專利名稱：：一種檢測脂肪酶活力抑制率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測方法，特別涉及一種檢測脂肪酶活力抑制率的方法。
背景技術(shù)：
：脂肪酶活力的測定方法很多，包括酸堿滴定法、電位滴定法、濁度測定法和分光光度法等。但上述方法操作繁瑣，受檢測樣品純度影響檢測誤差較大。目前脂肪酶活力還沒有一種統(tǒng)一的檢測方法，各生產(chǎn)廠家和科研部門通常根據(jù)自己的實驗條件和實際情況以及各自所制備的脂肪酶的特性來制定出各自的產(chǎn)品檢測方法。對于利用脂肪酶進(jìn)行的科研和工業(yè)生產(chǎn)，其活力是一個非常重要的指標(biāo)，因此確定活力檢測的精確性和可比性十分重要。檢測脂肪酶活力抑制率的常規(guī)方法是先測定脂肪酶活力，再測定加入抑制劑后脂肪酶活力減少的量，從而計算抑制劑對脂肪酶活力的抑制率。對于利用橄欖油作為測活底物的檢測方法，常用的檢測手段為酸堿滴定。也有根據(jù)脂肪酸和銅離子形成銅皂的原理利用分光光度法進(jìn)行脂肪酶活力的檢測，銅皂在715nm附近有一寬的吸收峰，由于實驗中使用大量苯進(jìn)行銅皂的萃取，容易造成污染和對人體造成傷害，因此該方法不適合檢測大量樣品，使用的人很少。在酸堿滴定的方法中，可以直接進(jìn)行滴定，也可以先用疏水有機(jī)溶劑抽提脂肪酸進(jìn)行滴定。直接滴定法一般用于純酶的測定，不適合含有大量雜質(zhì)的樣品測定，該法的缺點是反應(yīng)體系中存在緩沖液的緩沖作用和反應(yīng)終止不完全，從而造成測定結(jié)果的不穩(wěn)定。用疏水有機(jī)溶劑抽提脂肪酸再進(jìn)行滴定，不但操作繁瑣，而且對于成分復(fù)雜的樣品，如果抽提過程中有乳化現(xiàn)象，會降低脂肪酸的回收率，也會造成測定誤差。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于公開一種檢測脂肪酶活力抑制率的方法。本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明所述的檢測脂肪酶活力抑制率的方法包括如下步驟A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳化液及測定酶液三羥甲基氨基甲垸緩沖液制備取三羥甲基氨基甲烷3-4重量份，用0.lmol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至7.5-9.5，加水至400-600體積份，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至7.5-9.5，定容至400-600體積份；橄欖油乳化液的制備:取橄欖油10-15體積份與阿拉伯樹膠20-25重量份，研磨均勻，加水研磨至200-400體積份，用18000轉(zhuǎn)/min的勻質(zhì)機(jī)乳化1-3次，每次2-4分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢查，90%乳粒的直徑在3Mm以下，并不得有10Wn的乳粒，即可；牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽5-IO重量份，置于50ml燒杯中，以水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容；氫氧化鈉溶液的制備精密稱取氫氧化鈉1-3重量份，加水溶解定容至500重量份；脂肪酶溶液的制備精密稱取標(biāo)準(zhǔn)脂肪酶于容量瓶中，用冷卻至5'C以下的三羥甲基氨基甲烷緩沖液溶解，制成每lml中含胰脂肪酶10200活力單位的溶液，作為酶原液備用；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，將酶原液用三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋至不同濃度梯度的測定酶液；0U/ml的測定酶液是在水浴中煮沸15-30分鐘的酶原液，也可以用三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替；B.建立脂肪酶測活體系1.空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液20-30重量份、牛膽鹽溶液1-3重量份與水5-15重量份，置100ml三角瓶中，加空白溶液1-3重量份，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8-10，空白溶液是水、乙醇或其它溶劑；2.樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液20-30重量份、牛膽鹽溶液1-3重量份與水5-15重量份，置100ml三角瓶中，加樣品溶液1-3重量份，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8-10，樣品溶液是用相應(yīng)的空白溶液溶解或提取的具有潛在的抑制脂肪酶活力的物質(zhì)的測定溶液；C.繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線-繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，先將不同梯度的測定酶液換算成對應(yīng)的抑制率，抑制率換算公式Y(jié)(%)=(Xo-Xn)/XoY(%)—表示脂肪酶抑制率X。一表示酶原液濃度(U/ml)Xn—表示不同稀釋度的酶液濃度(U/ml);設(shè)定酶濃度為零時，抑制率為100%;設(shè)定酶原液濃度的抑制率為0，將酶原液按一定梯度稀釋成90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ral、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液，則對應(yīng)的抑制率Y9d分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%;空白酶液(OU/ml)是在水浴中煮沸15-30分鐘的酶原液或是用三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法將上述空白溶液脂肪酶測活體系在35-4(TC水浴中保溫5-15分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8-10;精密量取上述不同濃度梯度的測定酶液1體積份，分別加至空白溶液測活體系中，在35-40"C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2-30分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算反應(yīng)前后的pH差值；用酶濃度為100U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，分別減去酶濃度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml、0U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，即得到對應(yīng)不同抑制率的pH變化幅度"ApH"值；以抑制率"Y%"為縱坐標(biāo)，"ApH"值為橫坐標(biāo)，繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到相應(yīng)空白溶液的抑制率計算公式；D.測定方法及樣品溶液脂肪酶抑制率空白溶液測定將空白溶液脂肪酶測活體系在35-4(TC水浴中保溫5-15分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8-10;精密量取酶原液1體積份加至空白溶液測活體系中，在35-4(TC水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2-30分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算空白溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為A1;另取在水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液1體積份，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為AO;則空白溶液酶反應(yīng)的pH變化值為AA二Al-AO;樣品溶液測定將樣品溶液脂肪酶測活體系在35-4(TC水浴中保溫5-15分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8-10;精密量取酶原液1體積份加至樣品溶液測活體系中，在35-4(TC水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2-30分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算樣品溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為Bl;另取在水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液1體積份，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為BO;則樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值為AB二Bl-BO;樣品溶液脂肪酶抑制率用空白溶液酶反應(yīng)的PH變化值"AA"減去樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值"AB"，得到空白溶液與樣品溶液酶反應(yīng)的"△pH"值，即ApH二AA—AB，將此"ApH"值代入相應(yīng)的空白溶液脂肪酶抑制率計算公式，即得測定樣品的脂肪酶抑制率。本發(fā)明所述的檢測脂肪酶活力抑制率的方法中A、B、C和/或D步驟優(yōu)選如下步驟A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳化液及測定酶液三羥甲基氨基甲烷緩沖液制備取三羥甲基氨基甲烷3.030重量份，用0.lmol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至8.0，加水至450-480體積份，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至8.0，再定容至500體積份；橄欖油乳化液的制備取橄欖油12體積份與阿拉伯樹膠22.5重量份，研磨均勻，加水研磨至300體積份，用18000轉(zhuǎn)/min的勻質(zhì)機(jī)乳化2次，每次3分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢查，90%乳粒的直徑在3Mm以下，并不得有10Mm的乳粒，即可；牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽8.0重量份，置于50ml燒杯中，以水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容；氫氧化鈉溶液的制備精密稱取氫氧化鈉2.000重量份，加水溶解定容至500ml;脂肪酶溶液的制備精密稱取SIGMA:L3126胰脂肪酶于容量瓶中，用冷卻至5'C以下的三羥甲基氨基甲烷緩沖液溶解，制成每lml中含胰脂肪酶IOO活力單位的溶液，作為酶原液備用；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，將酶原液用三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋至梯度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液；OU/ml的測定酶液是在水浴中煮沸20分鐘的酶原液；B.