專利名稱：具有△⁶脂肪酸脫氫酶功能的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物編碼基因及其應(yīng)用。具體地，涉及兩個(gè)具有完整閱讀 框架的基因i "D6C和i "Z)dD,其分別來(lái)源于黑茶薦子(&'6" "/gram L.)白勺 兩段DNA序列，以及以此為基礎(chǔ)克隆的兩個(gè)具有完整閱讀框架的基因序 列。本發(fā)明還涉及該基因所編碼具有^6脂肪酸脫氫酶功能的多肽，以及 含有該DNA序列的低等真核細(xì)胞表達(dá)載體和植物表達(dá)載體、宿主細(xì)胞以 及利用該基因分別轉(zhuǎn)化低等真核生物和植物生產(chǎn)GLA和SDA的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty adds, PUFAs)是指含有兩個(gè) 或兩個(gè)以上雙鍵且碳鏈長(zhǎng)為18 22個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸，主要包括亞 油酸(linoleicacid， LA， 18:2A9,12)、 Y -亞麻酸(y-linolenic acid， GLA， 18:3， △6'9'12)、花生四烯酸(Arachidonic Acid， AA， 20:4A5，8，11，14)、 二十碳五烯 酸(Eicosapentaenoic Acid ， EPA ， 20:5A5'8'1U4'17) 、 二十二碳六烯酸 (DecosahexaenoicAcid， DHA， 20:5A4'7'1()'13'16'19)等。其中，亞油酸及亞 麻酸被公認(rèn)為人體必需脂肪酸(Essential fatty acids， EFA)，可進(jìn)一步衍化 成具有不同功能的高度不飽和脂肪酸，如AA、 EPA、 DHA等。
PUFAs具有非常重要的生理功能。第一，PUFAs在心血管運(yùn)動(dòng)、大腦、 視網(wǎng)膜和神經(jīng)組織發(fā)育等生理功能中發(fā)揮重要作用。第二， DHA和EPA 具有較好的抗癌作用，如可以預(yù)防(尤其是絕經(jīng)后婦女)乳腺癌的發(fā)生。 第三，花生四烯酸、EPA和DHA等多不飽和脂肪酸在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了 重要的作用。第四，多不飽和脂肪酸還能具有防止皮膚老化、延緩衰老、 促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)等作用。
在脂肪酸代謝過(guò)程中，Al旨肪酸脫氫酶(A6-fatty acid desaturase， D6D)分別催化底物亞油酸(LA)和a-亞麻酸(ALA)的第6位碳原子脫氫形成y-亞麻酸(GLA) [l]和十八碳四烯酸(Stearidonicacid， SDA， 18:4A6,9,12，15)。
Y-亞麻酸又可通過(guò)碳鏈延長(zhǎng)和脫氫作用進(jìn)一步形成AA、前列腺素和 白三烯類生理活性物質(zhì)，這些產(chǎn)物在人的大腦發(fā)育、視覺(jué)、過(guò)敏反應(yīng)及心 血管運(yùn)動(dòng)等一系列生理功能中產(chǎn)生重要影響。作為人體的一種必需的不飽
和脂肪酸，Y-亞麻酸具有降血脂、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、減肥、抑制潰瘍、增強(qiáng) 胰島素、抗血栓性心血管疾病等一系列生物學(xué)功能[1，2]，目前國(guó)際上已作 為一種新的維生素一維生素F被研究利用[3]。 SDA是EPA和DHA的代 謝前體，在人體內(nèi)很容易轉(zhuǎn)化為EPA和DHA，利用效率是ALA的4倍， 可以有效緩解與EPA和DHA缺乏有關(guān)的生理疾病。當(dāng)然通過(guò)直接補(bǔ)充 EPA或DHA也可以獲得同樣效果。
然而，PUFAs的現(xiàn)行商業(yè)來(lái)源主要是特定的種子植物、海洋魚類和 一些動(dòng)物組織。除了 LA以外，現(xiàn)有的來(lái)源在總產(chǎn)量和質(zhì)量?jī)蓚€(gè)方面都不 能滿足日益增長(zhǎng)的PUFAs的市場(chǎng)需求。這主要是基于下面的一些原因
(1) PUFAs的植物資源受到季節(jié)和地域限制，PUFAs產(chǎn)量和質(zhì)量 的不穩(wěn)定；而且植物資源大都產(chǎn)量低、不適合大面積種植。例如含有Y -亞麻酸的月見(jiàn)草、琉璃苣和黑茶薦子等植物產(chǎn)量?jī)H300 600 kg/ha，遠(yuǎn)遠(yuǎn) 低于常規(guī)油料作物如油菜的3t/ha的產(chǎn)量[4]。
(2)有限的天然海洋漁業(yè)資源由于過(guò)度捕撈造成漁業(yè)資源缺乏，而 且魚油固有的魚腥味和氧化不穩(wěn)定性，限制了 PUFAs的進(jìn)一步利用；
(3)由于需對(duì)低品質(zhì)的油進(jìn)行提煉，大大增加了 PUFAs的生產(chǎn)成本。 由此造成了純品PUFAs的高昂市場(chǎng)價(jià)格，阻礙了其許多潛在的用途。
鑒于PUFAs的供應(yīng)量很快將不能滿足其需求量及其應(yīng)用于生物藥品 所需純品PUFAs供應(yīng)量的不足，因此有必要尋求商業(yè)化生產(chǎn)的可替代性 來(lái)源。
所以，作為GLA和SDA生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶一Al旨肪酸脫氫酶己被越 來(lái)越多的研究和利用。迄今為止，AS脂肪酸脫氫酶基因已從動(dòng)物[5]、植 物[4]、真菌[6]和線蟲[7]等不同生物中克隆獲得，并在釀酒酵母[7,8]、番 茄[9]、煙草[4,〗0]、油菜[6,8]和大豆[11]中成功獲得了表達(dá)。
在植物中，GLA和SDA僅存在于月見(jiàn)草(Oe"o溈era ^ .)、琉璃苣
