專利名稱：：一種利用kdr基因多態(tài)性預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法及試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用KDR基因多態(tài)性預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法及試劑，更具體地說(shuō)是通過(guò)測(cè)定人KDR基因多態(tài)性預(yù)測(cè)受試者對(duì)于冠心病的易感性，該方法可用于疾病的輔助診斷、治療和新藥開發(fā)，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景心血管病已經(jīng)成為全球嚴(yán)重危脅生命和健康的重要疾病，每年為此消耗了大量人力、物力和財(cái)力。能夠找到這類疾病的早期預(yù)測(cè)標(biāo)記意義非常明顯。冠心病的發(fā)生是基因遺傳傾向和一系列環(huán)境危險(xiǎn)因素長(zhǎng)期作用的結(jié)果所導(dǎo)致的，正常血管內(nèi)的維護(hù)修復(fù)能夠?qū)弓h(huán)境危險(xiǎn)因素所造成的血管損傷。目前進(jìn)行冠心病的遺傳病因研究，多采用單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism)作為基因組標(biāo)志的關(guān)聯(lián)分析方法，是有效的。SNP是指染色體基因組水平上單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的頻率需>1%，SNP是雙等位基因標(biāo)記，這種單堿基變化中有70.1%為同型堿基之間的轉(zhuǎn)換如G/A或T/C，29.1%為發(fā)生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C(胞嘧啶)是人類基因組中最易發(fā)生變化的位點(diǎn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)是甲基化胞嘧啶，能夠自發(fā)脫氨基轉(zhuǎn)換為T(胸腺啼啶)，SNP包含了己知多態(tài)性的80-90%，是最常見的遺傳變異。由于生存的選擇壓力導(dǎo)致SNP在單一基因和整個(gè)基因組中的分布呈不均勻性。SNP在基因非編碼區(qū)的數(shù)量是編碼區(qū)的4倍，總數(shù)可達(dá)3百萬(wàn)個(gè)(BrookesAJ.TheessenceofSNP.Gene,1999;234:177-186.)。SNP以其密度高，平均每lkb就有l(wèi)個(gè)；代表性強(qiáng)，位于基因內(nèi)部的SNP可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平；遺傳穩(wěn)定性好，同微衛(wèi)星多態(tài)性比較而言；易于自動(dòng)化分析，因SNP在人群中為雙等位基因標(biāo)記，可簡(jiǎn)單以"+/-或1/0"直接分型，成為很好的遺傳標(biāo)志。(CollinsFS,BrooksLD，ChakravartiA.ADNApolymorphismdiscoveryresourceforresearchonhumangeneticvariation.GenomeRes，1998;8:1229-1231)。位于染色體4qll-ql2的KDR(kinaseinsertdomainreceptor(atypeIIIreceptortyrosinekinase))基因編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的II型受體，是個(gè)1536個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，且KDR是內(nèi)皮祖細(xì)胞EPC(endothelialprogenitorcells)的重要表面抗原。有限研究指出，VEGF/KDR通路在血管生成，血管修復(fù)方面發(fā)揮重要作用，且EPC的活性和數(shù)量與冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。因此，KDR的基因多態(tài)性一定與冠心病的易感性有著重要的關(guān)系。經(jīng)過(guò)現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)檢索，未見有KDR基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)聯(lián)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是提供一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種預(yù)測(cè)冠心病的試劑，包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案-一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法，通過(guò)提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，測(cè)定受試者的KDR基因啟動(dòng)子區(qū)-604位點(diǎn)，編碼區(qū)1192、1719位點(diǎn)的(對(duì)應(yīng)NCBI的SNP庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)分別是rs2071559、rs2305948、和rsl870377)基因型，預(yù)測(cè)受試者對(duì)冠心病的易感性三個(gè)位點(diǎn)的危險(xiǎn)等位基因-604C，1192A，1719A，分別增加冠心病的風(fēng)險(xiǎn)為1.24，1.32，1.38倍。