)芯片點(diǎn)樣過程(如，濕度<40%時)均會發(fā)生，使得在氨基化DNA分子和芯片表面間形成共價鍵連接。所述固相載體(用于固定DNA探針的基質(zhì)載體)選自尼龍膜、纖維素膜、玻片、金屬片、硅片、陶瓷片或有機(jī)高分子制作的薄膜，優(yōu)選玻片。玻片的優(yōu)點(diǎn)在于來源方便；其表面經(jīng)過化學(xué)處理后，能夠共價結(jié)合DNA;玻片能耐受高溫、高離子溶液環(huán)境；玻片表面光滑，對液體來說是非浸透性的，故雜交體系的體積可以很小，有利于探針和耙標(biāo)的結(jié)合；玻片的背景熒光低，不會給檢測帶來較大的噪音。所述固相載體表面進(jìn)行了醛基修飾。玻片表面要經(jīng)過化學(xué)修飾后，才能牢固地固定DNA。現(xiàn)有的玻片表面化學(xué)修飾主要有氨基修飾、醛基修飾和巰基修飾。在與PCR產(chǎn)物、cDNA和蛋白質(zhì)等較大分子的實(shí)驗(yàn)中，使用氨基化表面問題不大。而與寡聚核苷酸(5-10個核苷)或多肽(5-20個氨基酸)的實(shí)驗(yàn)中，非特異的吸附會帶來空間排列上的缺陷。因?yàn)槟繕?biāo)分子是吸附在表面上，整個分子長度的非特異吸附會阻礙其與耙標(biāo)分子進(jìn)行有效的相互作用，因此我們此次選用的是醛基修飾的基片。是醛基修飾的一般過程是將硅羥基化的玻片用3-氨丙基三乙氧基硅烷處理，使玻片表面帶上一層末端氨基，然后用戊二醛處理，戊二醛分子兩端的醛基可以和玻片表面的氨基形成希夫堿，將它們以長鏈碳橋的形式連接起來。再用NaBH4或NaCNBH3還原希夫堿形成穩(wěn)定的雙鍵。選擇光學(xué)載玻片(玻片)作為醛基基片制備的原材料，尺寸為75.5mmx25.2mmx1.0mm。根據(jù)大批量的玻片測定結(jié)果和點(diǎn)樣儀對點(diǎn)樣基片的要求，要求長寬尺寸誤差S±0.2mm，厚度誤差S士0.05mm。同時要求外觀無劃痕、無缺損。親疏水性能力、熒光背景能力及固定能力檢測項(xiàng)目均合格的基片為合格基片。探針和對照樣品以點(diǎn)陣(微陣列)的形式分布在芯片上。每個芯片上有四個點(diǎn)陣(圖1)。因此一個芯片可以同時檢測四份樣品。四個點(diǎn)陣的設(shè)計完全相同。各有五種病毒的探針，同時設(shè)置核酸固定陽性對照、實(shí)驗(yàn)陽性和陰性對照。各點(diǎn)陣上探針的分布如圖2。表1探針名稱、序列及縮寫對應(yīng)表探針名稱符號縮寫序列點(diǎn)樣陽性質(zhì)控探針QC(Hex)GTCACATGCGATGGATCGAGCTCCTTTATCATCGTTCCCACCTTAATGCASEQIDNo.12芯片雜交陽性質(zhì)控探針PCCTCATGCCCATGCCGATGCSEQIDNo.13芯片陰性質(zhì)控探針NCix點(diǎn)樣液—甲肝病毒HAVCATTGGAACAGGAACTTCAGCGSEQIDNo.1星狀病毒HasV-lGAGATCCGTGATGTTAATGGSEQIDNo.2星狀病毒HasV-2GAGATCCGTGATGCTAATGGSEQIDNo.3星狀病毒HasV-3GAGATACGTGATGCTAATGGSEQIDNo.4諾瓦克病毒Gl型NV陽G1GTAAATGATGATGGCGTCTAASEQIDNo.5諾瓦克病毒G2型NV-G2AGGGCGATCGCAATCTGGCTSEQIDNo.6輪狀病毒RotGTGGTATATTCAATACCATACSEQIDNo.7脊灰病毒1型Poli-lCCGCGCGAAGAAAGACTCTSEQIDNo.8脊灰病毒2型Poli-2-lAGTAATCCCTTCAACGGCCSEQIDNo.9脊灰病毒2型Poli-2-2CTGCTGGCGCGCTTTGTSEQIDNo.10脊灰病毒3型Poli-3GTTGCTTCGGGAGTGACAAAGSEQIDNo.11Hex的作用是確認(rèn)核酸固定過程無誤；陰性對照和陽性對照的作用是確認(rèn)反應(yīng)條件正常，以保證結(jié)果的有效性。正常情況下陽性對照的樣點(diǎn)有熒光信號，陰性對照則沒有。芯片的點(diǎn)樣是由博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯⑧SmartArrayerTM48微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)完成的。制備完成后的芯片經(jīng)晶芯⑧LuxScan10K微陣列芯片掃描儀在PMT/Powe產(chǎn)卯/900的掃描參數(shù)下掃描，在同一張芯片內(nèi)，同一根針點(diǎn)樣，點(diǎn)直徑偏差小于20%。點(diǎn)陣整齊，無明顯連點(diǎn)現(xiàn)象，即證明芯片是合格的。所述探針點(diǎn)樣濃度為20uM,每條探針橫向重復(fù)5點(diǎn)，點(diǎn)直徑約150pm，點(diǎn)間距300^。所述芯片每張具有4個相同矩陣，探針排布方式為每個矩陣9行10列。所述芯片片基(固相載體)、圍欄和蓋片購于北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司?