專利名稱：一種生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境修復(fù)技術(shù)，特別涉及一種生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生 物修復(fù)方法。
背景技術(shù)：
石油污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)根據(jù)具體操作以及菌種的來源可以分為自然 衰減法、生物剌激法和生物強(qiáng)化法。自然衰減和生物刺激對(duì)污染物降解效率低， 且易產(chǎn)生遷移性能更強(qiáng)的中間代謝產(chǎn)物，因此應(yīng)用越來越少。通過微生物操作篩 選能夠高效降解石油烴污染物的微生物，并作為外源高效菌種添加到污染土壤 中，降解轉(zhuǎn)化石油烴污染物的方法，即為生物強(qiáng)化法。
理論上生物強(qiáng)化修復(fù)技術(shù)可以通過添加外來高效石油烴降解菌來實(shí)現(xiàn)石油 烴的高效去除。但由于石油烴組成復(fù)雜，毒性強(qiáng)，且其生物可利用度較低等原因， 使得原位生物強(qiáng)化修復(fù)的效率低。同時(shí)，外加菌種受生態(tài)系統(tǒng)中環(huán)境因素的復(fù)雜 性和波動(dòng)性的沖擊，接種微生物生物數(shù)量和活性迅速降低至無法達(dá)到預(yù)期目標(biāo)； 換言之，外源微生物的生存能力、活性和遷移能力與環(huán)境因素之間的關(guān)系直接決 定著生物強(qiáng)化修復(fù)的治理效果。制約生物強(qiáng)化修復(fù)技術(shù)發(fā)展的主要生態(tài)原因有生 物因素和非生物因素兩種。多數(shù)非生物因素可通過工程措施，如調(diào)控土壤含水量、 .PH，添加有機(jī)碳源和無機(jī)營養(yǎng)物等進(jìn)行調(diào)控；在生物強(qiáng)化修復(fù)過程中，受土壤多 相復(fù)雜結(jié)構(gòu)的限制，外源微生物在土壤中遷移困難，造成微生物無法與污染物有 效接觸并攝取污染物，微生物對(duì)污染物攝取困難是原位生物修復(fù)的一個(gè)瓶頸。
Drake EN公開了一種石油烴污染治理過程中的營養(yǎng)物質(zhì)可控釋放技術(shù)，其營 養(yǎng)物質(zhì)的釋放速率等于滿足石油烴降解菌的生長底物的消耗速率(EP748304-A; W09508523-A; W09508523-Al)，通過該技術(shù)可以保證石油烴降解菌在污染土壤中 的持續(xù)積累，抵抗污染環(huán)境中由于營養(yǎng)限制造成的微生物活性不足。但該方法造 價(jià)較高，而且過程復(fù)雜。同時(shí)，有研究利用化學(xué)合成表面活性劑來活化污染土壤 中的石油烴，促進(jìn)微生物對(duì)石油烴的攝取，但化學(xué)合成表面活性劑破壞土壤團(tuán)粒
結(jié)構(gòu)，容易對(duì)環(huán)境造成二次污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)制約原位生物修復(fù)的主要生態(tài)原因而提供一種利用生 物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方法。其特征在于
1. 通過生物質(zhì)在土壤中轉(zhuǎn)化形成的中間代謝產(chǎn)物，可以促進(jìn)石油烴降解菌在 污染土壤中的快速生長；所述中間代謝產(chǎn)物是生物質(zhì)經(jīng)過生物質(zhì)降解菌轉(zhuǎn)化得到 的部分糖類物質(zhì)。利用糖類物質(zhì)可以促進(jìn)石油烴降解復(fù)合菌劑的生長， 一是積累 足夠的微生物活性，另外可以產(chǎn)生生物表面活性劑活化土壤中的污染物，從而克 服由于非生物因素造成的制約原位生物修復(fù)的生態(tài)原因。這也是石油烴降解復(fù)合 菌劑中含有可高效產(chǎn)生生物表面活性劑菌株的原因。
2. 向污染土壤中添加石油烴降解復(fù)合菌劑，該石油烴降解復(fù)合菌劑中含有高 效產(chǎn)生生物表面活性劑的菌屬，糖類物質(zhì)促進(jìn)該類菌屬生長的同時(shí)，產(chǎn)生大量的 生物表面活性劑，活化污染土壤中的石油烴污染物，促進(jìn)微生物對(duì)石油烴污染物 的接觸以及攝取，抵抗由于生物因素造成的制約原位生物修復(fù)的生態(tài)原因。
該方法實(shí)施步驟包括
1) 向生物質(zhì)中施加生物質(zhì)降解菌；
2) 在污染土壤表面均勻施灑生物質(zhì)；
3) 機(jī)械翻耕，翻耕深度為25 50cm，使生物質(zhì)與污染土壤充分混勻；
4) 向污染土壤中施加水分，保持土壤含水量為15 25%左右；
5) 在機(jī)械翻耕后20 40天，施加石油烴降解復(fù)合菌劑進(jìn)行石油烴的生物降
解；