同時(shí)具有的時(shí)候采用相乘的系數(shù)，此時(shí)受試者的易感性最高。本發(fā)明提供了兩種分離核酸，具有SEQIDNO.l和SEQIDNo.2所示的堿基序列，SEQIDNO.l為KDR的啟動(dòng)子區(qū)部分序列，其第177位是C，SNP-604的位點(diǎn)；SEQIDN0.2為KDR的mRNA序列，其1192和1719位是A和A，分別是SNP1192和SNP1719位點(diǎn)。圖1為位于多態(tài)性變異位點(diǎn)的示意圖，SNP1192位于第7個(gè)外顯子上，SNP1719位于第11個(gè)外顯子上。本發(fā)明提供了三組等位基因特異性的引物，具有SEQIDN0.3至EQIDN0.8所示的堿基序列，長(zhǎng)度為19-22bp，而且可以特異性地?cái)U(kuò)增出SEQIDNO.l和SEQIDN0.2所示序列中SNP-604、SNP1192和SNP1719擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)冠心病易感性的診斷試劑盒，其中含有本發(fā)明特異性擴(kuò)增KDR基因的引物對(duì)和用于PCR擴(kuò)增檢測(cè)的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些常規(guī)組件和檢測(cè)方法。檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常KDR基因相互對(duì)比是否存在變異時(shí)，所需的化學(xué)試劑還包括特異性內(nèi)切酶等。本發(fā)明試劑盒中的全部組分、含量、來(lái)源和使用方法如下本發(fā)明試劑盒供IO人份檢測(cè)應(yīng)用，保存于-20'C，其組分、含量和來(lái)源如下60ul10XPCR緩沖液(Takara)，50ul10mMdNTP混合液(Takara)，lOul(2unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各12ul(50pmol/ul)Fl和Rl引物(奧科合成)1.5ml純水(自制)，20ul10X限制酶反應(yīng)緩沖液(NewEnglandBiolabs),1Oul(1Ounit/ul)限制酶(NewEnglandBiolabs)。其中Fl禾BRl為SEQIDNO.3和SEQIDNO.4時(shí)且限制酶為5頂I用于檢測(cè)SNP-604位點(diǎn)；為SEQIDNO.5和SEQIDNO.6時(shí)且限制酶為用于檢測(cè)SNP1192位點(diǎn)；為SEQIDNO.7和SEQIDNO.8時(shí)且限制酶為用于檢測(cè)SNP1719位點(diǎn)。本發(fā)明可以同時(shí)含有以上三個(gè)引物對(duì)。試劑盒的使用方法1)通過(guò)PCR擴(kuò)增所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)包括-604、1192、1719的部分片段加入基因組DNA溶液100ng、5ulIOXPCR緩沖液、4uI10mMdNTP、1.25單位TaqDNA聚合酶和50pmolFl和Rl分別為正向引物和反向引物；加入純水，使總體積為50ul。按常規(guī)PCR反應(yīng)條件操作。反應(yīng)在變性30秒，退火30秒(退火溫度根據(jù)不同的儀器及體系可能變化)，72i:延伸30秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，取3ulPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(濃度分別為3%、4%、和3%針對(duì)-604、1192和1719位點(diǎn))，如-604位點(diǎn)擴(kuò)增了290bp、1192位點(diǎn)擴(kuò)增了262bp、1719位點(diǎn)擴(kuò)增了404bp的片段，獲得了單一條帶，即為擴(kuò)增成功。2)通過(guò)用限制酶處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)定KDR基因的這三個(gè)多態(tài)性向10ul上述擴(kuò)增的PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入lul限制酶反應(yīng)緩沖液、0.2ul限制酶，并在適當(dāng)溫度水浴中消化過(guò)夜。之后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(濃度分別為3%、4%、禾卩3%針對(duì)-604、1192和1719位點(diǎn))。(注SNP-604位點(diǎn)限制酶為fowI，消化溫度為65。C;SNP1192位點(diǎn)限制酶為SWZ/71，消化溫度為37"C;SNP1719位點(diǎn)限制酶為^M，消化溫度為37。C)3)多態(tài)性定型SNP-604:174bp+116bp兩個(gè)條帶為CC基因型，單一條帶為TT基因型，174bp+116bp+2卯bp3個(gè)條帶為雜合型CT。SNP1192:30bp+232bp兩個(gè)條帶為AA基因型，單一條帶為GG基因型，30bp+232bp+262bp3個(gè)條帶為雜合型AG。