(5orago 丄.)、黑茶薦子等少數(shù)幾種植物中[12]，而這些植物的
種子油生產(chǎn)亦成為目前世界上GLA和SDA的主要商業(yè)來(lái)源。利用產(chǎn)油真 菌發(fā)酵也可提取獲得GLA和SDA。但通過(guò)現(xiàn)有的這些生產(chǎn)方式獲得的 GLA和SDA產(chǎn)量都很低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求[13]。因此， 利用釀酒酵母或轉(zhuǎn)基因油料作物植株表達(dá)外源A6脂肪酸脫氫酶來(lái)生產(chǎn) GLA和SDA具有重要的研究意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此外，雖然琉璃苣[5]具有 △6脂肪酸脫氫酶基因在國(guó)外己有研究報(bào)道，但本申請(qǐng)的兩個(gè)基因是來(lái)源 于黑茶薦子的Al旨肪酸脫氫酶基因，迄今在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了兩個(gè)基因W"D6C、 i^D6D，其核苷酸酸序列分別如SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2所示，這兩個(gè)基因分別來(lái)源于黑茶藤子(i A^ m'grwm L.)的DNA片段，所編碼的多肽分別如SEQ ID NO:3， SEQ ID NO:4所示。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含基因i wZMC、 i^D6Z)的低等真核細(xì)胞 表達(dá)載體如酵母表達(dá)載體，以及利用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。在轉(zhuǎn)化 的酵母細(xì)胞中所表達(dá)的多肽具有A6脂肪酸脫氫酶功能，可以分別催化外 加底物亞油酸和a-亞麻酸分別生成Y —亞麻酸(GLA)和十八碳四烯酸 (SDA)。
由于這類基因所編碼的是一個(gè)蛋白，可采用釀酒酵母表達(dá)體系來(lái)進(jìn)行 體外表達(dá)，但由于該蛋白為膜蛋白，在體外表達(dá)體系中即使表達(dá)出來(lái)，亦 較難分離純化。故一般采用考察所表達(dá)的蛋白對(duì)外加底物的催化活性的方 法來(lái)進(jìn)行功能鑒定。
在所采用的釀酒酵母表達(dá)體系中，受體菌是尿嘧啶缺陷型INV & I， 本身不含LA (亞油酸)、ALA (a-亞麻酸)、GLA (y-亞麻酸)禾H SDA， 因此，在添加底物亞油酸的條件下，如若在酵母工程菌中檢測(cè)到催化產(chǎn)物 GLA或SDA，就可以確定外源基因所編碼蛋白在釀酒酵母表達(dá)體系中獲 得了表達(dá)，對(duì)外加底物產(chǎn)生了催化作用。所以釀酒酵母已經(jīng)作為研究外源 的A6、 Al2-脂肪酸脫氫酶基因功能性鑒定的最常用、最有效的表達(dá)體系， 且己有許多成功的研究報(bào)道[4， 6， 7]。脂肪酸的檢測(cè)主要采用GC — MS(氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù))來(lái)完成。其原理是通過(guò)GC (氣相色譜)將 不同的脂肪酸組分分離，然后通過(guò)MS (質(zhì)譜)檢測(cè)器分別對(duì)每種組分進(jìn) 行質(zhì)譜定性分析，從而確定每一種組分的成分及含量的比較成熟的聯(lián)用分 析技術(shù)。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種含基因7 D6C、 T^D6D的植物表達(dá) 載體?？墒褂萌魏我环N可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的表達(dá)載體。這些 植物表達(dá)載體包括但不限于，雙元農(nóng)桿菌載體，例如pBIN19、 pBI121、 pB221， pCambia 1300， pGreen等的植物表達(dá)載體。
本發(fā)明的載體也可含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子。在本發(fā)明中可使用任何一種強(qiáng) 啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV35S)、 Ubiqutin、 Actin啟動(dòng)子。它可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。
本發(fā)明的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體，直 接的DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等方式導(dǎo)入植物細(xì)胞。
可使用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的低等真核宿主選自由酵母、藻類等低等真 核生物組成的組。
可使用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的植物宿主包括煙草、油菜、向日葵、大豆、 番茄、蓖麻、芝麻和花生等植物。
本發(fā)明還涉及基因i "D6C、 A/7D(5D在生產(chǎn)GLA和SDA中的應(yīng)用。


圖1. i "D6C片段核苷酸序列，SEQIDN0:1。 圖2. /67D6Z)片段核苷酸序列，SEQIDNO:2。
圖3.基因i^D6C所編碼的多肽序列，SEQIDNO:3，其中劃線部分
分別為Cytb5功能域和三個(gè)His Box功能域。 圖4.基因i MD6D所編碼的多肽序列，SEQIDNO:4，其中劃線部分
分別為Cytb5功能域和三個(gè)His Box功能域。 圖5.基因AmD6C和i^D6D的酵母表達(dá)載體圖。 圖6.基因/^D6C和/ "Z)6D的植物表達(dá)載體圖。a)以潮霉素(Hyg)