建立脂肪酶測活體系1.空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25體積份、牛膽鹽溶液2體積份與水10體積份，置100ml三角瓶中，加水2體積份，用O.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;2.樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25體積份、牛膽鹽溶液2體積份與水10體積份，置100ml三角瓶中，加樣品溶液2體積份，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，樣品溶液是用相應(yīng)的空白溶液溶解或提取的具有潛在的抑制脂肪酶活力的物質(zhì)的測定溶液；C.繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，先將不同梯度的測定酶液換算成對應(yīng)的抑制率，抑制率換算公式Y(jié)(%)二(Xo-Xn)/X。Y(%)—表示脂肪酶抑制率Xo—表示酶原液濃度(U/ml)Xn—表示不同稀釋度的酶液濃度(U/ml)設(shè)定酶濃度為零時，抑制率為100%;設(shè)定酶原液濃度的抑制率為0，將酶原液按一定梯度稀釋成90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液，則對應(yīng)的脂肪酶抑制率Y96分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%;按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法將上述空白溶液脂肪酶測活體系在37'C水浴中保溫IO分鐘，用O.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取上述不同濃度梯度的測定酶液1體積份，分別加至空白溶液測活體系中，在37'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算反應(yīng)前后pH差值；用酶濃度為100U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，分別減去酶濃度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml、0U/ml時反應(yīng)前后的PH差值，即得到對應(yīng)不同抑制率的pH變化幅度"ApH"值；以抑制率為縱坐標(biāo)，"ApH"值為橫坐標(biāo)，繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到以水為空白溶液的脂肪酶抑制率計算公式丫％(抑制率)=104.34XApH-0.558R2=0.9969;D.測定方法及樣品脂肪酶抑制率空白溶液測定將空白溶液脂肪酶測活體系在37i:水浴中保溫IO分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液1體積份加至空白溶液測活體系中，在37t:水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值,并計算空白溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為Al;另取在水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液1體積份，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為A0;則空白溶液酶反應(yīng)pH變化值為AA二A1-A0;樣品溶液測定將樣品溶液脂肪酶測活體系在37i:水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液1體積份加至樣品溶液測活體系中，在37'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算樣品溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為Bl;另取在水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液1體積份，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為B0;則樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值為AB二B1-B0;樣品溶液脂肪酶抑制率用空白溶液酶反應(yīng)的PH變化值"AA"減去樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值"AB"，得到空白溶液與樣品溶液酶反應(yīng)的"△pH"值，即ApH-AA—AB，將此"ApH"值代入上述相應(yīng)空白溶液的脂肪酶抑制率計算公式，即得測定樣品的脂肪酶抑制率。本發(fā)明上述檢測方法中重量份/體積份是g/ml的關(guān)系。圖l:水為空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2:95%乙醇為空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3:丙酮為空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明的檢測方法是以脂肪酶活力為靶點，以對脂肪酶活力抑制程度為指標(biāo)，根據(jù)脂肪酶作用原理，在脂肪酶作用下，作為底物的脂肪被水解為甘油及游離脂肪酸，在底物過量的前提下，酶量越多，酶與底物油脂反應(yīng)產(chǎn)生的游離脂肪酸越多，反應(yīng)體系PH值下降幅度越大；本發(fā)明基于這一原理，發(fā)現(xiàn)酶反應(yīng)的pH值變化梯度與酶劑量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，從而建立了一種檢測脂肪酶抑制率的方法。此測定方法簡便、靈敏、可靠、靶點明確、機(jī)理清楚，可以用于大量篩選各種具有脂肪酶抑制作用的物質(zhì)，更進(jìn)一步地用于篩選和開發(fā)減肥降脂藥物。下面實驗例與實施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。實驗例l1.用本發(fā)明方法檢測陽性對照藥賽尼可(orlistat)對脂肪酶的抑制強(qiáng)度(抑制率)樣品賽尼可的制備取l粒賽尼可(orlistat)膠囊，將內(nèi)容物倒入12ml離心管中，加入95%乙醇溶液10ml，超聲提取20min，離心(4000rpm，20min)上清液，用0.45u濾膜過濾于100ml容量瓶中，沉淀再用同樣的乙醇溶液10ml超聲提取20min，離心(4000rpm，20min)上清液，過0.45y濾膜，與第一次過膜液合并于100ml容量瓶中，定容;配成每毫升含賽尼可1.2mg/ml的乙醇溶液，測定時再稀釋；A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳液及測定酶液三羥甲基氨基甲烷緩沖液制備取三羥甲基氨基甲烷3.030g，用0.1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至8.5，加水至450-480ml，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至8.5，定容至500ml;橄欖油乳化液的制備取橄欖油12ml與阿拉伯樹膠22.5g，研磨均勻，加水研磨至300ml，用18000轉(zhuǎn)/min的勻質(zhì)機(jī)乳化2次，每次3分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢查，90%乳粒的直徑在3^以下，并不得有10Wn的乳粒，即可；牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽8.0g，置于50ml燒杯中，以水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容；氫氧化鈉溶液的制備精密稱取氫氧化鈉2.000g，加水溶解定容至500ml;脂肪酶溶液的制備精密稱取SIGMA:L3126胰脂肪酶于容量瓶中，用冷卻至5'C以下的三羥甲基氨基甲垸緩沖液溶解，制成每lml中含胰脂肪酶IOO活力單位(U)的溶液，作為酶原液備用；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，將酶原液用三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋至梯度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液；0U/ml的測定酶液，即酶空白，是在水浴中煮沸20分鐘的酶原液，也可以用三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替；B.建立脂肪酶測活體系1).以95%乙醇為空白溶液的脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置100ml三角瓶中，加95%乙醇溶液lml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;2).樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置100ml三角瓶中，加樣品(orlistat)溶液lml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至9.0。C.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將上述以95%乙醇為空白溶液的脂肪酶測活體系在37。C水浴中保溫10分鐘，用O.