SNP1719:191bp+213bp兩個(gè)條帶為AA基因型，單一條帶為TT基因型，191bp+213bp+404bp3個(gè)條帶為雜合型AT。本發(fā)明的測(cè)定方法測(cè)定了來(lái)源于人的基因組DNA，樣品沒(méi)有限制如，體液(如血液、腹水和尿液)、組織細(xì)胞(如肝組織)等。通過(guò)提取和純化這些樣品可制備基因組DNA。在進(jìn)行本發(fā)明的基因診斷時(shí)，優(yōu)選使用用于測(cè)定根據(jù)KDR基因的突變類型存在的診斷試劑，診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對(duì)應(yīng)于用于測(cè)定KDR基因突變類型的方法。特定的試劑按采用的測(cè)定方法來(lái)適當(dāng)?shù)剡x擇。試劑的特征是，組成測(cè)定由KDR基因定義的突變類型的手段是必要的，如，DNA片段/和/或作為用于測(cè)定的特異限制酶。試劑，例如特定制備的用于PCR擴(kuò)增步驟的引物，該步驟用于包含KDR基因的突變點(diǎn)的特定擴(kuò)增片段，不被認(rèn)為是本發(fā)明診斷試劑的必要成分，它們也包含于本發(fā)明的診斷試劑之中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明首次闡明了KDR基因多態(tài)性位點(diǎn)與冠心病的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法，該方法可用于冠心病的預(yù)防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發(fā)。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖1為KDR基因的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)的示意圖。具體實(shí)施方式用于下列實(shí)施例中表示試劑的英文縮寫如下。需要時(shí)，用高壓鍋(12(TC，20分鐘)滅菌EDTA:乙二胺四乙酸二鈉SDS:十二烷基硫酸鈉TE:10mMTris—HCl(pH7.5)，lmMEDTA(pH8.0)10XPCR緩沖液100mMTris—HCl(pH8.3)，500mMKC1，15mM氯化鎂(MgC12)0.01%(W/V)白明膠dNTP:脫氧核苷三磷酸瓊脂糖實(shí)施例l:血液樣本收集和基因組DNA的提取從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院收集19至83歲的無(wú)血緣關(guān)系的病例。入選標(biāo)準(zhǔn)是經(jīng)冠脈造影分析，冠狀動(dòng)脈主干支至少有一支存在》50%的狹窄。而作為對(duì)照的須<20%的狹窄。共計(jì)收集冠心病患者665例，平均年齡57.9歲±9.5歲，其中男性占84.4%，對(duì)照1015例，平均年齡57.7歲±8.7歲，其中男性占82.6%。所有受檢者均為漢族，且簽署知情同意書，這一研究也得到了本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)下列方法，用人外周血制備基因組DNA。在抗凝劑EDTA存在下，將收集的10ml人外周血在2500rpm,離心分離30分鐘除去血清。接著加入0.2%NaCl溶液，使總體積為50ml。輕輕振蕩溶液5-6次，并使其放置于冰上15分鐘。此后，在2500rpm離心分離30分鐘，借此收集沉淀物。用0.2%的NaCl溶液，以類似于前面的方式再進(jìn)行洗漆。在如此獲得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mMEDTA(4ml)，以懸浮該沉淀物。將10%SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入懸液中，其加入量分別為4ml、16ul和20ul，接著上下顛倒懸液輕輕混合。然后，在37'C過(guò)夜溫育懸液。過(guò)夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm進(jìn)行離心分離IO分鐘除去水層。將水層和4ml酚/氯仿溶液混合，接著逆混合并以3000卬m離心分離IO分鐘。除去水層。最后，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10,3MNaAC(pH5.2)，兩倍量的冷無(wú)水乙醇，使DNA沉淀。用70X的乙醇洗滌以獲得基因組DNA。使這樣獲得的DNA，基因組DNA溶解于TE中，然后定量測(cè)定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液濃度校正至30ng/ul，置-20'C冰箱保存。實(shí)施例2:SNP的識(shí)別確定本發(fā)明采用PCR-RFLP禾nPCR測(cè)序技術(shù)同時(shí)對(duì)KDR基因的三個(gè)位點(diǎn)SNP-604、SNP1192、禾BSNP1719進(jìn)行檢測(cè)。采用特異性引物SEQIDN0.3至SEQIDN0.8分別進(jìn)行擴(kuò)增分型。1.通過(guò)PCR擴(kuò)增所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)包括-604、1192、1719的部分片段加入基因組DNA溶液100ng、5ul10XPCR緩沖液、4ul10mMdNTP、1.25單位TaqDNA聚合酶和5Opmo1Fl和Rl分別為正向引物和反向引物；加入純水，使總體積為50ul。按常規(guī)PCR反應(yīng)條件操作。