作為篩選標(biāo)記的/ "D6C/D的植物表達(dá)載體圖；b)去除篩選標(biāo)
記的i^A5C/D的植物表達(dá)載體圖。
圖7.基因/^D6C和在釀酒酵母表達(dá)中表達(dá)的總脂肪酸 GC-MS分析
a) INV&I酵母菌株脂肪酸組成的GC-MS;
b) INV&I酵母菌株脂肪酸組成和加有LA(亞油酸)、GLA(， 亞麻酸)標(biāo)準(zhǔn)樣品的GC-MS;
c) 含空載pYES2表達(dá)質(zhì)粒酵母的總脂肪酸GC-MS;
d) 含空載pYES2表達(dá)質(zhì)粒酵母在添加LA底物誘導(dǎo)后的總脂肪 酸GC-MS;
e) 表達(dá)i "Z)(5C基因的酵母在添加LA底物誘導(dǎo)后的總脂肪酸 GC-MS，紅色箭頭所指為產(chǎn)物峰；
f) 表達(dá)A"Z)6Z)基因的酵母在添加LA底物誘導(dǎo)后的總脂肪酸 GC-MS，紅色箭頭所指為產(chǎn)物峰；
g) 含空載pYES2表達(dá)質(zhì)粒酵母在添加ALA底物誘導(dǎo)后的總脂 肪酸GC-MS;
h) 表達(dá)/^D(5C基因的酵母在添加ALA底物誘導(dǎo)后的總脂肪酸 GC-MS，紅色箭頭所指為產(chǎn)物峰；
i) 表達(dá)i "D6D基因的酵母在添加ALA底物誘導(dǎo)后的總脂肪酸 GC-MS，紅色箭頭所指為產(chǎn)物峰；
j)由napin啟動(dòng)子啟動(dòng)i "D(5Z)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因油菜H165種
子的總脂肪酸GC-MS，紅色箭頭所指為產(chǎn)物峰； k)對(duì)照一未轉(zhuǎn)化的油菜H165種子的總脂肪酸GC-MS。 圖8.釀酒酵母中/ "A5C、 i^D6D基因表達(dá)催化產(chǎn)物GC-MS分析中 MS圖譜，a: i^2D6C、 7 mZ)6D的酵母表達(dá)催化產(chǎn)物GLA的MS圖；b: y_ 亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)品的MS圖。
具體實(shí)施例方式
下面參考實(shí)施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以 理解的是，下述實(shí)施例是舉例說(shuō)明的目的，其不應(yīng)以任何方式解釋為對(duì)本 發(fā)明的限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍由后附的權(quán)利要求所限定。
實(shí)施例一、J wD6C、及"Z)6Z)基因的獲得
1. 黑茶薦子基因組DNA的制備
以北京植物園中種植的黑茶薦子(化6" m'gr臓L.)活體植株為材料，取 其幼嫩葉片(約100mg)，于7mlEp管中加入鋼珠(直徑5mm)，置于 液氮中冷凍20-30 min，于漩渦器上高速破碎，反復(fù)操作2-3次，至材料完 全破碎。加入1-2 ml預(yù)熱的CTAB抽提液(參見(jiàn)"精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指 南"2001，科學(xué)出版社，顏?zhàn)臃f，王海林譯)，混勻。65。C水浴30 min。 加入等體積氯仿，輕柔抽提約5 min。于12 000 rpm室溫離心10 min。取 上清，加入1/2體積異丙醇混勻，室溫放置10 min沉淀DNA。用Tip頭 將沉淀出的DNA挑出，用70%乙醇中洗滌兩次，于70%乙醇中室溫放置 30min。除去70%乙醇，空氣中吹干。溶于適量滅菌ddH20， -20"保存。
2. / "D6C、 i^D6Z)DNA片段的克隆
設(shè)計(jì)引物分別從前面所提取的DNA中克隆i^Z)6C、 i "Z)6D的 DNA片段。所用反應(yīng)體系如下 PCR反應(yīng)體系(50^1):
PCR產(chǎn)物電泳(1%瓊脂糖凝膠濃度)后切膠回收目的片段 (/ D6C、 W"D6D，約1.3 kb)，連入pGEM-T載體(購(gòu)自Promega
公司)，測(cè)序驗(yàn)證。
DNA模板1 nl (50 ng)
pfu: 0. 5 pl
10X buffer: 5 )al
正向引物2.5 pi
反向引物2.5 pi
dNTP: 2 pi
H20: 36.5 pi
PCR程序:預(yù)變性95。CX 4 min，變性94'CX 30 s, 退火50。CX 40 s，延伸72。CX 1 min 30s、 25個(gè)循 環(huán)，延伸72°CX 10 min。
所用引物分別如下
1) . i "D6CDNA片段的克隆所用引物 正向引物
I
5'-CGCGGGTACCATGGCTAATGCAATCAAG-3' (SEQ ID NO:5 )
反向引物 I
5'- CGCCGAGCTCTCAGCCATAGGTGTTGAC -3' (SEQ ID NO:6)
2) . i "Z^DDNA片段的克隆所用引物
正向引物 ^cw I
5，-CGCGGGTACCATGGGTGAAAATGGAAGG-3， ( SEQ ID NO:7)
反向引物 I
5，-CGCCGAGCTCTCAACCATAGGTGTTGAC-3， (SEQ ID NO:8)
實(shí)施例二、 / "P6C、及"i)6Z)基因酵母載體的構(gòu)建
從含有基因/^D6C和A"D(5Z)的pGEM-T載體中，利用AT; "I、 &c I 酶切位點(diǎn)，雙切后獲得i "D6C和W"Z)6D基因，定向克隆于酵母表達(dá)載體 pYES2 (購(gòu)自Ivitrogen公司)，獲得酵母表達(dá)質(zhì)粒pYRnD6C和pYRnD6D， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5a (由本實(shí)驗(yàn)室保存)保存。其載體圖見(jiàn)圖5。
實(shí)施例三、i wZMC、及rtZ)6Z)基因在酵母中的表達(dá)