；蛐酒噭┖械氖褂昧鞒虨闃颖究俁NA的提取卡RT-PCR卡病毒特異性片段擴(kuò)增卡標(biāo)記擴(kuò)增+雜交卡清洗芯片+掃描卡結(jié)果判讀。一種檢測食源性病毒的基因芯片試劑盒，由以下組分組成(1)反轉(zhuǎn)錄l-6:64^1，-20匸保存;(2)反轉(zhuǎn)錄Buffer:130^1，-20匸保存；(3)RNA酶抑制劑18nl，-20°<:保存；(4)反轉(zhuǎn)錄酶18|al，-20^保存；(5)PCRMixl-6:110^1，-2(rC避光保存;(6)Taq5U/jul，5pl，.2(TC保存；(7)2xPCR載樣液50|^1，2-8。C保存；(8)DNAMarker:20pl，2-8。C保存；(9)雜交液150^，2-8t:避光保存；(10)20xSSC:100ml，室溫保存；(11)腦SDS:20ml，室溫保存；(12)檢測芯片4片，2-8。C保存；(13)芯片蓋片4片，2-8。C保存；(14)GV電泳染色液10)^1，2-8'C保存；(15)去核酸酶滅菌水1.5ml，-20匸保存。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和創(chuàng)新之處在于(l)高通量整合了食源性病毒檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域最常見的5種病毒，實(shí)現(xiàn)了同時檢測，實(shí)用性強(qiáng)；(2)快速檢測時間僅為4小時；(3)特異對探針序列進(jìn)行了嚴(yán)格篩選，使芯片上所有探針僅與其相對應(yīng)的某一種病毒的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)，有效避免了交叉反應(yīng)導(dǎo)致的假陽性問題；(4)靈敏芯片的檢測靈敏度為108病毒顆粒/g組織樣品(大約相當(dāng)于lng病毒核酸/g組織樣品)，比RT-PCR靈敏度高至少12個數(shù)量級；(5)重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠經(jīng)過重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證明該檢測系統(tǒng)可以保證檢測結(jié)果的重現(xiàn)性和精確性，可廣泛應(yīng)用于出入境檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)的食品安全監(jiān)察。下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖1為芯片點(diǎn)樣區(qū)域的矩陣位置圖。圖2為商品化的食源性病毒基因芯片探針排列。圖3-l為甲肝疫苗理論雜交圖，圖3-2為甲肝疫苗實(shí)際掃描圖。圖4-1為星狀病毒糞便標(biāo)本理論雜交圖，圖4-2為星狀病毒糞便標(biāo)本實(shí)際掃描圖。圖5-1為諾瓦克病毒糞便標(biāo)本理論雜交圖，圖5-2為諾瓦克病毒糞便標(biāo)本實(shí)際掃描圖。圖6-1為輪狀病毒糞便標(biāo)本理論雜交圖，圖6-2為輪狀病毒糞便標(biāo)本實(shí)際掃描圖。圖7-1為脊灰病毒糞便標(biāo)本理論雜交圖，圖7-2為脊灰病毒糞便標(biāo)本實(shí)際掃描圖。圖8為輪狀病毒PCR檢測結(jié)果。圖9-1至圖9-5為芯片檢測輪狀病毒PCR產(chǎn)物。圖10-1至圖10-4為芯片穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:制備基因芯片一.材料和方法1.材料委托英駿生物技術(shù)有限公司合成探針，而為了使探針分子在芯片上伸展開來，利于靶標(biāo)探針的雜交，故合成時在每個探針的5'加上了一個氨基和15個T。片基醛基化玻璃片基，北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司。晶芯SrnartA^raye^TM48微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)，博奧生物有限公司。二.方法1.探針的設(shè)計與合成收集GenBank公布的待檢病毒基因，經(jīng)過同源性比對找出保守區(qū)段，再以比較嚴(yán)格且均一的條件(Tm值、GC含量、二級結(jié)構(gòu)等)計算出符合這些種病毒保守區(qū)段的探針，并在5'端以氨基修飾，見表1。檢測探針具有序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.11所示的核苷酸序列，5'AminolinkerC6修飾。點(diǎn)樣陽性質(zhì)控探針具有序列表SEQIDNo.12所示的核苷酸序列，5，端進(jìn)行HEX修飾。芯片雜交陽性質(zhì)控探針具有序列表SEQIDNo.13所示的核苷酸序列，5'AminolinkerC6修飾。2.芯片的制備探針用點(diǎn)樣緩沖液溶解，所述探針點(diǎn)樣濃度為20uM，每條探針橫向重復(fù)5點(diǎn)，點(diǎn)直徑約150pm，點(diǎn)間距30(^ni，點(diǎn)樣均勻度的標(biāo)準(zhǔn)方差約為15%。