6) 當(dāng)污染土壤石油烴濃度低于1.0%時(shí)，種植植物進(jìn)一步進(jìn)行原位生物修復(fù)。 所述生物質(zhì)主要包括農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的廢棄秸稈以及含有木質(zhì)素和纖維素的
生物質(zhì)的木屑，其生物質(zhì)添加量占污染土壤體積的3% 20%。
所述生物質(zhì)降解菌由真菌和細(xì)菌構(gòu)成。細(xì)菌為具有纖維素降解能力的細(xì)菌-如熱厭氧桿菌屬(r/ er膨朋serofe"er)(胡國全等，2004);生孢噬纖維菌 (5^rocWoMs卵)(于珊珊等，2006);假單胞菌屬(/^ewofe膨/ as印.)(JoC等，2004)等，細(xì)菌添加量為10S 1(TCFU/Kg生物質(zhì)；真菌為白腐真菌、木霉屬、曲 霉屬等，如來自白腐真菌的黃孢原毛平革菌(外朋eroc力犯te c力2TS0砂0T7'鵬)， 來自木霉屬的綠色木霉(7Wc/ c^6Lrm3 w'77'ofe)、里氏木霉(7Wc力c)ofer鵬reeae力、 康氏木霉(r—ric力oc/erffls Ao/7//^h')等，來自曲霉屬的灰綠曲霉U印ei^777〃s ^ZswciAS)、 黑曲霉C^jOerg7'2〗ws ;i/ger)、米曲霉G45peiX27〗i/s terrew51)等(上 述菌種均可購自中國普通微生物菌種保藏中心)。添加量為20 100mgbiomass/Kg 生物質(zhì)。
所述石油烴降解復(fù)合菌劑為至少含具有石油烴降解能力的細(xì)菌或真菌。 所述具有石油經(jīng)降解能力的細(xì)菌選自假單胞菌屬(NewcombeDA， 1999)、 紅球菌屬(Yu B， 2006)、微球菌屬(Torres LG, 2005)、腸桿菌屬(Katsivela E， 2005)、棒狀桿菌屬(Rahman KSM， 2002)、黃質(zhì)菌屬(Rahman KSM， 2002) 和芽孢桿菌屬(DasK， 2007)(以上相關(guān)菌種均可購于中國普通微生物菌種保藏 中心)。
所述具有石油烴降解能力的真菌為黃孢原毛平革菌(/^朋erocAade c力JT6"os，oz7'腦)和刺孢小克銀漢霉菌(Oy/7mV^Ag膨Ws)中的一種(以上菌種 均可購自中國普通微生物菌種保藏中心購得)。
所述石油烴降解復(fù)合菌劑至少含有一種可以高效產(chǎn)生生物表面活性劑的微 生物，該微生物來源于假單胞菌屬(Raza ZA， 2007; Das K， 2007)、紅球菌屬 (Pizzul L， 2006)、微球菌屬(Das M, 1998)、黃質(zhì)菌屬(Bodour AA， 2004)、 腸桿菌屬(Haba E， 2003)、棒狀桿菌屬(Crosman JT, 2002)和芽孢桿菌(Das K， 2007〉(以上相關(guān)菌種均可從中國普通微生物菌種保藏中心獲得)。
所述生物質(zhì)降解菌，細(xì)菌添加量優(yōu)選為108 10|2個(gè)/&生物質(zhì)，真菌添加量 優(yōu)選為20 100mg/Kg生物質(zhì);所述石油烴降解復(fù)合菌劑中細(xì)菌施加量為108 10'2 個(gè)/m，井地，真菌施加量為20 150mg/m，井地。
本發(fā)明的有益效果是所使用的添加劑為廉價(jià)的生物質(zhì)類物質(zhì)，主要包括農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)廢棄的秸稈等以及含有木質(zhì)素和纖維素的生物質(zhì)，如木屑等。生物質(zhì)添加 后，可以作為石油烴降解菌生長的載體促進(jìn)微生物的快速積累。同時(shí)利用生物質(zhì)
在土壤中轉(zhuǎn)化形成的少量糖類物質(zhì)，可以作為石油烴降解菌的優(yōu)先碳源，進(jìn)一歩
促進(jìn)石油烴降解復(fù)合菌劑的生物積累；石油降解復(fù)合菌劑中含有的高效生物表面 活性劑產(chǎn)生菌，可以產(chǎn)生大量的生物表面活性劑，活化土壤中的污染物，促進(jìn)微 生物對(duì)污染物的攝取。本方法可以有效克服制約原位生物修復(fù)技術(shù)的生態(tài)原因， 促進(jìn)石油烴的原位生物修復(fù)。本方法在大面積的石油烴污染土壤的原位生物修復(fù) 過程中具有很好的應(yīng)用前景。


圖1為添加5X麥秸40h后污染土壤中的細(xì)菌生物量。 圖2為添加5%麥秸40h后污染土壤中的真菌生物量。 圖3為添加5%麥秸40h后污染土壤中的石油烴降解率。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明的應(yīng)用效果，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例
實(shí)施例中石油污染土壤含油3. 75%。實(shí)施過程如下
1) 首先將麥秸與預(yù)培養(yǎng)的黃孢原毛平革菌和銅綠假單胞菌混合均勻，黃孢 原毛平革菌的添加量為50mg/Kg麥秸，銅綠假單胞菌添加量為10"'CFU/Kg麥秸；
2) 石油污染土壤盛在盆中，深約25cni。將混有黃孢原毛平革菌的麥秸與石 油污染土壤充分混勻，麥秸添加量為土壤體積的5%;保持含水量15 25% 30 天；