1. 酵母的轉(zhuǎn)化
參照Invitrogen公司pYES2Kit(Cat# V285-20)所述方法，將上述嵌 合基因的酵母表達(dá)質(zhì)粒pYRnD6C和pYRnD6D，采用醋酸鋰介導(dǎo)轉(zhuǎn)化釀 酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株INVSc I (購(gòu)于Invitrogen公司)，以空載pYES2 質(zhì)粒為對(duì)照，獲得含有各表達(dá)質(zhì)粒的酵母細(xì)胞。
2. 轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的誘導(dǎo)表達(dá)
取含目的基因酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母單菌落，接種于50 ml SC-U培 養(yǎng)液(參照Invitrogen公司pYES2 Kit所述配方)含2%綿子糖的SC-U培 養(yǎng)液中，250rpm， 28°C，培養(yǎng)過(guò)夜；加入NP-40 (購(gòu)自BBI公司)(終濃
度1%)、外源亞油酸和a-亞麻酸底物(購(gòu)自Sigma公司)(終濃度為
0. 003.)，以及酵母表達(dá)誘導(dǎo)物D-半乳糖(購(gòu)自Amresco公司)(終濃度 為2%) 250rpm， 22。C培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)表達(dá)。
實(shí)施例四、及"D6C、 i ""6Z)基因酵母表達(dá)物對(duì)Al旨肪酸脫氫酶底物催化 產(chǎn)物的GC-MS分析
1. 脂肪酸的提取與甲酯化。
離心收集取誘導(dǎo)后的酵母菌體，去離子水洗滌，5(TC烘干。取40mg 酵母粉(在實(shí)例3.2中所誘導(dǎo)獲得的酵母經(jīng)5(TC烘干即得)充分研磨，加. 入5 ml 5% KOH-CH3OH， 70。C水浴5 h后加入HC1酸化至其pH值達(dá)2.0。 再加入4ml 14%BF3-CH3OH (購(gòu)自A'ldtich公司)溶液，70。C水浴1.5h。 加入2ml0.9。/。NaCl溶液，混勻后靜止片刻。加入2ml氯仿正己烷(V/V l:4灘提，吸取抽提液，N2吹干。最后溶于100(il乙酸乙 酯。
2. 終產(chǎn)物GC-MS檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)。
所用GC-/MS儀為TurboMass (PerkinElmer公司)，柱子BPX-70， 30 m x0.25 mmx0.25 vm，柱溫120°C ，氣化室溫度230°C 。取1 pl終產(chǎn)物
上樣，分流比10: 1。
3. GC-MS結(jié)果分析。
對(duì)比圖7-la、 7-lb和7-lc，表明在不添加亞油酸底物條件下，所用 酵母工程植株以及含經(jīng)誘導(dǎo)的空載pYES2表達(dá)質(zhì)粒酵母中沒(méi)有新的產(chǎn)物 峰出現(xiàn)，說(shuō)明所用酵母工程菌株及空載pYES2表達(dá)質(zhì)粒酵母的總脂肪酸 中不含外加底物亞油酸(LA)、 a-亞麻酸(ALA)和催化產(chǎn)物y-亞麻酸 (GLA)、十八碳四烯酸(SDA)。
當(dāng)添加亞油酸底物，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，對(duì)照(空載pYES2)亦沒(méi) 有產(chǎn)物峰，亞麻酸(GLA)的出現(xiàn)(參見(jiàn)圖7-ld)。而pYRnD6C/D的酵 母表達(dá)菌被誘導(dǎo)后，外加底物亞油酸(LA)可以被催化生成，亞麻酸(GLA) (參見(jiàn)圖7-le和7-lf)。
對(duì)比圖7-ld、 7-le禾P7-lf，可以發(fā)現(xiàn)在保留時(shí)間為7.25min左右時(shí)，
有一個(gè)新的物質(zhì)生成。其出峰時(shí)間和質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品Y-亞麻酸(購(gòu)自Sigma 公司)的峰圖及質(zhì)譜圖一致(參見(jiàn)圖8a和圖b)，確定為Y-亞麻酸。
當(dāng)添加a-亞麻酸底物，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，對(duì)照(空載pYES2)亦 沒(méi)有產(chǎn)物峰SDA的出現(xiàn)(參見(jiàn)圖7-2g)。而pYRnD6C/D的酵母表達(dá)菌被 誘導(dǎo)后，外加底物oc-亞麻酸可以被催化生成SDA (參見(jiàn)圖7-2h和7-2i)。
對(duì)比圖7-2g、 7-2h禾Q7-2i，可以發(fā)現(xiàn)在保留時(shí)間為7.75 min左右時(shí)， 有一個(gè)新的物質(zhì)生成。根據(jù)其出峰時(shí)間和質(zhì)譜圖確定為SDA。
以上結(jié)果證明來(lái)源于黑茶薦子的兩個(gè)基因/ "D6C、 A"Z)6Z)在釀酒酵 母中成功表達(dá)，所表達(dá)的蛋白可以分別催化底物亞油酸(LA)和a-亞麻 酸(ALA)生成丫-亞麻酸和SDA。
實(shí)施例五、及""6C、 Z wiMZ)基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建
1. wa; /"啟動(dòng)子napin-T中間載體的構(gòu)建
提取(芥菜型)油菜總DNA，(方法參見(jiàn)實(shí)施例1.1)。 "，/"啟動(dòng)子 片段的克隆所用引物
正向引物Hind III
5'-CGCGAAGCTTACTACAATGTCGGAGAGACAAGG-3' ( SEQ
ID NO:9)
反向引物BamHI
5 '-CGCGGGATCCTTGTGTATGTTCTGTAGTGATGAGTTTTG-3' (SEQIDNO:IO)