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取上述不同濃度梯度的測定酶液lml，分別加至空白溶液測活體系中，在37'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算反應(yīng)前后pH差值；用酶濃度為100U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，分別減去酶濃度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml、0U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，即得到對應(yīng)不同抑制率的pH變化幅度"ApH"值；以抑制率為縱坐標(biāo)，"ApH"值為橫坐標(biāo)，繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到以95%乙醇為空白溶液的脂肪酶抑制率計算公式Y(jié)%(抑制率)=106.49XApH+0.4321R2=0.9991;D.測定方法及樣品溶液脂肪酶抑制率的測定空白溶液測定將95%乙醇空白溶液的脂肪酶測活體系在37'C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液lml加至空白溶液測活體系中，在37。C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算空白溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為A1;另取在水浴中煮沸20分鐘的上述酶原液lml，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為A0;則空白溶液酶反應(yīng)的pH變化值為AA二A1-AO;樣品溶液測定:將樣品溶液脂肪酶測活體系在37i:水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液lml加至樣品溶液測活體系中，在37"C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算樣品溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為B1;另取在水浴中煮沸20分鐘的上述酶原液lml，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為BO;則樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值為AB二B1-B0;樣品溶液脂肪酶抑制率的測定用空白溶液酶反應(yīng)的PH變化值減去樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值，得到空白溶液與樣品溶液酶反應(yīng)的"ApH"值，即ApH二AA—AB，將此"ApH"值代入上述以95%乙醇為空白溶液的脂肪酶抑制率計算公式，即得測定樣品的脂肪酶抑制率，結(jié)果見表l:表1本發(fā)明方法測定賽尼可溶液的脂肪酶抑制率樣品編號樣品濃度(ugorlistat/ml)ApH抑制率Ytt)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>2.酸堿滴定法檢測陽性對照藥賽尼可(orlistat)對脂肪酶的抑制強(qiáng)度(抑制率)樣品賽尼可的制備取1粒orlistat膠囊，將內(nèi)容物倒入12ml離心管中，加入95%乙醇溶液10ml，超聲提取20min，離心(4000rpm，20min)上清液，用0.45u濾膜過濾于100ml容量瓶中，沉淀再用同樣的乙醇溶液10ml超聲提取20min，離心(4000rpm，20min)上清液，過0.45u濾膜，與第一次過膜液合并于100ml容量瓶中，定容；配成每毫升含賽尼可1.2mg/ml的乙醇溶液，測定時再稀釋；A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳液及測定酶液三羥甲基氨基甲烷緩沖液制備取三羥甲基氨基甲烷3.030g，用0.1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至8.5，加水至450-480ml,搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至8.5，定容至500ml;橄欖油乳化液的制備取橄欖油12ml與阿拉伯樹膠22.5g，研磨均勻，加水研磨至300ml，用18000轉(zhuǎn)/min的勻質(zhì)機(jī)乳化2次，每次3分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢査，90%乳粒的直徑在3陶以下，并不得有IO陶的乳粒，即可;牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽8.0g，置于50ml燒杯中，以水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容；0.lmol/L氫氧化鈉溶液的制備精密稱取氫氧化鈉2.0g，加水溶解定容至500ml;脂肪酶溶液的制備精密稱取SIGMA:L3126胰脂肪酶于容量瓶中，用冷卻至5。C以下的三羥甲基氨基甲烷緩沖液溶解，制成每lml中含胰脂肪酶IOO活力單位的溶液，作為測定酶液備用；B.建立脂肪酶測活體系1).空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、89&牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置100ml三角瓶中，加95%乙醇溶液lml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;2).樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8y。牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置100ml三角瓶中，加樣品賽尼可溶液lml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;C.脂肪酶活力的測定及抑制率的測定1)空白溶液脂肪酶活力的測定將上述空白溶液脂肪酶測活體系在37'C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取上述測定酶液lml，在37。C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，加入95%乙醇30ml，加入2滴酚酞指示液，用0.lmol/L氫氧化鈉滴定液滴定至測活體系溶液變?yōu)榉凵?，記錄消耗O.lmol/L氫氧化鈉滴定液的量(ml)，記為A1;另取在水浴中煮沸15分鐘的測定酶液1ml，按照上述方法測定，作為酶空白對照，記錄消耗0.lmol/L氫氧化鈉滴定液的量(ml)，記為A0;2)樣品溶液脂肪酶活力的測定將上述樣品溶液脂肪酶測活體系在37。C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取上述測定酶液lml，在37。C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，加入95%乙醇30ml，加入2滴酚酞指示液，用0.lmol/L氫氧化鈉滴定液滴定至測活體系溶液變?yōu)榉凵?，記錄消耗O.lmol/L氫氧化鈉滴定液的量(ml)，記為B1;另取在水浴中煮沸15分鐘的測定酶液lml，按照上述方法測定，作為酶空白對照，消耗0.lmol/L氫氧化鈉滴定液的量(ml)，記為B0;3)測定樣品溶液脂肪酶抑制率的測定<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>賽尼可(orlistat)不同濃度溶液的測定結(jié)果見表2:表2酸堿滴定法測定賽尼可溶液的脂肪酶抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>3.本發(fā)明方法與酸堿滴定法比較兩種方法所測樣品的脂肪酶抑制率結(jié)果接近，但是，酸堿滴定法測定樣品l、樣品4和樣品5的結(jié)果顯然有些偏離；而且，本發(fā)明方法測定上述11個樣品比酸堿滴定法耗時少40分鐘，若檢測更多樣品則省時更多；結(jié)果表明，本方法適合檢測大量樣品，具有快速、可靠的優(yōu)點。實驗例2本發(fā)明檢測六十三種中草藥的水提取物和醇提取物對脂肪酶抑制作用實驗1、制備六十三種中草藥的水提取物或醇提取物水提取物制備取各單味中草藥飲片，預(yù)制，粉碎；加5體積倍的去離子水，煮沸30分鐘，用8層紗布過濾，或4000rpm/min離心，取上清液測定其脂肪酶抑制率；乙醇提取物制備取各單味中草藥飲片，預(yù)制，粉碎；加5體積倍的75%乙醇，超聲提取60分鐘，用8層紗布過濾，4000rpm/min或離心，取上清液測定其脂肪酶抑制率。2、脂肪酶活力抑制率的測定A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳液及測定酶液三羥甲基氨基甲烷緩沖液制備取三羥甲基氨基甲垸3.030g，用0.1mol/L鹽酸溶液調(diào)PH值至8.0，加水至450-480ml，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至8.0，定容至500ml;橄欖油乳化液的制備取橄欖油12ml與阿拉伯樹膠22.5g，研磨均勻，加水研磨至300ml，用18000轉(zhuǎn)/min的勻質(zhì)機(jī)乳化2次，每次3分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢査，90%乳粒的直徑在3陶以下，并不得有10Mm的乳粒，即可；牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽8.0g，置于50ml燒杯中，以水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容；0.1mol/L氫氧化鈉溶液的制備精密稱取氫氧化鈉2.000g，加水溶解定容至500ml;脂肪酶溶液的制備精密稱取SIGMA:L3126胰脂肪酶于容量瓶中，用冷卻至5'C以下的三羥甲基氨基甲烷緩沖液溶解，制成每lml中含胰脂肪酶IOO活力單位的溶液，作為酶原液備用；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，將酶原液用三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋至梯度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液；0U/ml的測定酶液，即酶空白，是在水浴中煮沸20分鐘的酶原液；B.建立脂肪酶測活體系1).水為樣品空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8%牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置100ml三角瓶中，加水2ml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;2).75%乙醇為樣品空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8%牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置100ml三角瓶中，力H75%乙醇溶液2ml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;3).樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8。/。牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置100ml三角瓶中，加六十三種中草藥的水提取物或醇提取物2ml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;C.繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，先將不同梯度的測定酶液換算成對應(yīng)的抑制率，抑制率換算公式Y(jié)(%)=(Xo-Xn)/XoY(%)—表示脂肪酶抑制率X。一表示酶原液濃度(U/ml)Xn—表示不同稀釋度的酶液濃度(U/ml);設(shè)定酶濃度為零時，抑制率為100%;設(shè)定酶原液濃度的抑制率為0，將酶原液按一定梯度稀釋成90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液，則對應(yīng)的抑制率Y。/o分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%;按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法如下標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法將上述水或75%乙醇空白溶液脂肪酶測活體系在37°C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取上述不同梯度濃度的測定酶液1體積份，分別加至空白溶液測活體系中，在37'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算反應(yīng)前后pH差值；用酶濃度為100U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，分別減去酶濃度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml、0U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，即得到對應(yīng)不同抑制率的pH變化幅度"ApH"值；以抑制率為縱坐標(biāo)，"ApH"值為橫坐標(biāo)，繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到水或75%為空白樣品溶液的脂肪酶抑制率計算公式；D.測定方法及樣品溶液脂肪酶抑制率的測定空白溶液測定將上述水或75%乙醇空白溶液脂肪酶測活體系在37。C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液lml加至空白溶液測活體系中，在37"C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算空白溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為A1;另取在水浴中煮沸20分鐘的上述酶原液lml，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為AO;則空白溶液酶反應(yīng)的pH變化值為AA二A1-A0;樣品溶液測定:將樣品溶液脂肪酶測活體系在37。C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液1體積份加至樣品溶液測活體系中，在37'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算樣品溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為B1;另取在水浴中煮沸20分鐘的上述酶原液lml，照上述方法測定作酶空白對照，pH差值記為BO;則樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值為AB二B1-B0;測定樣品溶液的脂肪酶抑制率的測定用空白溶液酶反應(yīng)的pH變化值(△A)減去樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值(AB)，即得到空白溶液與樣品溶液酶反應(yīng)的"ApH"值，即ApH二AA—AB，將此"ApH"值代入上述相應(yīng)的空白溶液的脂肪酶抑制率計算公式，即得測定樣品的脂肪酶抑制率，結(jié)果見表3:表3六十三種中草藥對脂肪酶活力抑制率序號中草藥名稱對脂肪酶抑制率(%)對脂肪酶抑制強(qiáng)度水提液醇提液水提液醇提液1黃芩90.276.7+++++++2普洱茶74.665,2++++++3烏龍茶73.599.6+++++++4鐵觀音茶72.5100.7+++++++5苦丁茶30.752.7+++6紅茶34.998.6+++++7綠茶64.168.3++++++8大黃1.588.1—++++9甘草0.579.8_+++10代代花66.263.1++++++11紅花51.637.0+++12花椒31.845.4+++13蘆薈48.562,0+++++14虎杖10.973.5++++15番瀉葉34.961.0++++16枸杞子62.0-0,6+++—17荷葉49.5-2.6++_18葛根44.367.3+++++19桔梗46.41.5++一20丹參48.536.0+++21白術(shù)37.046.4+++22桃花46.438.0+++23羅布麻21.433.9++24菊花19.343.3+++25凌霄花44.339.1+++26川芎2.669.3—+++27茉莉花62.070.4++++++28木蝴蝶47.437.0+++29葡萄籽33.963.1++++30木瓜-1.664,1+++31金蓮花48.563.1+++32雞血藤8.861.0—+++33丁香15,157.9+++34金銀花32.851.6+++35厚樸_3.755.8一++36白薇34.944.3+++37丹皮_0.652.7-++38苦參38.052.7+++39絞股藍(lán)0.553.7一++40水皂角34.956.8+++41艾葉39.150.6+++42姜黃-5.831.8+43人參34.946.4++44槐米32.840.1+++45金蕎麥46.434.9+++46澤瀉30.743.3+++47枳殼32.845.4+++48枳實40.133.9+++49牛膝30,731.8++50坷子51.642.2++++51首烏藤29.751.6+++52木香21.444.3+++53銀杏葉17.242.2+++54羌活9.940.1一++55何首烏5.738.0一+56貫眾32.841.2+++57杜仲23.439.1++58生蒲黃48.538.0+++59檳榔8.844.3一++60瓜蔞24.545.4+++61桂枝0,537.0一+62桑葉25.546.4+++63桑白皮27.639.1++"+"的多少代表對脂肪酶抑制的強(qiáng)弱，"+"越多表示對脂肪酶的抑制越強(qiáng)。實驗例31.脂肪酶抑制率與pH變化梯度關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳液及測定酶液三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液制備取三羥甲基氨基甲烷3.030g，用O.lmol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至8.5，加水至450_480ml，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至8.5，定容至500ml;橄欖油乳化液的制備取橄欖油12ml與阿拉伯樹膠22.50g，研磨均勻，緩緩加水研磨使成300ml，用勻質(zhì)機(jī)(Heidlph)乳化，18000轉(zhuǎn)/min，乳化2次，每次3分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢查，90%乳粒的直徑應(yīng)在3Mm以下，并不得有l(wèi)OWn的乳粒；8%牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽8.OOg，置于50ml燒杯中，以蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至lOOml容量瓶中，定容；0.lmol/L氫氧化鈉溶液精密稱取氫氧化鈉2.000g，加水溶解定容至500ml;脂肪酶溶液的制備精密稱取SIGMA:L3126胰脂肪酶59.2mg，于50ml容量瓶中，加冷至5。C以下的三羥甲基氨基甲垸緩沖液，溶解，加三羥甲基氨基甲烷緩沖液定容至50ml，制成每lml中含胰脂肪酶100活力單位的溶液；測定酶液的準(zhǔn)備按表4制備表4測定標(biāo)準(zhǔn)酶液的準(zhǔn)備<table>tableseeoriginaldocumentpage290</column></row><table>B.建立空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8%牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置100ml三角瓶中，加空白溶液lml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0,空白溶液是水、乙醇或其它溶劑；C.繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，先將不同梯度的測定酶液換算成對應(yīng)的抑制率，抑制率換算公式Y(jié)(%)=(XfXn)/XoY(%)—表示脂肪酶抑制率X。一表示酶原液濃度(U/ml)Xn—表示不同稀釋度的酶液濃度(U/ml)設(shè)定酶濃度為零時,抑制率為100%;設(shè)定酶原液濃度的抑制率為0，見表5:表5脂肪酶酶量與抑制率換算關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法如下將上述空白溶液脂肪酶測活體系在37t:水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取上述不同梯度濃度的測定酶液lml，分別加至空白溶液測活體系中，在37'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算反應(yīng)前后的pH差值；用酶濃度為100U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，分別減去不同濃度梯度的測定酶液反應(yīng)前后的pH差值，即得到對應(yīng)不同抑制率的pH變化幅度"ApH"值，結(jié)果見表6、7、8:表6以水為空白樣品的測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表7以95%乙醇為空白樣品的測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表8以丙酮為空白樣品的觀!j定結(jié)果實驗編號酶加量(U)抑制率Y(%)△pH010000.00i90100.06280200.14370300.22460400.31550500.42640600.49730700.57820800.66910900.781001000.88以抑制率Y。