探針排布一張芯片上4個相同矩陣，矩陣位置如圖l所示。芯片每個矩陣9行10列，探針排列如圖2所示。點(diǎn)樣后洗片點(diǎn)樣后洗液中攪拌清洗2rain;點(diǎn)樣后封閉液中攪拌封閉5min;去離子水中攪拌清洗2min，重復(fù)三次，2000rpm離心lmin。利用芯片裝配工具將四區(qū)域芯片圍欄貼于芯片表面，置于暗盒室溫保存。實(shí)施例2:檢測方法一.材料1.甲肝病毒陽性樣本和脊髓灰質(zhì)炎病毒陽性樣本來源于市售疫苗。2.諾瓦克II型、星狀病毒和輪狀病毒樣本來源于北京兒童醫(yī)院，分離自16份嬰幼兒的糞便標(biāo)本。二.方法1.用常規(guī)方法(TRIzol法)提取待測樣本的總RNA。2.RNA的RT-PCR(1)引物序列見表2。表2:引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>甲型肝炎病毒HAV-FTGTGCTATGGTTCCTGGTGA510甲型肝炎病毒HAV-RCCCAATCGAATCTGAAGCAT星狀病毒HAsV-FCATTGTTTGTTGTCATACTAAC286星狀病毒HAsV-RACATGTGCTGCTGTTACTAT諾瓦克病毒I型GI-SKFCTGCCCGAATTYGTAAATG330諾瓦克病毒I型GI-SKRCCAACCCARCCATTRTACA諾瓦克病毒II型COG2FCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG387諾瓦克病毒II型GIISKRCCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT輪狀病毒RotavirusA_Primer—FGGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG392輪狀病毒RotavirusA_Primer—RGATCCTGTTGGCCATCC脊灰病毒Poliovirus—Primer1—FTTTGTGTCAGCGTGTAATGA480脊灰病毒PoliovirusPrimer1RGAATTCCATGTCAAATCTAGA(2)反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系及條件表3:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系_反應(yīng)液組成_體積基因特異引物(5mM)lul隨機(jī)引物2uldNTPMixU0mM)1ul樣品總RNA(lng至5ug)6iU混勻，65'C加熱變性5分鐘，冰浴5分鐘10XFirst-StrandBuffer21MgCL2(25mM)4ulDTT(0.1M)2ulRNAout1u1混勻，25。C加熱2minSuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶1lU混勻，25。C10min,42。C60tnin，70°C15min，4°C保溫3.PCR擴(kuò)增根據(jù)病毒序列設(shè)計特異引物，以反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系如表4所示，條件如表5所示。表4:PCR反應(yīng)體系反應(yīng)成分體積<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表5:PCR擴(kuò)增程序<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.凝膠電泳檢測取23plPCR產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增情況，如果目的片斷明顯，則可以用于芯片雜交。5.雜交反應(yīng)雜交反應(yīng)的基本流程是芯片固定一芯片雜交一芯片清洗。其中芯片清洗是用不同離子強(qiáng)度的溶液依次漂洗芯片，以除去游離的及非特異性結(jié)合的樣品。(1)芯片固定去掉雜交圍欄上的膠紙；膠面朝上，將雜交圍欄上放在雜交模具中心的同樣形狀的凹槽中，注意要使雜交圍欄與凹槽契合；用手捏著芯片上貼有標(biāo)簽紙的一端，將芯片另一端頂著模具的頂端，然后將芯片正面(貼有標(biāo)簽紙)朝下放入模具；在芯片背面相應(yīng)位置用鑷子輕輕向下按，使雜交圍欄緊貼在芯片上。雜交圍欄的作用是隔開不同的雜交樣品，防止交叉污染。貼好雜交圍欄以后，往雜交盒底部的水槽中均勻加入少量蒸餾水(約200tU)，以防止雜交過程中雜交液大量揮發(fā)，并且能形成一定厚度的液膜；然后把芯片正面(有雜交圍欄的一面)朝上放入雜交盒中；按芯片擺放方向蓋上蓋片，注意使蓋片上的凸面朝下，使蓋片上的四個突起正好覆蓋四個點(diǎn)陣，形成四個微量的雜交室。將雜交盒的蓋板扣上，確保槽板兩端的定位銷分別插入蓋板兩端的定位銷孔中。扣上蓋板后，分別將兩個金屬夾卡進(jìn)兩側(cè)，注意動作要平緩，不要讓雜交盒有大的震動，以防止雜交液濺出點(diǎn)陣區(qū)域；另外，金屬夾需要完全卡進(jìn)，以確保雜交盒的密封性。(2)芯片雜交雜交體系(每個點(diǎn)陣12nl)見表6。一張芯片共4個點(diǎn)陣，可以雜交四份樣本。