用Pyrobest DNA Polymerase PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系參見(jiàn)實(shí)施例1.2)， PCR產(chǎn)物電泳(1%瓊脂糖凝膠濃度)后切膠回收目的片段(約1.S kb)， 連入pGEM-T載體(購(gòu)自Promega公司)，測(cè)序驗(yàn)證。
2. W"D6C、 /^Z)6D基因的RnFD6C/D-T中間載體的構(gòu)建
根據(jù)i^FD6C/D的基因序列，分別設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)為S畫//1和&c I 的上下游特異引物，用Pyrobest DNA Polymerase擴(kuò)增目的片段i "FD6C 和^FD6D，回收目的片段定向克隆到pGEM-T載體上，挑取單菌落，經(jīng) PCR、酶切和測(cè)序驗(yàn)證，得到RnFD6C/D-T中間載體。3. i^D6C、 i^D6D基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建
1) pC1300-napin的構(gòu)建
用///"dill和SamH I分別雙酶切Napin-T和pCambia 1300，并回 收朋p/"啟動(dòng)子片段和pCambia 1300載體片段，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 隨機(jī)挑取單克隆，經(jīng)PCR，酶切驗(yàn)證得到替換35S啟動(dòng)子為"^/"啟動(dòng) 子的pC1300-napin植物表達(dá)載體。
2) pC300-nRnD6C/D植物表達(dá)載體的構(gòu)建
用5amH I和I分別雙酶切RnD6C/D-T和pC1300-napin,并回 收i "D6C/D目的片段和pC1300-napin載體片段，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 隨機(jī)挑取單克隆，經(jīng)PCR，酶切驗(yàn)證得到pC1300-nRnD6C/D的植物表 達(dá)載體。其載體圖見(jiàn)圖6a。
3) 去除潮霉素(Hyg)篩選標(biāo)記的pC1300-nRnD6C/D的構(gòu)建
在構(gòu)建好之后，用屈ol單酶切，然后回收大片斷，連接轉(zhuǎn)化后， 隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR、酶切驗(yàn)證獲得去除潮霉素(Hyg)篩選標(biāo)記 的pC1300-nRnD6C/D植物表達(dá)載體。其載體圖見(jiàn)圖6b。
實(shí)施例六、及w/MC、 / "D6"基因及在植物中的轉(zhuǎn)化
1. 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
挑取農(nóng)桿菌單菌落接種在5 ml YEP液體培養(yǎng)基中，28°C, 200 rpm，振蕩 過(guò)夜培養(yǎng)。將2ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加到含有50mlYEP培養(yǎng)基中，28"C， 220 rpm，振蕩培養(yǎng)至OD綱在0.5-1.0之間。5 000 rpm離心菌液，棄上清，沉淀 懸浮于10ml0.5MNaCl， 4°C, 5 000 rpm離心5 min,棄上清，用lml預(yù)冷的 20 mM CaCl2重懸細(xì)胞。取0.2 ml加入約0.5-l嗎質(zhì)粒DNA,輕輕混勻,液 氮速凍l min， 37"C熱激5 min，加入l ml YEP溶液，28。C振蕩培養(yǎng)2-4 h。 5 OOOrpm離心菌液，棄上清，將細(xì)胞重懸于0.2mlYEP培養(yǎng)基中，均勻涂布 在含Kan的YEP平板上，28。C培養(yǎng)48h。隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn) 證。
2. "or^-力》法轉(zhuǎn)化油菜(H165)
選擇初花期的甘藍(lán)型油菜植株處理，前l(fā) d田間澆透水。去除主花序 和每個(gè)分枝花序的頂端花蕾，同時(shí)除去已開(kāi)放的花朵，只保留快要開(kāi)放的 花蕾用于轉(zhuǎn)化。
用10 ml新鮮的YEP+kan的培養(yǎng)基28i:過(guò)夜培養(yǎng)含有目標(biāo)基因植物表 達(dá)載體的農(nóng)桿菌至次日10: 00，再取5ml轉(zhuǎn)入100ml新鮮的YEP+kan的培 養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)22h。 2 500 rpm離心農(nóng)桿菌菌液，棄上清后，用100ml轉(zhuǎn) 化Bufer(MS基本培養(yǎng)基+蔗糖5X+Silwet-77， pH5. 8)重懸至OD6?！?.0后 浸漬油菜花序。10 d內(nèi)間隔l d連續(xù)處理5次。浸漬完后套上紙袋。浸漬處 理24 h后除去紙袋直至收獲種子。
實(shí)施例七、Tl代種子的篩選
對(duì)浸漬處理后獲得的油菜T1代種子經(jīng)75X酒精表面消毒30 s， 0. 1% HgCl2消毒IO min，鋪在預(yù)先倒好的篩選培養(yǎng)基上，經(jīng)7 15 d篩選培養(yǎng)， 將正常生長(zhǎng)的綠色苗進(jìn)行第2次抗性篩選(7 15 d)，將第2次篩選后的抗 性植株進(jìn)行第3次抗性篩選(7 15 d)，第2次，第3次篩選培養(yǎng)基為 Ms+Kan(150 mg / L)。將第三次篩選后的綠苗轉(zhuǎn)入花盆，溫室培養(yǎng)至種子 收獲。
對(duì)于用含有去除篩選標(biāo)記的pC1300-nRnD6C/D的農(nóng)桿菌處理后獲得 的T1代油菜種子直接播種于田間，提取葉片DNA，通過(guò)PCR篩選陽(yáng)性植株。