/。為縱坐標(biāo)，"ApH"值為橫坐標(biāo)，繪制脂肪酶抑制率"Yo/。"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到抑制率計算公式，見圖l、圖2、圖3;2.檢測陽性對照藥賽尼可(orlistat)對脂肪酶的抑制強(qiáng)度(抑制率)樣品(orlistat)的制備取1粒orlistat膠囊，將內(nèi)容物倒入12ml離心管中，加入95%乙醇溶液10ml，超聲提取20min，離心(4000rpm，20min)上清液，用0.45u濾膜過濾于100ml容量瓶中，沉淀再用同樣的乙醇溶液10ml超聲提取20min，離心(4000rpm，20min)上清液，過O.45u濾膜，與第一次過膜液合并于100ml容量瓶中，定容；配成每毫升含賽尼可1.2mg/ml的乙醇溶液，測定時再稀釋；建立脂肪酶測活體系1).空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8%牛膽鹽溶液2!111與水10ml，置100ml三角瓶中，加95%乙醇溶液lml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;2).樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8。/。牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置100ml三角瓶中，加上述稀釋的賽尼可樣品lml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0。3).測定方法及樣品溶液抑制率的測定-空白溶液測定將空白溶液脂肪酶測活體系在37'C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液lml加至空白溶液測活體系中，在37"C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算空白溶液反應(yīng)前后PH差值，記為Al;另取在水浴中煮沸20分鐘的上述酶原液lml，照上述方法測定作酶空白對照，pH差值記為A0;則空白溶液酶反應(yīng)pH變化值為AA二A1-A0;樣品溶液測定將樣品溶液脂肪酶測活體系在37'C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液lml加至樣品溶液測活體系中，在37t:水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算樣品溶液反應(yīng)前后PH差值，記為B1;另取在水浴中煮沸20分鐘的上述酶原液lml,照上述方法測定作酶空白對照，pH差值記為B0;則樣品溶液酶反應(yīng)pH變化值為AB二B1-B0;樣品溶液抑制率的測定用空白溶液酶反應(yīng)pH變化值減去樣品溶液酶反應(yīng)pH變化值，得到空白溶液與樣品溶液酶反應(yīng)的"ApH"值，即ApH二AA—AB，將此"ApH"值代入95%乙醇為空白溶液的脂肪酶抑制率計算公即得測定樣品的脂肪酶抑制率，表9樣品溶液的J結(jié)果見表9:指肪酶抑制率測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實驗例41.脂肪酶抑制率與PH變化梯度關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳液及測定酶液三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液制備取三羥甲基氨基甲烷3.030g，用0.1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至8.5，加水接近500ml，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至8.5，定容至500ml;橄欖油乳化液的制備.，取橄欖油12ml與阿拉伯樹膠22.5g，研磨均勻，緩緩加水研磨使成300ml，用勻質(zhì)機(jī)(Heidlph)乳化，18000轉(zhuǎn)/min，乳化2次，每次3分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢查，90%乳粒的直徑應(yīng)在3陶以下，并不得有l(wèi)OWn的乳粒；柳牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽8.0g，置于50ml燒杯中，以蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，定容；0.lmol/L氫氧化鈉溶液精密稱取氫氧化鈉2.0g，加水溶解定容至500ml;脂肪酶溶液的制備精密稱取SIGMA:L9780胰脂肪酶，于50ml容量瓶中，加冷至5。C以下的三羥甲基氨基甲垸緩沖液，溶解，加定容至50ml，制成每lml中含胰脂肪酶20活力單位的溶液；測定酶液的準(zhǔn)備按表10制備，空白酶液，即OU/ml的酶液，為三羥甲基氨基甲垸緩沖液，也可以用在水浴中煮沸20分鐘的脂肪酶溶液代替；表IO測定酶液的準(zhǔn)備實驗編號012345678910酶原液加量(ml)5.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50三羥甲基氨基甲烷緩沖液00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0加量(ml)酶濃度(U/ml)20181614121086420B.建立空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8y。牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置100ml三角瓶中，加空白溶液lml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，空白溶液是水、乙醇或其它溶劑；C.繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，先將不同梯度的測定酶液換算成對應(yīng)的抑制率，抑制率換算公式Y(jié)(%)二(X。-Xn)/XoY(%)—表示脂肪酶抑制率X。一表示酶原液濃度(U/ml)Xn—表示不同稀釋度的酶液濃度(U/ml)設(shè)定酶濃度為零時，抑制率為100%;設(shè)定酶原液濃度的抑制率為0，見表11:表ll脂肪酶酶量與抑制率換算關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法如下將上述空白溶液脂肪酶測活體系在37'C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取上述不同濃度梯度的測定酶液lml，分別加至空白溶液測活體系中，在37"C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算反應(yīng)前后pH差值；用酶濃度為20U/ml時反應(yīng)前后的PH差值，分別減去不同濃度梯度的測定酶液反應(yīng)前后的pH差值，即得到對應(yīng)不同抑制率的pH變化幅度"ApH"值，結(jié)果見表12、13:表12以水為空白樣品g削則定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表13以95%乙醇為空白樣品的測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>以抑制率為縱坐標(biāo)，"ApH"值為橫坐標(biāo)，繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到抑制率計算公式；2.檢測陽性對照藥賽尼可(orlistat)對脂肪酶的抑制強(qiáng)度(抑制率)樣品(orlistat)的制備取1粒orlistat膠囊，將內(nèi)容物倒入12ml離心管中，加入95。/。乙醇溶液10ml，超聲提取20min，離心(4000rpm，20min)上清液，用0.45u濾膜過濾于100ml容量瓶中，沉淀再用同樣的乙醇溶液10ml超聲提取20min，離心(4000rpm，20min)上清液，過0.45u濾膜，與第一次過膜液合并于100ml容量瓶中，定容；配成每毫升含賽尼可1.2mg/ml的乙醇溶液，測定時再稀釋；建立脂肪酶測活體系1).空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8Q/。牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置100ml三角瓶中，加95%乙醇溶液lml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;2).樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、896牛膽鹽溶液2ml與水10ml，置100ml三角瓶中，加上述稀釋的賽尼可樣品lml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0。3).測定方法及測定樣品的脂肪酶抑制率的測定空白溶液測定將空白溶液脂肪酶測活體系在37"C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取20U/ml的胰脂肪酶溶液lml加至空白溶液測活體系中，在37'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算空白溶液反應(yīng)前后pH差值，記為Al;另取在水浴中煮沸20分鐘的上述酶原液lml，照上述方法測定作酶空白對照，pH差值記為AO;則空白溶液酶反應(yīng)pH變化值為AA二A1-A0;樣品溶液測定將樣品溶液脂肪酶測活體系在37'C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取20U/ml胰脂肪酶溶液lml加至樣品溶液測活體系中，在37'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算樣品溶液反應(yīng)前后pH差值，記為B1;另取在水浴中煮沸20分鐘的上述酶原液lml，照上述方法測定作酶空白對照，pH差值記為B0;則樣品溶液酶反應(yīng)pH變化值為AB二B1-B0;測定樣品的脂肪酶抑制率的測定用空白溶液酶反應(yīng)的pH變化值減去樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值，得到空白溶液與樣品溶液酶反應(yīng)的"ApH"值，即ApH二AA—AB，將此"ApH"值代入上述空白溶液的脂肪酶抑制率計算公式，即求得測定樣品的脂肪酶抑制率，結(jié)果見表14:表14以乙醇為空白溶液對照測定樣品溶液的抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>下述實施例均能實現(xiàn)上述實驗例的效果。