3) 施加由陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌以及刺孢小克銀漢霉菌組成的石油烴 降解復(fù)合菌劑，其中銅綠假單胞菌為高效產(chǎn)生物表面活性劑菌種。細(xì)菌添加量為 1(TCFU/W土壤，真菌為50mg千重/V土壤。
在實(shí)施例中，生物質(zhì)降解菌由真菌黃孢原貌平革菌和銅綠假單胞菌組成。石
油烴降解菌為細(xì)菌和真菌組成的微生物菌劑。
實(shí)施例中的生物質(zhì)為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廢棄的小麥麥秸，添加量為5%。 實(shí)施例中，細(xì)菌利用LB培養(yǎng)基30°C， 150rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，收集培養(yǎng)物。
真菌利用馬鈴薯液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，30"C， 150rpm振蕩培養(yǎng)3天，收集培養(yǎng)物備用。
實(shí)施例中細(xì)菌生物量通過平板計(jì)數(shù)法測量，真菌生物量以麥角固醇的含量表
征(Ipsilantis I， 2007)。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1、 2、 3所示。
本發(fā)明己參照較優(yōu)實(shí)施方案作了描述，熟悉上述詳細(xì)描述的本領(lǐng)域的技術(shù)人 員可以作出許多變動(dòng)和替換，其均包含在本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)內(nèi)容中。
權(quán)利要求
1.一種利用生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方法，其特征在于，該方法包括(1)通過生物質(zhì)在土壤中轉(zhuǎn)化形成的中間代謝產(chǎn)物，可以促進(jìn)石油烴降解復(fù)合菌劑在污染土壤中的快速生長，克服由于非生物因素造成的制約原位生物修復(fù)的生態(tài)原因；(2)在污染土壤中添加石油烴降解復(fù)合菌劑，該石油降解復(fù)合菌劑中含有高效產(chǎn)生生物表面活性劑的菌屬，同時(shí)(1)中的中間代謝產(chǎn)物是生物質(zhì)經(jīng)過生物質(zhì)降解菌轉(zhuǎn)化得到的部分糖類物質(zhì)，利用糖類物質(zhì)可以促進(jìn)石油烴降解復(fù)合菌劑的生長，復(fù)合菌劑中所含的高效產(chǎn)生生物表面活性劑的微生物在生長的同時(shí)，產(chǎn)生大量的生物表面活性劑，活化污染土壤中的石油烴污染物，促進(jìn)微生物對(duì)石油烴污染物的攝取，抵抗由于生物因素造成的制約原位生物修復(fù)的生態(tài)原因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方法，其特征在于，該方法實(shí)施步驟包括1) 向生物質(zhì)中施加生物質(zhì)降解菌；2) 在污染土壤表面均勻施灑生物質(zhì)；3) 機(jī)械翻耕，使生物質(zhì)與污染土壤充分混勻；4) 向污染土壤中施加水分，保持土壤含水量為15 25%左右；5) 在機(jī)械翻耕后20 40天，施加石油烴降解復(fù)合菌劑對(duì)石油烴進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化；6) 當(dāng)污染土壤石油烴濃度低于1. 0%時(shí)，種植植物進(jìn)一步進(jìn)行原位生物倏復(fù)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方法， 其特征在于，所述的生物質(zhì)降解菌由細(xì)菌和真菌組成，細(xì)菌為具有纖維素降解能 力的細(xì)菌熱厭氧桿菌屬(77 e27Z70S77aero^"er)、 生孢噬纖維菌 (5^orocj^opA3^3)、假單胞菌屬(/^e"ob歷o/ as )，細(xì)菌添加量為105 10")CFU/Kg生物質(zhì)；真菌為白腐真菌、木霉屬或曲霉屬，來自白腐真菌的黃孢原 毛平革菌(尸力朋e/^c力a"e cAr"c^/ Qrj'鵬)；來自木霉屬的綠色木霉(7rj'c力oflfe77Z7s Kin'ofe)、里氏木霧(7>ic/ 。ofezm3 reeaej')、康氏木霧(7>\z'c/ 。Gfe77a3 A(9/7i/7^/j'); 來自曲霉屬的灰綠曲霉(Jsperp'Wt/s ^/auc"s)、黑曲霉(y4s/ ei^j'j>er)、 米曲霉(Aspe/^7'"〃s tarrews)，添加量為20 100mgbiomass/Kg生物質(zhì)；上述 菌種均可購自中國普通微生物菌種保藏中心。