實(shí)施例八、及"ZMC、 / "62>基因植物表達(dá)物對(duì)厶6脂肪酸脫氫酶底物催化 產(chǎn)物的GC-MS分析
1. 脂肪酸的提取與甲酯化。
取50-100 mg成熟對(duì)照或轉(zhuǎn)基因油菜種子，液氮中充分研磨，加入5 ml 5% KOH-CH3OH， 7(TC水浴5 h后加入HC1酸化至其pH值達(dá)2.0。再 加入4ml 14%BF3-CH3OH (購(gòu)自Aldtich公司)溶液，70。C水浴1.5 h。加 入2 ml 0.9% NaCl溶液，混勻后靜止片刻。加入2 ml氯仿正己烷(V/V 1:4) 抽提，吸取抽提液，N2吹干。最后溶于lOO)al乙酸乙酯。
2. 終產(chǎn)物GC-MS檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)。
所用GC/MS儀為TurboMass (PerkinElmer公司)，柱子BPX-70， 30 m x0.25 mm><0.25 vm，柱溫120°C ，氣化室溫度230°C 。取1 pl終產(chǎn)物 上樣，分流比10: 1。
3. GC-MS結(jié)果分析。
對(duì)比圖7-2j和7-2k，與未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的油菜種子對(duì)照相比，轉(zhuǎn)化株油 菜出現(xiàn)兩個(gè)新的產(chǎn)物峰，與標(biāo)準(zhǔn)品和酵母GC-MS結(jié)果比較，可以發(fā)現(xiàn) 在保留時(shí)間為7.25min左右時(shí)，出現(xiàn)GLA的產(chǎn)物峰；在保留時(shí)間為7.75 min左右時(shí)，出現(xiàn)SDA的產(chǎn)物峰。以上結(jié)果證明來(lái)源于黑茶薦子的基因 i oD6D在油菜種子中成功表達(dá)，所表達(dá)的蛋白可以分別催化底物亞油酸
(LA)和a-亞麻酸(ALA)生成GLA和SDA。這也就表明，將W"A5C/D 轉(zhuǎn)入油菜，可以用轉(zhuǎn)基因油菜作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)GLA和SDA。
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序列表
<110〉中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 〈120〉具有A6脂肪酸脫氫酶功能的基因及其應(yīng)用
〈130〉 1
<160> 8
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211〉 1347
<212〉 腿
〈213〉 Ribes nigrum L
<400〉 1 atggct3at.gcaatcsaga.3gtacatgacagttgaggagc"taacaagcca60
g3gg3tUgtggat,CT.Ct,3t,tcsgggtsaggttt3C33tggasaaaggaa120
C3CCC3ggtgggg3tagctctctcctgaatCt3ggtggtCa.agatgtcac3g8tgC3ttC180
3ttgCtt3t,C3t,ccaggtactgcttggcaa.tatcttgaca.ggttCttt3Ctgggtstm240
ctcaaagatttC33tgtCt,C3gatgtatccaaa.gattataga333CttgCatctgagttt300
sccaaaatgggtcttttt,gcaaaga,3agggC3tggtgUttctactccttUgtcttggg360
gcattcttgt,ttgct.gtttgtgtttatggtgttttgtsnctcaaagtttgtttgtgcat420
t.tgtgttgtggtgggattt,tggggtmtatggatgcaaagtggttatgctggtx3cgat柳
tCtgggC3tt3tCag3C38tgtctsctcctttttatacca3tttggctcaaattcttact540
gg338ttgCCtt3gtggt3ttagtatggcttggtgg333tgg3CCC3C33tgctcsccac600
gttgctgttastagtattgaccatgaccctgstcttcagt3C3tgCC3ttttttgtcctc660
tctcccaaattgttca.atggcataacttctCgCtttt3tgggaggaagttggagl:Ug3t720
gcttttgctaggUC3tggtaagttatcagcattggacattttatccggtgatgattttt780
gC3Cg3ttUatatgtttgtgcccacgttttttatgttgctttcaaagaaaaaagtaccc840
sacagacctttgaatatagcgggaattaUgtgUctggatttggtttcctcttcttgtt900
tcat.gcctt.cccasttggsctgagaggatg3tgtUgtgCtagtgagcttt3C3gtt3Ct960
tc3a1;l:.c33C3Cgtt3C3ttttgtt"tgaatcactact,cggctgataattatatgggacat1020
cctactggg3acg3ttggtttgagaagcagscaagtgggaCtttgg3C3tttcgtgcccg1080
tcttggatggattggtttcatggtgggctgC33ttCC333ttgagcatca.tttgtt,ccca1140
agattgcctcg3tgccagcttaggaaggtctctccttttgtgaaagagctttgcaagaaa1200
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〈210> 2
〈21" 1347
<212〉 DNA
<213〉 Ribes nigr固L.