具體實施例方式實施例l:A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳液及測定酶液三羥甲基氨基甲烷緩沖液制備取三羥甲基氨基甲垸3.030g，用0.1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至8.5，加水至450-480ml，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至8.5，定容至500ml;橄欖油乳化液的制備取橄欖油12ml與阿拉伯樹膠22.5g，研磨均勻，加水研磨至300ml，用18000轉(zhuǎn)/min的勻質(zhì)機(jī)乳化2次，每次3分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢査，90。/。乳粒的直徑在3Wn以下，并不得有10Mm的乳粒，即可;8%牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽8.0g，置于50ml燒杯中，以水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容；0.1mol/L氫氧化鈉溶液的制備精密稱取氫氧化鈉2.000g，加水溶解定容至500ml;脂肪酶溶液的制備精密稱取SIGMA:L3126胰脂肪酶于容量瓶中，用冷卻至5。C以下的三羥甲基氨基甲烷緩沖液溶解，制成每lml中含胰脂肪酶IOO活力單位的溶液，作為酶原液備用；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，將酶原液用三羥甲基氨基甲垸緩沖液稀釋至不同梯度90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液；B.建立脂肪酶測活體系1.空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、89&牛膽鹽溶液2ml與水5ml，置100ml三角瓶中，加水2ml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;2.樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25ml、8%牛膽鹽溶液2ml與水5ml，置100ml三角瓶中，加黃芩水提液2ml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0。C.繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法將上述空白溶液脂肪酶測活體系在39"C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取上述不同梯度濃度的測定酶液1ml，分別加至空白溶液測活體系中，在39"C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算反應(yīng)前后pH差值；用酶濃度為100U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，分別減去酶濃度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml、0U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，即得到對應(yīng)不同抑制率的pH變化幅度"ApH"值；以抑制率為縱坐標(biāo)，"ApH"值為橫坐標(biāo)，繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到抑制率計算公式。D.黃芩水提液的測定及抑制率的計算空白溶液測定將空白溶液脂肪酶測活體系在39"C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液1ml加至空白溶液測活體系中，在39-C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算空白溶液反應(yīng)前后PH差值，記為A1;另取在水浴中煮沸20分鐘的上述酶原液lml，照上述方法測定作酶空白對照，pH差值記為AO;則空白溶液酶反應(yīng)pH變化值為AA二A1-A0;黃苳水提液測定將樣品溶液脂肪酶測活體系在39'C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液1ml加至樣品溶液測活體系中，在39"C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算樣品溶液反應(yīng)前后pH差值，記為Bl;另取在水浴中煮沸20分鐘的上述酶原液lml，照上述方法測定作酶空白對照，pH差值記為BO;則樣品溶液酶反應(yīng)pH變化值為AB二B1-B0;抑制率的計算用空白溶液酶反應(yīng)pH變化值減去樣品溶液酶反應(yīng)pH變化值，得到空白溶液與樣品溶液酶反應(yīng)的"ApH"值，即ApH二AA—AB，將此"ApH"值代入上述脂肪酶抑制率計算公式，即求得黃芩水提液的脂肪酶抑制率。實施例2:A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳液及測定酶液三羥甲基氨基甲垸緩沖液制備取三羥甲基氨基甲垸3.530g，用0.1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至7.8，加水至450ml，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至7.8，定容至450ml;橄欖油乳化液的制備取橄欖油14ml與阿拉伯樹膠24g，研磨均勻，加水研磨至350ml,用18000轉(zhuǎn)/min的勻質(zhì)機(jī)乳化2次，每次3分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢査，90%乳粒的直徑在3陶以下，并不得有10Mm的乳粒，即可；6%牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽6.0g，置于50ml燒杯中，以水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容；0.lmol/L氫氧化鈉溶液的制備精密稱取氫氧化鈉2.OOOg，加水溶解定容至500ml;脂肪酶溶液的制備精密稱取SIGMA:L9780胰脂肪酶于容量瓶中，用冷卻至5'C以下的三羥甲基氨基甲烷緩沖液溶解，制成每lml中含胰脂肪酶20活力單位的溶液，作為酶原液備用；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，將酶原液用三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋至不同梯度18U/ml、16U/ml、14U/ml、12U/ml、10U/ml、8U/ml、6U/ml、4U/ml、2U/ml的測定酶液；B.建立脂肪酶測活體系1.空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液30ml、8y。牛膽鹽溶液3ml與水12ml，置100ml三角瓶中，加乙醇2ml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5;2.樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液30ml、8%牛膽鹽溶液3ml與水12ml，置100ml三角瓶中，加大黃醇提液2ml，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5。C.繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法將上述空白溶液脂肪酶測活體系在35'C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5;精密量取上述不同梯度濃度的測定酶液1ml，分別加至空白溶液測活體系中，在35'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算反應(yīng)前后pH差值；用酶濃度為20U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，分別減去酶濃度為18U/ml、16U/ml、14U/ml、12U/ml、10U/ml、8U/ml、6U/ml、4U/ml、2U/ml、0U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，即得到對應(yīng)不同抑制率的pH變化幅度"ApH"值；以抑制率為縱坐標(biāo)，"ApH"值為橫坐標(biāo)，繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到抑制率計算公式。D.大黃醇提液的測定及抑制率的計算空白溶液測定:將空白溶液脂肪酶測活體系在35'C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5;精密量取酶原液1ml加至空白溶液測活體系中，在35。C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算空白溶液反應(yīng)前后PH差值，記為A1;另取在水浴中煮沸18分鐘的上述酶原液lml，照上述方法測定作酶空白對照，pH差值記為AO;則空白溶液酶反應(yīng)pH變化值為AA二A1-A0;大黃醇提液測定將樣品溶液脂肪酶測活體系在35'C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5;精密量取酶原液1ml加至樣品溶液測活體系中，在35'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算樣品溶液反應(yīng)前后pH差值，記為B1;另取在水浴中煮沸18分鐘的上述酶原液lml，照上述方法測定作酶空白對照，pH差值記為BO;則樣品溶液酶反應(yīng)pH變化值為AB二B1-B0;抑制率的計算用空白溶液反應(yīng)前后PH差值減去樣品溶液反應(yīng)前后pH差值，得到空白溶液與樣品溶液酶反應(yīng)的"ApH"值，將此"ApH"值代入脂肪酶抑制率計算公式，即求得大黃醇提液的脂肪酶抑制率。