表6:雜交反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>將以上四份12pl雜交液用移液器混勻后3000rpm離心30s，95°C熱變性3分鐘(在PCR儀中)。冰浴驟冷lmin。用移液器將四份雜交液分別注入蓋片上的四個小孔；確認(rèn)雜交液覆蓋芯片上的四個點(diǎn)陣以后，蓋緊雜交盒蓋，放入42。C恒溫水浴鍋中，雜交2小時，使樣品與探針充分反應(yīng)。(3)芯片清洗洗液I2xSSC，0.2%SDS;洗液II0.2xSSC(洗去殘留的SDS);將洗液I、II預(yù)熱至42。C。雜交結(jié)束后，快速將芯片從雜交盒中拿出(蓋片可以重復(fù)利用)，將芯片轉(zhuǎn)移到盛放洗液I的清洗盒中，雜交面朝上，放在水平搖床上清洗4min，以洗去沒有與探針特異性結(jié)合的樣品。在洗液I中清洗結(jié)束后，迅速用鑷子將芯片轉(zhuǎn)移到盛放洗液II的清洗盒中，雜交面朝上，放在水平搖床上清洗4min。芯片清洗后，放在50ml錐形離心管中(標(biāo)簽紙端朝下)，1500rpm離心l分鐘，除去玻片表面的液體，此時的芯片可以進(jìn)行掃描。6.芯片的掃描芯片掃描采用晶芯⑧LuxScanTMIOK掃描儀。實(shí)施例3:芯片檢測特異性驗(yàn)證一.甲肝病毒陽性樣品體方法參見實(shí)施例2。2.反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系及條件同表3:HAV-R(5mM)序列為CCCAATCGAATCTGAAGCATSEQIDNo.143.PCR擴(kuò)增以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系同表4，條件如表5:HAV-F(未標(biāo)記5uM)序列為TGTGCTATGGTTCCTGGTGASEQIDNo.15HAV-R(熒光標(biāo)記40uM)序列為CCCAATCGAATCTGAAGCATSEQIDNo.144.瓊脂糖凝膠電泳，檢測有明顯條帶，即證明有擴(kuò)增；5.雜交反應(yīng)，參見實(shí)施例2。6.芯片清洗，參見實(shí)施例2。7.芯片掃描結(jié)果見圖3—1和3—2，甲肝疫苗實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相吻合。二.星狀病毒糞便標(biāo)本1.提取病毒總RNA，具體方法參見實(shí)施例2。2.反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系及條件同表3:HAsV-R(5mM)序列為ACATGTGCTGCTGTTACTATSEQIDNo.163.PCR擴(kuò)增以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系同表4，條件如表5:HAsV-F(未標(biāo)記5uM)序列為CATTGTTTGTTGTCATACTAACSEQIDNo.17HAsV-R(熒光標(biāo)記40uM)序列為ACATGTGCTGCTGTTACTATSEQIDNo.164.瓊脂糖凝膠電泳，檢測有明顯條帶，即證明有擴(kuò)增；5.雜交反應(yīng)，參見實(shí)施例2。6.芯片清洗，參見實(shí)施例2。7.芯片掃描結(jié)果見圖4一1和4一2，星狀病毒標(biāo)本實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相吻合。三.諾瓦克病毒糞便標(biāo)本1.提取病毒總RNA，具體方法參見實(shí)施例2。2.反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系及條件同表3:GI-SKR(未標(biāo)記5uM)序列為CCAACCCARCCATTRTACASEQIDNo.18GII-SKR(未標(biāo)記5uM)序列為CCRCCNGCATRHCCRTTRTACATSEQIDNo.193.PCR擴(kuò)增以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系同表4，條件如表5:GI-SKF(未標(biāo)記5uM)序列為CTGCCCGAATTYGTAAATGASEQIDNo.20GI-SKR(熒光標(biāo)記40uM)序列為CCAACCCARCCATTRTACASEQIDNo.18COG2F(未標(biāo)記5uM)序列為CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAGSEQIDNo.21GII-SKR(熒光標(biāo)記40uM)序列為CCRCCNGCATRHCCRTTRTACATSEQIDNo.194.瓊脂糖凝膠電泳，檢測有明顯條帶，即證明有擴(kuò)增；5.雜交反應(yīng)，參見實(shí)施例2。6.芯片清洗，參見實(shí)施例2。7.芯片掃描結(jié)果見圖5—1和5—2，諾瓦克病毒標(biāo)本實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相吻合。四.輪狀病毒糞便標(biāo)本1.提取病毒總RNA，具體方法參見實(shí)施例2。