<400> 2 3tgggtg333atgg3agga,agtacatgacagttg3gg3gCtaaaagtgcat33ta3gCC360
gaggatt.tgtgg3tctct,attcagggtaaggttt8C33tgtcsctgattggaaaaaggaa120
C3CCC3ggtgggg3t3gCtCactcct,gaatctgggtggtcaag3tgtcac3g3t,gC3ttC180
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CtC333g3tttC333gtctC3g3tgt3tCCaaagattacagaaa.ac"ttgcatctgagttt300
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<210〉 3
<211> 448
<212> PRT
<213> Ribes nigrum
<柳> 3
Met Ala 1
Asn Ala lie Lys Lys Tyr Met Thr Val Glu Glu Leu Lys Val
5
10
15
His Asn Lys Pro Glu Asp Leu Trp lie Ser lie Gin Gly Lys Val Tyr
20
25
30
Asn Val Thr Asp Trp Lys Lys Glu His Pro Gly Gly Asp Ser Ser Leu 35 40 45
Leu Asn Leu Gly Gly Gin Asp Val Thr Asp Ala Phe lie Ala Tyr His
50
55
60
Pro Gly Thr Ala Trp Gin Tyr Leu Asp Arg Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr
65
70
75
80
Leu Lys Asp Phe Asn Val Ser Asp Val Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu 85 90 95
Ala Ser Glu Phe Thr Lys Met Gly Leu Phe Ala Lys Lys Gly His Gly
100
105
110
Val Phe Tyr Ser Phe Cys Leu Gly Ala Phe Leu Phe Ala Val Cys Val
115
120
125
Tyr Gly Val Leu Tyr Ser Gin Ser Leu Phe Val His Leu Cys Cys Gly
130
135
140
Gly lie Leu Gly Phe Leu Trp Met Gin Ser Gly Tyr Ala Gly His Asp
145
150
155
160
Ser Gly His Tyr Gin Thr Met Ser Thr Pro Phe Tyr Thr Asn Leu Ala
165
170
175
Gin lie Leu Thr Gly Asn Cys Leu Ser G、'lie Ser Met Ala Trp Trp 180 185 190
Lys Trp Thr His Asn Ala His His Val Ala Val Asn Ser lie Asp His
195
200
205
Asp Pro Asp Leu Gin Tyr Met Pro Phe Phe Val Leu Ser Pro Lvs Leu 210 215 220
Phe Asn Gly lie Thr Ser Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Leu Glu Phe Asp
225
230
235
240
Ala Phe Ala Arg Phe Met Val Ser Tyr Gin His Trp Thr Phe Tyr Pro 245 250 2&
Val Met lie Phe Ala Arg Phe Tyr Met Phe Val Pro Thr Phe Phe Met
260
265
270
Leu Leu Ser Lys Lys Lys Val Pro Asn Arg Pro Leu Asn lie Ala Gly
275
280
285
I〗e I〗e Val Phe Trp lie Trp Phe Pi-o Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro
290
295
300
Asn Trp Thr Glu Arg Met Met Phe Val Leu Val Ser Phe Thr Val Thr 305 310 315 320
Ser lie Gin His Val Thr Phe Cys Leu Asn His Tvi- Ser Ala Asp Asn 325 ' 330' 335
Tvr Met Gly His Pro Thr Gly Asn Asp Trp Phe Glu Lvs Gin Thr Ser 340 345 350
Glv Thr Leu Asp lie Ser Cys Pro Ser Trp Met Asp Trp Phe His Gly 355 '360 365
Gly Leu Gin Phe Gin lie Glu His His Leu Phe Pro Arg Leu Pro Arg 370 375 380
Cys Gin Leu Arg Lys Val Ser Pro Phe Val Lys Glu Leu Cys Lys Lys 385 390 395 400
His Asn Leu Pro Tyr Arg Ser Leu Ser Phe Phe Glu Ala Asn Val Ala 405 410 415
lie lie Lys Thr Leu Arg Thr Ala Ala Leu Gin Ala Arg Asp Leu Ser 420 425 430
Asn Pro lie Ser Lys Asn Leu Leu Trp Glu Ala Val Asn Thr Tyr Gly 435 440 445 '
〈210〉 <211〉 <212〉 <213>
4
448 PRT
Ribes nigrum
<400〉 4
Met 1
Gly Glu Asn Gly Arg Lys Tyr Met Thr Val Glu Glu Leu Lys Val 5 10 沾
His Asn Lvs Pro Glu Asp Leu Trp lie Ser lie Gin Gly Lys Val Tyr 20 25 ' 3i)
Asn Val Thr Asp Trp Lvs Lys Glu His Pro Gly Gly Asp Ser Ser Leu 35 40 45
Leu Asn Leu Glv Gly Gin Asp Val Thr Asp Ala Phe lie Ala Tyr His 50 55 60
Pro Gly Thr Val Trp Gin Tyr Leu Asp Arg Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr 65 '70 75 ' 80
Leu Lys Asp Phe Lvs Val Ser Asp Val Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu & 90 95
Ala Ser Glu Phe Thr Lys Met Gly Leu Phe Ala Lys Lys Gly His Gly 100 105 110
Val Phe Tvr Ser Phe Cys Leu Gly Ala Phe Leu Phe Ala Val Cvs Val 115 120 125
Tvr Gly Val Leu Tyr Ser Gin Ser L_eu Phe Val His Leu Cys Cys Gly 130 135 140
GIy lie Leu Gly Phe Leu Ti—p Met Gin Ser Gly Tyr Ala Gly His Asp 145 150 15^ 160
Ser GIy His Tvr Gin Thr Met Ser Thr Pro Phe Tvr Thr Asn Leu Ala 165 170 175
Gin lie Leu Thr Gly Asn Cvs Leu Ser Gly lie Ser Met Ala Trp Trp 180 185 190