權(quán)利要求1、一種檢測脂肪酶活力抑制率的方法，其特征在于該方法包括如下步驟A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳化液及測定酶液三羥甲基氨基甲烷緩沖液制備取三羥甲基氨基甲烷3-4重量份，用0.1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至7.5-9.5，加水至400-600體積份，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至7.5-9.5，定容至400-600體積份；橄欖油乳化液的制備取橄欖油10-15體積份與阿拉伯樹膠20-25重量份，研磨均勻，加水研磨至200-400體積份，用18000轉(zhuǎn)/min的勻質(zhì)機(jī)乳化1-3次，每次2-4分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢查，90％乳粒的直徑在3μm以下，并不得有10μm的乳粒，即可；牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽5-10重量份，置于50ml燒杯中，以水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容；氫氧化鈉溶液的制備精密稱取氫氧化鈉1-3重量份，加水溶解定容至500重量份；脂肪酶溶液的制備精密稱取標(biāo)準(zhǔn)脂肪酶于容量瓶中，用冷卻至5℃以下的三羥甲基氨基甲烷緩沖液溶解，制成每1ml中含胰脂肪酶10～200活力單位的溶液，作為酶原液備用；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，將酶原液用三羥甲基氨基甲烷緩沖液稀釋至不同濃度梯度的測定酶液；0U/ml的測定酶液是在水浴中煮沸15-30分鐘的酶原液，也可以用三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替；B.建立脂肪酶測活體系1).空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液20-30重量份、牛膽鹽溶液1-3重量份與水5-15重量份，置100ml三角瓶中，加空白溶液1-3重量份，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8-10，空白溶液是水、乙醇或其它溶劑；2).樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液20-30重量份、牛膽鹽溶液1-3重量份與水5-15重量份，置100ml三角瓶中，加樣品溶液1-3重量份，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8-10，樣品溶液是用相應(yīng)的空白溶液溶解或提取的具有潛在的抑制脂肪酶活力的物質(zhì)的測定溶液；C.繪制脂肪酶抑制率“Y％”與pH變化幅度“△pH”關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，先將不同梯度的測定酶液換算成對應(yīng)的抑制率，抑制率換算公式Y(jié)(％)=(X0-Xn)/X0Y(％)—表示脂肪酶抑制率X0—表示酶原液濃度(U/ml)Xn—表示不同稀釋度的酶液濃度(U/ml)；設(shè)定酶濃度為零時，抑制率為100％；設(shè)定酶原液濃度的抑制率為0，將酶原液按一定梯度稀釋成90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液，則對應(yīng)的抑制率Y％分別為10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％；空白酶液(0U/ml)是在水浴中煮沸15-30分鐘的酶原液或是用三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法將上述空白溶液脂肪酶測活體系在35-40℃水浴中保溫5-15分鐘，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8-10；精密量取上述不同濃度梯度的測定酶液1體積份，分別加至空白溶液測活體系中，在35-40℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2-30分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算反應(yīng)前后的pH差值；用酶濃度為100U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，分別減去酶濃度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml、0U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，即得到對應(yīng)不同抑制率的pH變化幅度“△pH”值；以抑制率“Y％”為縱坐標(biāo)，“△pH”值為橫坐標(biāo)，繪制脂肪酶抑制率“Y％”與pH變化幅度“△pH”關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到相應(yīng)空白溶液的抑制率計算公式；D.測定方法及樣品溶液脂肪酶抑制率空白溶液測定將空白溶液脂肪酶測活體系在35-40℃水浴中保溫5-15分鐘，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8-10；精密量取酶原液1體積份加至空白溶液測活體系中，在35-40℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2-30分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算空白溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為A1；另取在水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液1體積份，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為A0；則空白溶液酶反應(yīng)的pH變化值為△A=A1-A0；樣品溶液測定將樣品溶液脂肪酶測活體系在35-40℃水浴中保溫5-15分鐘，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8-10；精密量取酶原液1體積份加至樣品溶液測活體系中，在35-40℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2-30分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算樣品溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為B1；另取在水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液1體積份，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為B0；則樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值為△B=B1-B0；樣品溶液脂肪酶抑制率用空白溶液酶反應(yīng)的pH變化值“△A”減去樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值“△B”，得到空白溶液與樣品溶液酶反應(yīng)的“△pH”值，即△pH=△A—△B，將此“△pH”值代入相應(yīng)的空白溶液脂肪酶抑制率計算公式，即得測定樣品的脂肪酶抑制率。2、如權(quán)利要求1所述的檢測脂肪酶活力抑制率的方法，其特征在于該方法包括如下步驟A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳化液及測定酶液三羥甲基氨基甲烷緩沖液制備取三羥甲基氨基甲烷3.030重量份，用0.lmol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至8.0,加水至450-480體積份，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至8.0，再定容至500體積份；橄欖油乳化液的制備取橄欖油12體積份與阿拉伯樹膠22.5重量份，研磨均勻，加水研磨至300體積份，用18000轉(zhuǎn)/min的勻質(zhì)機(jī)乳化2次，每次3分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢査，90%乳粒的直徑在3Pm以下，并不得有l(wèi)OWn的乳粒，即可；牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽8.0重量份，置于50ml燒杯中，以水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容；氫氧化鈉溶液的制備精密稱取氫氧化鈉2.000重量份，加水溶解定容至500ml;脂肪酶溶液的制備精密稱取SIGMA:L3126胰脂肪酶于容量瓶中，用冷卻至5。C以下的三羥甲基氨基甲烷緩沖液溶解，制成每lml中含胰脂肪酶IOO活力單位的溶液，作為酶原液備用；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，將酶原液用三羥甲基氨基甲垸緩沖液稀釋至梯度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液；0U/ml的測定酶液是在水浴中煮沸20分鐘的酶原液；B.建立脂肪酶測活體系-1).空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25體積份、牛膽鹽溶液2體積份與水10體積份，置100ml三角瓶中，加水2體積份，用O.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;2).樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25體積份、牛膽鹽溶液2體積份與水10體積份，置100ml三角瓶中，加樣品溶液2體積份，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至9.0，樣品溶液是用相應(yīng)的空白溶液溶解或提取的具有潛在的抑制脂肪酶活力的物質(zhì)的測定溶液；C.繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，先將不同梯度的測定酶液換算成對應(yīng)的抑制率，抑制率換算公式Y(jié)(%)=(X。-Xn)/X。Y(%)—表示脂肪酶抑制率X。一表示酶原液濃度(U/ml)Xn—表示不同稀釋度的酶液濃度(U/ml)設(shè)定酶濃度為零時，抑制率為100%;設(shè)定酶原液濃度的抑制率為0，將酶原液按一定梯度稀釋成90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液，則對應(yīng)的脂肪酶抑制率Y。/o分別為10%、20%、30%、40°/。