2.反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系及條件同表3:RotavirusA—Primer—R(5mM)序歹U為GATCCTGTTGGCCATCCSEQIDNo.223.PCR擴(kuò)增以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系同表4，條件如表5:RotavirusA一Primer—R(未標(biāo)記5uM)序列為GATCCTGTTGGCCATCCSEQIDNo.22RotavirusA一Primer—F(熒光豐示記40uM)序歹lj為GCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGGSEQIDNo.234.瓊脂糖凝膠電泳，檢測有明顯條帶，即證明有擴(kuò)增；5.雜交反應(yīng)，參見實(shí)施例2。6.芯片清洗，參見實(shí)施例2。7.芯片掃描結(jié)果見圖6—1和6—2，輪狀病毒標(biāo)本實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相吻合。五.脊灰病毒疫苗1.提取病毒總RNA，具體方法參見實(shí)施例2。2.反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系及條件同表3:Poliovirus—Primer1—R(5mM)序列為GAATTCCATGTCAAATCTAGASEQIDNo.243.PCR擴(kuò)增以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系同表4，條件如表5:Poliovirus—Primerl—R(未標(biāo)記5uM)序列為GAATTCCATGTCAAATCTAGASEQIDNo.24Poliovirus—Primer1_F(熒光標(biāo)記40uM)序列為TTTGTGTCAGCGTGTAATGASEQIDNo.254.瓊脂糖凝膠電泳，檢測有明顯條帶，即證明有擴(kuò)增；5.雜交反應(yīng)，參見實(shí)施例2。6.芯片清洗，參見實(shí)施例2。7.芯片掃描結(jié)果見圖7—1和7—2，脊灰病毒標(biāo)本實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相吻合。實(shí)施例4:芯片檢測靈敏度試驗(yàn)為了檢測芯片檢測方法的靈敏度，我們用輪狀病毒的CDNA為實(shí)驗(yàn)對象，將輪狀病毒的cDNA進(jìn)行梯度稀釋，以稀釋后的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測、芯片檢測以及熒光定量PCR檢測，比較三種檢測方法的靈敏度。1.電泳檢測輪狀病毒將以輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)基因組RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行IOM咅、102倍、103倍的稀釋，以稀釋后的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，同時和原cDNA的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較。電泳結(jié)果如圖8所示。從電泳檢測結(jié)果可以看出，當(dāng)以輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)基因組RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行102倍稀釋后的RT-PCR基本無擴(kuò)增產(chǎn)物。2.芯片檢測輪狀病毒將RT-PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測，結(jié)果如圖9一1至9—5所示?？梢钥闯?，當(dāng)把cDNA進(jìn)行10M咅稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物雜交為陽性，而當(dāng)把cDNA進(jìn)行l(wèi)(^倍稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物雜交則無雜交信號。3.總結(jié)通過以上兩種病毒PCR產(chǎn)物的不同檢測方法表明，芯片檢測的靈敏度基本和凝膠電泳檢測相同或略高于凝膠電泳檢測。實(shí)施例5:芯片的穩(wěn)定性試驗(yàn)為了考察芯片在探針點(diǎn)制完成后正常保存條件(4'C)下的保存期限，我們制備了一批芯片，將其放在37'C溫箱中加速保存(此條件下保存3天相當(dāng)于在4'C條件下保存6個月)。同時，制備出足夠數(shù)量的甲肝病毒RT-PCR產(chǎn)物，分不同時間進(jìn)行雜交檢測，結(jié)果如圖10—1至圖10—4所示。保存實(shí)驗(yàn)雜交結(jié)果表明，在正常保存條件下，芯片的穩(wěn)定性很好，其保質(zhì)期大于l年。