Lys Trp Thr His Asn Ala His His lie Ala Val Asn Ser lie Asp His 195 200 205
Asp Pro Asp Leu Gin Tyr Met Pro Phe Phe Val Leu Ser Pro Lys Leu 210 215 220
Phe Asn Ser lie Thr Ser Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Leu Glu Phe Asp 225 230 235 240
Ala Phe Ala Arg Phe Met Val Ser Tyr Gin His Trp Thr Phe Tyr Pro 245 250 255
Val Met lie Phe Ala Arg Phe Tyr Met Phe Val Pro Thr Phe Phe Leu 260 265 270
Leu Leu Ser Lys Lys Lys Val Pro Asn Arg Leu Leu Asn lie Ala Gly 275 ' 280 285
lie lie Val Phe Trp lie Trp Phe Pro Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro 290 295 300
Asn Trp Thr Glu Arg Met Met Phe Val Leu Val Ser Phe Thr Val Thr 305 310 315 320
Ser lie Gin His Val Thr Phe Cys Leu Asn His Tyr Ser Ala Asp Asn 325 330 335
Tyr Met Glv His Pro Thr Gly Asn Asp Trp Phe Glu Lys Gin Thr Ser 340 345 350
Gly Thr Leu Asp lie Ser Cys Pro Ser Trp Met Asp Trp Phe His Gly 355 360 365
Gly Leu Gin Phe Gin Leu Glu His His Leu Phe Pro Arg Met Pro Arg 370 375 380
Cys Gin Leu Arg U's Val Ser Pro Phe Val Lys Glu Leu Cys Gin Lys 385 390 3& 400His Asn Leu Pro Tyr Arg Ser Leu Ser Phe Phe Glu Ala Asn Val Ala 405 410 415
Thr lie Lvs Thr Leu Arg Thr Ala Ala Leu Gin Ala Arg Asp Leu Ser 420 425 430
Asn Pro lie Thr Lys Asn Leu Leu Trp Glu Ala Val Asn Thr Tyr Gly 435 440 445
〈210> <211〉 〈212> 〈213>
5
28 DNA
人工序列
<400〉 5
cgcgggtacc a.tggctaatg caatcaag
28
<210〉 <211〉 〈212〉 <213〉
6
28 魏
人工序列
<400> 6
cgccgagctc tcagccatag gtgttga
28
〈210〉 〈211> <212> 〈213〉
7
28 DNA
人工序列
<400> 7 cgcgggtacc
atgggtgaaa atggaagg
28
<210〉 <211> 〈212〉 〈213〉
8
28 DNA
人工序列
〈400〉 8
cgccgagctc tcaaccatag gtgttgac
28
〈210> 9 〈211〉 33 <212> 隨<213〉 人工序列
<400〉 9
cgcgaagctt actacastgt cggag3gaca agg <210〉 10 <211〉 39 〈212〉 DNA <213〉 人工序列
〈400> 10
cgcgggatcc ttgtgtatgt tctgtagtga. tgagtttg
權(quán)利要求
1.基因RnD6C，其核苷酸酸序列如SEQ ID NO1所示。
2. 基因i^D6D，其核苷酸酸序列如SEQIDNO:2所示。
3. 權(quán)利要求l的基因W"D(5C所編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。
4. 權(quán)利要求2的基因i^D6D所編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5. —種表達(dá)載體，其特征在于包含權(quán)利要求l和/或2所述的基因。
6. 權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其為低等真核細(xì)胞表達(dá)載體或植物表達(dá)載體。
7. 權(quán)利要求6的表達(dá)載體，其中低等真核細(xì)胞表達(dá)載體選自pYES2等用 于低等真核細(xì)胞表達(dá)的載體。
8. 權(quán)利要求6的表達(dá)載體，其中所述植物表達(dá)載體選自pBIN19、pBI121、 pB221、 pCambia 1300， pGreen等的植物表達(dá)載體。
9. 權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其特征在于還包含啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子選自 花椰菜花葉病毒CaMV35S、 Ubiqutin、 Actin、或植物組織部位特異表 達(dá)啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子單獨(dú)或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。
10. —種宿主細(xì)胞，其特征在于包含權(quán)利要求5的表達(dá)載體。
11. 權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，其中所述表達(dá)載體是通過(guò)Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì) 粒、植物病毒表達(dá)載體、直接的DNA轉(zhuǎn)化、微注射或電穿孔的方式導(dǎo) 入。
12. 權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，其為低等真核細(xì)胞或植物細(xì)胞。
13. 權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所述低等真核細(xì)胞為酵母、藻類等 的細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包括煙草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、 芝麻和花生等細(xì)胞。
14. 權(quán)利要求1的基因i "I)6C或權(quán)利要求2的基因hZ)6Z)在生產(chǎn)GLA 和SDA中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明利用來(lái)源于黑茶藨子(Ribes nigrum L.)DNA中的兩個(gè)具有完整閱讀框架的基因RnD6C和RnD6D，將其在酵母表達(dá)體系中進(jìn)行了表達(dá)。通過(guò)GC-MS分析表明，在酵母中這兩個(gè)基因所編碼的蛋白可以分別催化外加底物亞油酸(LA)和α-亞麻酸(ALA)分別生成γ-亞麻酸(GLA)和十八碳四烯酸(SDA)，具有Δ⁶脂肪酸脫氫酶功能。本發(fā)明可應(yīng)用于采用基因工程技術(shù)以低等真核細(xì)胞表達(dá)體系和植物表達(dá)體系生產(chǎn)GLA和SDA。
文檔編號(hào)C12N15/53GK101353661SQ20071011947
公開(kāi)日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2007年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月25日
發(fā)明者宋麗英, 尹維波, 巖 張, 軍 胡, 胡贊民, 陳宇紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所