、50%、60%、70%、80%、90%;按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法將上述空白溶液脂肪酶測活體系在37"水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取上述不同濃度梯度的測定酶液1體積份，分別加至空白溶液測活體系中，在37"C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算反應(yīng)前后pH差值；用酶濃度為100U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，分別減去酶濃度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml、0U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，即得到對應(yīng)不同抑制率的pH變化幅度"ApH"值；以抑制率為縱坐標(biāo)，"ApH"值為橫坐標(biāo)，繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到以水為空白溶液的脂肪酶抑制率計算公式丫％(抑制率)=104.34XApH-0.558R2=0.9969;D.測定方法及樣品脂肪酶抑制率空白溶液測定:將空白溶液脂肪酶測活體系在37"C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液1體積份加至空白溶液測活體系中，在37'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算空白溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為Al;另取在水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液1體積份，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為A0;則空白溶液酶反應(yīng)pH變化值為AA二A1-A0;樣品溶液測定將樣品溶液脂肪酶測活體系在37'C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液1體積份加至樣品溶液測活體系中，在37'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算樣品溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為Bl;另取在水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液1體積份，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為B0;則樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值為AB二B1-B0;樣品溶液脂肪酶抑制率用空白溶液酶反應(yīng)的pH變化值"AA"減去樣品溶液酶反應(yīng)的PH變化值"AB"，得到空白溶液與樣品溶液酶反應(yīng)的"△pH"值，即ApH二AA—AB,將此"ApH"值代入上述相應(yīng)空白溶液的脂肪酶抑制率計算公式，即得測定樣品的脂肪酶抑制率。3、如權(quán)利要求1所述的檢測脂肪酶活力抑制率的方法，其特征在于該方法A步驟為A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳化液及測定酶液三羥甲基氨基甲垸緩沖液制備取三羥甲基氨基甲烷3.030重量份，用0.lmol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至8.0，加水至450-480體積份，搖勻，再調(diào)節(jié)pH值至8.0，再定容至500體積份；橄欖油乳化液的制備取橄欖油12體積份與阿拉伯樹膠22.5重量份，研磨均勻，加水研磨至300體積份，用18000轉(zhuǎn)/min的勻質(zhì)機(jī)乳化2次，每次3分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢查，90%乳粒的直徑在3Mm以下，并不得有10to的乳粒，即可；牛膽鹽溶液的制備精密稱取牛膽鹽8.0重量份，置于50ml燒杯中，以水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中定容；氫氧化鈉溶液的制備精密稱取氫氧化鈉2.000重量份，加水溶解定容至500ml;脂肪酶溶液的制備精密稱取SIGMA:L3126胰脂肪酶于容量瓶中，用冷卻至5T:以下的三羥甲基氨基甲垸緩沖液溶解，制成每lml中含胰脂肪酶IOO活力單位的溶液，作為酶原液備用；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，將酶原液用三羥甲基氨基甲垸緩沖液稀釋至梯度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液；OU/ml的測定酶液是在水浴中煮沸20分鐘的酶原液。4、如權(quán)利要求1所述的檢測脂肪酶活力抑制率的方法，其特征在于該方法B步驟為B.建立脂肪酶測活體系1).空白溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25體積份、牛膽鹽溶液2體積份與水10體積份，置100ml三角瓶中，加水2體積份，用O.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至9.0;2).樣品溶液脂肪酶測活體系取橄欖油乳液25體積份、牛膽鹽溶液2體積份與水10體積份，置100ml三角瓶中，加樣品溶液2體積份，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至9.0，樣品溶液是用相應(yīng)的空白溶液溶解或提取的具有潛在的抑制脂肪酶活力的物質(zhì)的測定溶液。5、如權(quán)利要求1所述的檢測脂肪酶活力抑制率的方法，其特征在于該方法C步驟為C.繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，先將不同梯度的測定酶液換算成對應(yīng)的抑制率，抑制率換算公式Y(jié)(%)=(Xo-Xn)/X。Y(%)—表示脂肪酶抑制率X。一表示酶原液濃度(U/ml)Xn—表示不同稀釋度的酶液濃度(U/ml)設(shè)定酶濃度為零時，抑制率為100%;設(shè)定酶原液濃度的抑制率為0，將酶原液按一定梯度稀釋成90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液，則對應(yīng)的脂肪酶抑制率Yo/o分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%;按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法將上述空白溶液脂肪酶測活體系在37。C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取上述不同濃度梯度的測定酶液1體積份，分別加至空白溶液測活體系中，在37'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算反應(yīng)前后pH差值；用酶濃度為100U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，分別減去酶濃度為90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml、0U/ml時反應(yīng)前后的pH差值，即得到對應(yīng)不同抑制率的pH變化幅度"ApH"值；以抑制率為縱坐標(biāo)，"ApH"值為橫坐標(biāo)，繪制脂肪酶抑制率"Y%"與pH變化幅度"ApH"關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到以水為空白溶液的脂肪酶抑制率計算公式Y(jié)。/。(抑制率X04.34XApH-0.558R2=0.9969。6、如權(quán)利要求1所述的檢測脂肪酶活力抑制率的方法，其特征在于該方法D步驟為D.測定方法及樣品脂肪酶抑制率空白溶液測定將空白溶液脂肪酶測活體系在37"C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液1體積份加至空白溶液測活體系中，在37"C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算空白溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為Al;另取在水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液1體積份，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為AO;則空白溶液酶反應(yīng)pH變化值為AA二A1-A0;樣品溶液測定將樣品溶液脂肪酶測活體系在37"C水浴中保溫10分鐘，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0;精密量取酶原液1體積份加至樣品溶液測活體系中，在37'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，同時記錄反應(yīng)前后pH值，并計算樣品溶液反應(yīng)前后的pH差值，記為Bl;另取在水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液1體積份，照上述方法測定，作為酶空白對照，pH差值記為B0;則樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值為AB二B1-B0;樣品溶液脂肪酶抑制率用空白溶液酶反應(yīng)的pH變化值"AA"減去樣品溶液酶反應(yīng)的pH變化值"AB"，得到空白溶液與樣品溶液酶反應(yīng)的"△pH"值，即ApH二AA—AB，將此"ApH"值代入上述相應(yīng)空白溶液的脂肪酶抑制率計算公式，即得測定樣品的脂肪酶抑制率。全文摘要本發(fā)明公開一種檢測脂肪酶活力抑制率的方法。本發(fā)明方法包括如下步驟A.準(zhǔn)備試劑、橄欖油乳化液及測定酶液；B.建立脂肪酶測活體系；C.繪制脂肪酶抑制率“Y％”與pH變化幅度“ΔpH”關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線；D.樣品溶液脂肪酶抑制率檢測。本發(fā)明的檢測方法是以脂肪酶活力為靶點，以對脂肪酶活力抑制程度為指標(biāo)，根據(jù)脂肪酶作用原理，建立了一種檢測脂肪酶抑制率的方法。此測定方法簡便、靈敏、可靠、靶點明確、機(jī)理清楚，可以用于大量篩選各種具有脂肪酶抑制作用的物質(zhì)，更進(jìn)一步地用于篩選和開發(fā)減肥降脂藥物。文檔編號C12Q1/34GK101363043SQ20071012001公開日2009年2月11日申請日期2007年8月7日優(yōu)先權(quán)日2007年8月7日發(fā)明者何大林,段震文,郭樹仁,閆雪秋申請人:北京北大維信生物科技有限公司