實(shí)施例6:—種食源性病毒高通量檢測試劑盒針對食品中的致病性病毒開發(fā)出了一種高通量檢測試劑盒，可同時檢測樣品中含有的甲肝病毒、星狀病毒、諾瓦克病毒、輪狀病毒和脊灰病毒。該產(chǎn)品將生物芯片技術(shù)、全基因組測序技術(shù)、生物信息學(xué)、核酸提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)有機(jī)結(jié)合在一起，具有檢測通量大、靈敏度高、檢測時間短等特點(diǎn)。1.試劑盒組成和保存條件表7:試劑盒組成和保存條件<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注DNA分子量Marker:每次PCR產(chǎn)物電泳檢測時，取4(il加入一單獨(dú)的凝膠孔中，作為判讀PCR產(chǎn)物擴(kuò)增條帶大小的標(biāo)準(zhǔn)，此Marker的標(biāo)準(zhǔn)電泳條帶為(從上至下):2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。表8:PCRMix<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表9:反轉(zhuǎn)錄Buffer<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>2.使用方法-(1)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈注檢測不同的目標(biāo)病毒時，使用不同的反轉(zhuǎn)錄Mix，具體如表10:表10:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(2)PCR擴(kuò)增病毒檢測基因注檢測不同的目標(biāo)病毒時，使用不同的PCRMix，具體如表ll:表ll:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注PCR反應(yīng)體系中cDNA的量視不同檢測樣品的污染程度而異，具體應(yīng)用時需根據(jù)具體情況確定最佳的需要量，通常10-100ng的cDNA均可很好的擴(kuò)增。(3)擴(kuò)增結(jié)果檢測配制1.5%的瓊脂糖凝膠，每80ml凝膠中加入2HlGV電泳染色液，凝固備用；反應(yīng)結(jié)束后取3plPCR產(chǎn)物加入3nl2XPCR載樣液，電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果；*甲肝病毒的陽性擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)至少具有一條約510bp的擴(kuò)增條帶；*星狀病毒的陽性擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)至少具有一條約286bp的擴(kuò)增條帶；*諾瓦克病毒的陽性擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)至少具有一條約387bp的擴(kuò)增條帶；*輪狀病毒的陽性擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)至少具有一條約392bp的擴(kuò)增條帶；*脊灰病毒的陽性擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)至少具有一條約480bp的擴(kuò)增條帶；對具有陽性擴(kuò)增的樣品進(jìn)行芯片雜交檢測，無陽性擴(kuò)增的樣品暫不進(jìn)行芯片雜交，建議重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或重新合成cDNA第一鏈后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；雜交及結(jié)果判讀。(4)雜交及洗片將雜交液在42'C溶化，取雜交液7pl，加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5|al，于95'C變性5分鐘，冰浴5分鐘備用。將雜交盒平放在桌面上，在雜交盒的兩邊凹槽內(nèi)加入約80pl滅菌水，將芯片放入雜交盒內(nèi)，芯片標(biāo)簽正面朝上；揭掉芯片蓋片的塑料薄膜，放在芯片的黑色圍欄上，注意有凸塊的一面對著芯片；然后從蓋玻片的小孔緩慢注入12W變性后的雜交液后，雜交液會憑借液體表面張力在蓋玻片下面的凸面和芯片之間形成一道液膜。注意不要震動蓋玻片或芯片以避免破壞液膜。蓋緊雜交盒蓋。放入42'C恒溫水浴中，靜置，雜交2小時。雜交后，取出芯片放在預(yù)先42。C預(yù)熱好的洗液I(2XSSC，0.2%SDS)中，42。C震蕩清洗4分鐘，再用42r預(yù)熱好的洗液I1(0.2XSSC)，42r震蕩清洗4分鐘，最后用42。C預(yù)熱好清水清洗一次，清洗后的芯片1500rpm離心1分鐘以去除芯片表面的液體，此芯片可避光保存，在l小時內(nèi)進(jìn)行掃描。