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方法， 其特征在于，所述生物質(zhì)主要包括農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的廢棄秸稈以及含有木質(zhì)素和纖 維素的生物質(zhì)的木屑，其生物質(zhì)添加量占污染土壤體積的3% 20%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方法， 其特征在于，所述石油烴降解復(fù)合菌劑為至少含具有石油烴降解能力的細(xì)菌或真 菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述利用生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方法， 其特征在于，所述具有石油烴降解能力的細(xì)菌選自假單胞菌屬(NewcombeDA， 1999)、紅球菌屬(YuB， 2006)、微球菌屬(Torres LG， 2005)、腸桿菌屬(Katsivela E， 2005)、棒狀桿菌屬(Rahman KSM， 2002)、黃質(zhì)菌屬(Rahman KSM， 2002) 和芽孢桿菌屬(DasK， 2007)，以上相關(guān)菌種均可購于中國普通微生物菌種保藏 中心。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述利用生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方法， 其特征在于，所述具有石油烴降解能力的真菌為黃孢原毛平革菌(州a/^7Y^A3e" C力7TS0邵02^//^購自中國普通微生物菌種保藏中心)和刺孢小克銀漢霉菌(Cunninghamella) f實(shí)驗(yàn)室從中原油田石油污染土壤中篩選得到)中的一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方法， 其特征在于，所述石油烴降解復(fù)合菌劑至少含有一種可以高效產(chǎn)生生物表面活性 劑的微生物，該微生物來源于假單胞菌屬(Raza ZA， 2007; Das K， 2007)、紅 球菌屬(PizzulL， 2006)、微球菌屬(DasM， 1998)、黃質(zhì)菌屬(Bodour AA， 2004)、 腸桿菌屬(Haba E， 2003)、棒狀桿菌屬(Crosman JT， 2002)和芽孢桿菌(Das K, 2007)(以上相關(guān)菌種均可從中國普通微生物菌種保藏中心獲得)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方法，其特征在于，所述生物質(zhì)降解菌，細(xì)菌添加量為108 1012個(gè)/&生物質(zhì)，真菌添 加量為20 100mg/Kg生物質(zhì);所述石油烴降解復(fù)合菌劑中細(xì)菌施加量為108 1012 個(gè)/m，井地，真菌施加量為20 150mg/V耕地。
10. 按照權(quán)利要求1所述的一種生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方 法，其特征在于所述種植植物根據(jù)地域不同有所區(qū)別，但至少是苜蓿、小麥、 稻谷中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于環(huán)境修復(fù)技術(shù)的一種生物質(zhì)強(qiáng)化石油污染土壤的原位生物修復(fù)方法。該方法利用添加了生物質(zhì)降解菌的生物質(zhì)來促進(jìn)污染土壤中生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。利用生物質(zhì)在土壤中轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物作為石油烴降解復(fù)合菌劑的優(yōu)先碳源，促進(jìn)石油烴降解復(fù)合菌劑的生物積累；同時(shí)施加的石油烴降解復(fù)合菌劑中含有可高效產(chǎn)生生物表面活性劑的菌，該菌在生長的同時(shí)產(chǎn)生大量的生物表面活性劑，活化污染土壤中的石油烴污染物，提高其生物可利用度，促進(jìn)了石油烴降解復(fù)合菌劑對(duì)污染物的生物轉(zhuǎn)化效率。生物質(zhì)在土壤中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物腐殖質(zhì)又可以改善土壤的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)、增加土壤的肥力，使得污染土壤得以修復(fù)。方法簡便易行，便于操作，易于推廣。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101104177SQ200710119860
公開日2008年1月16日 申請(qǐng)日期2007年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月1日
發(fā)明者錚 劉, 坤 張, 張敏蓮, 徐圓圓, 花秀夫 申請(qǐng)人:中國石油化工股份有限公司;清華大學(xué)