反應(yīng)在變性30秒，退火30秒(退火溫度根據(jù)不同的儀器及體系可能變化)，72'C延伸30秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，取3ulPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(濃度分別為3%、4%、和3%針對(duì)-604、1192和1719位點(diǎn))，如-604位點(diǎn)擴(kuò)增了290bp、1192位點(diǎn)擴(kuò)增了262bp、1719位點(diǎn)擴(kuò)增了404bp的片段，獲得了單一條帶，即為擴(kuò)增成功。2.通過(guò)用限制酶處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)定KDR基因的這三個(gè)多態(tài)性向10ul上述擴(kuò)增的PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入lul限制酶反應(yīng)緩沖液、0.2ul限制酶，并在適當(dāng)溫度水浴中消化過(guò)夜。之后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(濃度分別為3%、4%、和3%針對(duì)-604、1192和1719位點(diǎn))。(注SNP-604位點(diǎn)限制酶為S^Ml，消化溫度為65'C;SNP1192位點(diǎn)限制酶為&"/71，消化溫度為37'C;SNP1719位點(diǎn)限制酶為^M，消化溫度為37°03.多態(tài)性定型SNP-604:174bp+116bp兩個(gè)條帶為CC基因型，單一條帶為TT基因型，174bp+116bp+2卯bp3個(gè)條帶為雜合型CT。SNP1192:30bp+232bp兩個(gè)條帶為AA基因型，單一條帶為GG基因型，30bp+232bp+262bp3個(gè)條帶為雜合型AG。SNP1719:191bp+213bp兩個(gè)條帶為AA基因型，單一條帶為TT基因型，191bp+213bp+404bp3個(gè)條帶為雜合型AT。實(shí)施例3:KDR基因SNP與冠心病的相關(guān)一.方法利用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，檢驗(yàn)Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)，數(shù)量變量采用t檢驗(yàn)，質(zhì)量變量采用卡方檢驗(yàn)。雙側(cè)P<0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異顯著。采用單因素Logistic回歸分析計(jì)算冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)OR值及其95%可信區(qū)間(CI)。二.結(jié)果1.病例和對(duì)照的基本臨床資料見表1。_表1_<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>TG，mmol/L吸煙％高血壓史，％糖尿病史，％1.45(15.10)1.60(13.11)*37.458.0*24.947.4*4.614.9*<0.012.KDR基因這三個(gè)SNP顯著與冠心病相關(guān)聯(lián)，詳見表2。表2:KDR基因的基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性基因型，n(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>原始OR根據(jù)2x2四格表計(jì)算，經(jīng)過(guò)年齡、性另U、吸煙、BMI，HDL,non-HDL，TC,TG,和高血壓史，糖尿病史的校正logistic回歸分析得出校正的OR值,M-T,m-C對(duì)于SNP-604;M=G，m=A對(duì)于SNP1192;M=T，m=A對(duì)于SNP1719.可見，KDR的三個(gè)基因多態(tài)性顯著與冠心病的易感性相關(guān)。實(shí)施例4:檢測(cè)試劑盒制備檢測(cè)冠心病相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，包含有可擴(kuò)增出KDR基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的引物對(duì)，及其PCR-RFLP相應(yīng)試劑，成分和含量如下，于一2(TC保存60ul10XPCR緩沖液(Takara),50ul10mMdNTP混合液(Takara)，10ul(2unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各12ul(50pmol/ul)Fl和Rl引物(奧科合成)，1.5ml純水(自制)，20ul10X限制酶反應(yīng)緩沖液(NewEnglandBiolabs)，10u(10unit/ul)限制酶(NewEnglandBiolabs)。其中Fl和Rl為SEQIDNO.3和SEQIDNO.4時(shí)且限制酶為^wl用于檢測(cè)SNP-604位點(diǎn)；為SEQIDNO.5和SEQIDNO.6時(shí)且限制酶為用于檢測(cè)SNP1192位點(diǎn)；為SEQIDNO.7和SEQIDNO.8時(shí)且限制酶為J/wI用于檢測(cè)SNP1719位點(diǎn)。