(5)芯片掃描及結(jié)果判讀洗凈的芯片使用晶芯⑧LuxScan10K微陣列芯片掃描儀在晶芯^食源性病毒檢測系統(tǒng)下進(jìn)行掃描分析，該系統(tǒng)軟件會自動對掃描結(jié)果進(jìn)行判讀分析，給出檢測結(jié)果，用戶可對結(jié)果進(jìn)行存儲、打印和査詢。序列表<110>中華人民共和國北京出入境檢驗(yàn)檢疫局博奧生物有限公司<120>—種檢測食源性病毒的基因芯片及試劑盒<130><160>25<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>1cattggaacaggaacttcagcg22<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2gagatccgtgatgttaatgg20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3gagatccgtgatgctaatgg<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4gagatacgtgatgctaatgg<210>5<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>5gtaaatgatgatggcgtctaa<210>6<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>6agggcgatcgcaatctggct<210>7<211>21<212>DNA說明書第18/24頁202021gtggtatattcaataccatac<210>8<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>8ccgcgcgaagaaagactct<210>9<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>9agtaatcccttcaacggcc<210>10<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>10ctgctggcgcgctttgt<210>11說明書第19/24頁<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>11gttgcttcgggagtgacaaag21<210>12<211>50<212>DNA<213>人工合成<400>12gtcacatgcgatggatcgagctcctttatcatcgttcccaccttaatgca50<210>13<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>13ctcatgcccatgccgatgc19<210>14<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>14cccaatcgaatctgaagcat20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>15tgtgctatggttcctggtga<210>16<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>16acatgtgctgctgttactat<210>17<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>17cattgtttgttgtcatactaac<210>18<211>19<212>DNA<213>人工合成說明書第21/24頁202022<400>18ccaacccarccattrtaca<210>19<211>23<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc一feature<222>(6)..(6)<223>nisa，c，g,ort<400>19ccrccngcatrhccrttrtacat<210>20<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>20ctgcccgaattygtaaatga<210>21<211>26<212>DNA<213>人工合成<220><221>miscfeature<222>(9)..(9)<223>nisa,c,g，ort<400>cargarbcnatgttyagrtggatgag<210>22<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>22gatcctgttggccatcc17<210>23<211>28<212>DNA<213>人工合成<400>23ggctttaaaagagagaatttccgtctgg28<210>24<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>24gaattccatgtcaaatctaga21<210>25<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>25tttgtgtcagcgtgtaatga20權(quán)利要求1.