本發(fā)明具有實(shí)用性的例證1)本發(fā)明的KDR基因多態(tài)性的檢測(cè)方法可用于分析KDR基因上的SNP-604、SNP1192、SNP1719三個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性，應(yīng)用在對(duì)冠心病的輔助性診斷和對(duì)個(gè)體是否有多大的冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。以利于開展冠心病的早期干預(yù)和治療。2)利用本發(fā)明闡述冠心病基因的三個(gè)多態(tài)性，作為生物標(biāo)志物之一，可用作藥物設(shè)計(jì)的分子靶標(biāo)的篩選，以幫助尋找具有調(diào)節(jié)KDR表達(dá)的活性分子，促進(jìn)KDR新藥開發(fā)。3)本發(fā)明建立的檢測(cè)KDR基因多態(tài)性的核酸序列和冠心病相關(guān)位點(diǎn)，可高靈敏度，特異性地應(yīng)用于冠心病基因診斷用的試劑盒。如上所述，得出結(jié)論，KDR基因的三個(gè)多態(tài)性與冠心病具顯著相關(guān)性。因此，根據(jù)本發(fā)明，測(cè)定這些多態(tài)性可用于進(jìn)行基因診斷。本發(fā)明敘述了KDR基因冠心病相關(guān)的新突變點(diǎn)，并提供了一種測(cè)定KDR基因這三個(gè)多態(tài)性的方法。而且，根據(jù)本發(fā)明，只需要少量DNA樣品就足以測(cè)定KDR基因的多態(tài)性。結(jié)果，本發(fā)明提供了一種測(cè)定冠心病相關(guān)基因多態(tài)性的基因診斷方法。序列表〈110〉中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院〈120〉一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法及試劑〈130〉<160>8<170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈211〉781<212〉腿<213〉人屬，人種〈400〉1cctccttcccctgggcctaaggatatcttggccaaactttcactagggctcttcgttgggtaggcaggtcacttcaaacttggagccgcccg獄tgggcaagtgcgttttctgattaagttstactggcacccttatacccagcttgcgacccggcatacttggctgagctgcagattctcggccacttcagacgcgcgcgcctggtgaggg3gCggtgctcttcgcaggaccggcaagcgattaaatcttggagttgccaaagttgttgctctgggatcagtccagttgtgtggggaaatggggagatgccgggtaccCgggtg3ggggcggggctggccccgccccgcatggccccgcctccgcgctgctggaagctctgctctgaaaaggggcatg60gagcacgatggacaaaagccttcttggggc1203犯tattttgggaaatagcgggaatgctgg180agcaacc3ggittcagctttttaasctEicaa240actactggcaggagtcgctg300tatccgcttctcccttgtggctccaaactg360cgatggcg犯gsgggtcctgcactttgacg420cgctcctggtgatgctccccaaatttcggg480tcagcgcccgttaccgagtactttttattt540gttctctcctgggcgacttggggcccagcg600gtaaatgggcttggggagctggagatcccc660ccgcacgggagagcccctcctccgccccgg720ctagagtttcggctccagctcccaccctgc780781<210〉2<211>5830〈212〉腿〈213〉人屬，人種<400>2actgagtcccgggaccccgggagagcggtcagtgtgtggtcgctgcgtttcctctgcctgcgccgggcatcacttgcgcgccgcagaaagtccgtctggcagcctggatatcctctcctaccggcacccgcagacgcccctgcagccgccggtcggcgcccgggctccctagccctgtgcgctcaactgtcctgcgctgcggggtgccgcgagttccacctccgcgcctccttctctagacaggcgctgggagaaagaaccggctcccgagttctgggcatttcgcccggctcgaggtgc;|atg|cagagcaaggtgctgctggccgtcgccctgtggctctgcgtggagacccgggccgcctctgtgggtttgcctagtgtttctcttgatctgcccaggctcagcatacaaaaagacatacttacaattaaggctaatacaactcttcaaattacttgcaggggacagagggacttggactggctttggcccaataatcagagtggcagtgagcaaagggtggaggtgactgagtgcagcgatggcctcttctgtaagacactcacaattccaaaagtgatcgga犯tgacactggagcctacaagtgcttctaccgggaaactgacttggcctcggtcatttatgtctatgttcaagattacagatctccatttattgcttctgttagtgaccaacatggagtcgtgtacattactgagaacaaaaacaaaactgtggtgattccatgtctcgggtccatttcaaatctcaacgtgtcactttgtgcaagatacccagaaaagagatttgttcctgatggtaacagaatttcctgggacagcaagaagggctttactattcccagctacatgatcagctatgctggcatggtcttctgtgaagcaaaaattaatgatgaaagttaccagtctattatgtacatagttgtcgttgtagggtataggatttatgatgtggttctgagtccgtctcatggaattgaactatctgttggagaaaagcttgtcttaaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacccttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatgaagaaatttttgagcaccttaactatagatggt互taacccggagtgaccaaggattgtacacctgtgcagcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagcacatttgtcagggtccatgaaaaaccttttgttgcttttggaagtggcatggaatctctggtggaagccacggtgggggagcgtgtcagaatccctgcgaagtaccttggttacccacccccagaaataaaatggtataaaaatggaataccccttgagtccaatcacacaattaaagcg60120180240300360420480540600660720780840卯O96010201080114012001260132013801440gggcatgtactgacgattatgg犯gtgsgtg犯3gagacacactgtcatc1500cttaccaatcccatttcaaagg卿agcagagccatgtggtctctctggttgtgtatgtc1560cc3cccc3ga_ttggtgsg犯atctctaatctctcctgtggattcctaccagtacggcacc1620actcaaacgctgacatgtacggtctatgccattcctcccccgcatcacatccactggtat1680tggcagttggaggaagagtgcgccaacgagcccagccaggctgtctcagt1740tacccttgtg犯gtgtggaiggacttccagggsgga犯ta^aattgaagtt1800aatttgctctaattgaaggsctgtaagtacccttgttatc1860caagcggca^atgtgtcagctttgtaca犯tgtg犯gcggtc犯c犯agtcggg卿gga1920gagagggtgstctccttccaCgtg3CC3ggggtcctgaaattactttgcaacctgacatg1980C￡LgCCC￡LCtgagc鄉(xiāng)agagcgtgtctttgtggtgcactgcagEicagatctacgtttgag2040aacctcacatggtac犯gcttggcccacagcctctgccaatccatgtgggagagttgccc2100acacctgtttgc犯g犯cttggstactctttgga犯ttgaatgccaccatgttctctaat2160agcaca33tgacattttgatcstggagcttccttgcaggaCC犯gg3g3C2220tatgtctgccttgctc犯gaattgcgtggtcaggcagctc2280acagtcctagagcgtgtggc￡LCCC￡LCgatCacaggaagLCctggagaatcag￡LCg￡LC￡l3gt2340attggggaaagcatcg33gtctcatgcacggcatctgggaatccccctccacagatcatg2400tggttt犯agat犯tgagacccttgtagaagactcsggc已ttgtattgaaggstggg犯c2460cggaacctcactatccgc已g3gtg3gg犯ggaggaxg^ggcctctacacctgccaggca2520tgcagtgttcttggctgtgc犯犯gtggaggcatttttcataatagaaggtgcccaggaa2580tattctagtaggcacggcggtgattgccatgttcttctgg2640ctacttcttgtcatcatcctacggaccgtt犯gCgggCC3stgg鄉(xiāng)gga3ctg犯gac32700ggctacttgtccatcgtcatgg3tCC3g3tg犯ctcccattggatg犯cattgtg3acg32760ctgccttatgatgccagcaaatgggaattcCCC3g3g3CCggctgaagctaggt犯gcct2820cttggccgtggtgcctttggccaagtgattg犯gc柳tgcctttgg犯ttgacaag3ca>2880gcascttgcaggacagtagcagtcaaaatgttga^gatagg￡tgC￡LaC￡LC￡Lcagtgagcat2940cgagctctcatgtctgaatctcaagatcctcattcatattggtcaccatctcaatgtggtc3000犯ccttctsggtgcctgtacC犯gCC3gg3gggccactcatggtgattgtggaattctgc3060aaatttggaaacctgtccacttacctgagg3tg犯tttgtcccctac犯g3120acc犯aggggcacgattccgtcaagggaaagactacgttggagc犯tccctgtgg3tCtg3180aaacggcgcttggacagcatcaccagtagccagagctcagccagctctggatttgtggag3240gagaagtccctcagtgatgtagaagaagaggaagctcctgaagatctgtataaggacttc3300ctgaccttggagcatctcatctgttacagcttccaagtggctaagggcatggagttcttg3360gcatcgcgaaagtgtatccetcagggacctggcggcacgaaatatcctcttatcggagaag3420aacgtggttaa犯tctgtgactttggcttggcccgggatatttataaagatccagattat3480gtcagaaaaggagatgctcgcctccctttgaaatggatggccccagaaacaatttttgac3540agagtgtacacaatccagagtgacgtctggtcttttggtgttttgctgtgggaaatattt3600tccttaggtgcttctccatatcctggggtaaagattgatgaagaattttgtaggcgattg3660aaagaaggaactagaatgagggcccctgattatactacaccagaaatgtaccagaccatg3720ctggactgctggcacggggagcccagtcagagacccacgttttcagagttggtggaacat3780ttgggaaatctcttgcaagctaatgctcagcaggatggcaaagactacattgttcttccg3840atatcagagactttgagcatggaagaggattctggactctctctgcctacctcacctgtt3900tcctgtatggaggaggaggaagtatgtgaccccaaattccattatgacaacacagcagga3960atcagtcagtatctgcagaacagtaagcgaaagagccggcctgtgagtgta犯aacattt4020gaagatatcccgttagaagaaccagaagtaaaagtaatcccagatgacaaccagacggac4080agtggtatggttcttgcctcagaagagctga犯actttggaagacagaaccaaattatct4140cc己tcttttggtgg犯tggtgcccagcaaaagcagggagtctgtggcatctgaaggctca4200犯ccagacaagcggctaccagtccggatatcactccgatgacacagacaccaccgtgtac4260tccagtgaggaagcagaacttttaaagctgatagagattggagtgc犯accggtagcsca4320gcccagattctccagcctgactcggggaccacactgagctctcctcctgtttaaaaggaa4380gcatccacaccccaactcccggacatcacatgagaggtctgctcagattttgaagtgttg4440ttctttccaccagcagg犯gtagccgcatttgattttcatttcgacaacagaaa犯ggac4500ctcggactgcagggagccagtcttctaggcatatcctggaagaggcttgtgacccaagaa4560tgtgtctgtgtcttctcccagtgttgacctgatcctcttttttcattcatttaaaaagca4620ttatcatgcccctgctgcgggtctcaccatgggtttagaacaaagagcttcaagcaatgg4680ccccatcctcaaagaagtagcagtacctggggagctgacacttctgtaaaactagaagat4740aaaccaggcaacgtaagtgttcgaggtgttgaagatgggaaggatttgcagggctgagtc4800tatccaagaggctttgtttaggacgtgggtcccaagccaagccttaagtgtggaattcgg4860attgatagaaaggaagactaacgttaccttgctttggagagtactggagcctgcaaatgc4920attgtgtttgctctggtggaggtgggcatggggtctgttctgaaatgtaaagggttcaga4980cggggtttctggttttagaaggttgcgtgttcttcgagttgggctaaagtagagttcgtt5040gtgctgtttctgactcctaatgagagttccttccagaccgttagctgtctccttgccaag5100ccccaggaagaaaatgatgcagctctggctccttgtctcccaggctgatcctttattcag5160aataccacaaagaaaggacattcagctcaaggctccctgccgtgttgaagagttctgact5220gc￡tca^a_cc3gcttctggtttcttctggaatgaataccctcatatctgtcctgatgtgat5280atgtctgagactgaatgcgggaggttcaatgtgaagctgtgtgtggtgtcaaagtttcag5340gaaggattttacccttttgttcttccccctgtccccaacccactctcaccccgcaaccca5400tcagtattttagttatttggcctctactccagtaaacctgattgggtttgttcactctct5460g犯tg3tt3ttagccagacttcaaaattattttatagcccaaattataacatctattgta5520ttttaacatatagagctatttctactgatttttgcccttgttctgtcctt5580tttttca^aaaaga犯atgtgttttttgtttggtaccatagtgtgaaatgctgggaacaa5640tgact3t3agacatgctatggcacatatatttatagtctgtttatgtagaaacaaatgta5700gccttatatataatgaactttgtactattcacattttgtatcagtattat5760gtagcataacaaaggtcataatgctttcagcaattgatgtcattttattasagaacattg58203a^犯cttg35830〈210〉3<211〉24〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>3caaactttcactagggctcttcgt24〈210〉4〈211〉22〈212>腿〈213>人工合成〈400〉4agccacaagggagaagcggata22〈210>5<211>28〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉5tgaggttaaaagttctggtgtccctgtt28〈210〉6〈211〉30<212>腿〈213〉人工合成〈400〉6aaatgtacaatccttggtcactccggggta30〈210>7<211>23〈212〉■〈213>人工合成<400>7cctcctgtatcctgaatgaatct23〈210〉8〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工合成<400〉8gcctcacatattattgtaccatcc2權(quán)利要求1.一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法，其特征在于該方法通過(guò)提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，測(cè)定受試者的KDR基因-604、1192、1719位點(diǎn)(分別是rs2071559、rs2305948、和rsl870377)的基因型，預(yù)測(cè)受試者對(duì)冠心病的易感性三個(gè)位點(diǎn)的危險(xiǎn)等位基因-604C，l醒，1719A，分別增加冠心病的風(fēng)險(xiǎn)為1.24，1.32，L38倍;同時(shí)具有的時(shí)候采用相乘的系數(shù)；同時(shí)具有3個(gè)危險(xiǎn)等位基因的受試者的冠心病易感性最高。2.—種分離核酸，具有序列表SEQIDNO.l和序列表SEQIDNo.2所示的堿基序列。3.—組預(yù)測(cè)冠心病易感性的引物，能特異性地?cái)U(kuò)增出含KDR基因的-604、1192、1719位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，具有序列表SEQIDNO.3至SEQIDNO.8所示的堿基序列。4.一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求3所述的引物序列和以下試劑，包括60ul10XPCR緩沖液，50ullOmMdNTP混合液，2unit/ul10ulTaqDNA聚合酶，各50pmol/ul12ulF1和R1引物，1.5ml純水，20ulIOX限制酶反應(yīng)緩沖液，10ul(10unit/ul)限制酶;本試劑盒供10人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。全文摘要本發(fā)明公開了一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法，通過(guò)提取宿主細(xì)胞基因組DNA，測(cè)定受試者的KDR基因多態(tài)性-604、1192、1719位點(diǎn)(分別是rs2071559、rs2305948、和rs1870377)的基因型，預(yù)測(cè)受試者對(duì)冠心病的易感性KDR基因型為T/T純合子時(shí)，受試者的易感性最低；三個(gè)位點(diǎn)的危險(xiǎn)等位基因-604C，1192A，1719A，分別增加冠心病的風(fēng)險(xiǎn)為1.24，1.32，1.38倍。同時(shí)具有的時(shí)候采用相乘的系數(shù)。同時(shí)具有3個(gè)危險(xiǎn)等位基因的受試者的冠心病易感性最高。本發(fā)明中KDR基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)具有SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核酸序列的3個(gè)位點(diǎn)，是與冠心病發(fā)病相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)之一。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是首次闡明了KDR基因多態(tài)性位點(diǎn)與冠心病的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法，該方法可用于冠心病的預(yù)防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發(fā)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101121947SQ20071011952公開日2008年2月13日申請(qǐng)日期2007年7月25日優(yōu)先權(quán)日2007年7月25日發(fā)明者杰劉,宋曉東,宇張,張偉麗,張禪那,惠汝太,樊曉寒,汪一波,芳羅,翼鄭申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院