一種檢測食源性病毒的基因芯片，在固相載體表面固定有若干檢測探針和質(zhì)控對照探針，其特征在于檢測探針由檢測甲肝病毒、星狀病毒、諾瓦克病毒G1型、諾瓦克病毒G2型、輪狀病毒、脊灰病毒1型、脊灰病毒2型和脊灰病毒3型的探針組成；質(zhì)控對照由點(diǎn)樣陽性質(zhì)控探針、芯片雜交陽性質(zhì)控探針和芯片陰性質(zhì)控探針組成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述檢測探針具有序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.11所示的核苷酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述點(diǎn)樣陽性質(zhì)控探針具有序列表SEQIDNo.12所示的核苷酸序列，5'端進(jìn)行HEX修飾。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述芯片雜交陽性質(zhì)控探針具有序列表SEQIDNo.13所示的核苷酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述芯片陰性質(zhì)控探針為1X點(diǎn)樣液。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)所述的檢測食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述固相載體選自尼龍膜、纖維素膜、玻片、金屬片、硅片、陶瓷片或有機(jī)高分子制作的薄膜。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述固相載體表面進(jìn)行了醛基修飾。8.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)所述的檢測食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述探針點(diǎn)樣濃度為20uM，每條探針橫向重復(fù)5點(diǎn)，點(diǎn)直徑約150nm，點(diǎn)間距300pm。9.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)所述的檢測食源性病毒的基因芯片，其特征在于所述芯片每張具有4個相同矩陣，探針排布方式為每個矩陣9行10列。10.—種檢測食源性病毒的基因芯片試劑盒，由以下組分組成(1)轉(zhuǎn)錄1-6:64|al，-20°<:保存；(2)反轉(zhuǎn)錄Buffer:130)il，-20°<:保存;(3)RNA酶抑制劑18|al，-20!]保存；(4)反轉(zhuǎn)錄酶18nl，-20匸保存；(5)PCRMixl-6:110pl，.20。C避光保存；(6)Taq:5U/pl，5|il，-20"保存；(7)2xPCR載樣液50pl，2-8。C保存；(8)DNAMarker:20pl，2-8。C保存；(9)雜交液150ial，2-8'C避光保存；(10)20xSSC:100ml，室溫保存；(11)10%SDS:20ml，室溫保存；(12)檢測芯片4片，2-8。C保存；(13)芯片蓋片4片，2-8。C保存；(14)GV電泳染色液lO(il，2-8。C保存；(15)去核酸酶滅菌水1.5ml，-20匸保存。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測食源性病毒的基因芯片及試劑盒，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。本發(fā)明在固相載體表面固定有若干檢測探針和質(zhì)控對照探針，檢測探針由檢測甲肝病毒、星狀病毒、諾瓦克病毒G1型、諾瓦克病毒G2型、輪狀病毒、脊灰病毒1型、脊灰病毒2型和脊灰病毒3型的探針組成；質(zhì)控對照由點(diǎn)樣陽性質(zhì)控探針、芯片雜交陽性質(zhì)控探針和芯片陰性質(zhì)控探針組成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)高通量整合了5種常見病毒，同時檢測，實(shí)用性強(qiáng)；(2)快速檢測時間僅為4小時；(3)特異避免了交叉反應(yīng)導(dǎo)致的假陽性；(4)靈敏芯片的檢測靈敏度為10⁸病毒顆粒/g組織樣品，比RT-PCR靈敏度高；(5)重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定，可廣泛應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)的食品安全監(jiān)察。文檔編號C12Q1/70GK101328505SQ200710119048公開日2008年12月24日申請日期2007年6月19日優(yōu)先權(quán)日2007年6月19日發(fā)明者付溥博,亮張,捷張,昕張,張惠媛,靜曾,琦汪,紅繞,臧慶偉,陳廣全,魏海燕申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗(yàn)檢疫局;博奧生物有限公司