專利名稱：：耐高溫木聚糖酶基因在乳酸克魯維酵母中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及來自真細(xì)菌耐高溫木聚糖酶基因在乳酸克魯維酵母中的分泌表達(dá)。
背景技術(shù)：
：木聚糖酶主要由腐生真菌和細(xì)菌產(chǎn)生，它能降解植物細(xì)胞壁中的木聚糖成分，并被證實(shí)在農(nóng)業(yè)和工業(yè)的多個領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用價值。木聚糖具有異源性，因而完全降解木聚糖需要多種酶的共同作用，其中P-l，4-D-木聚糖酶是其中一種關(guān)鍵酶，它能打斷主鏈上D-木糖殘基之間的P-l，4糖苷鍵，從而把多糖的骨架降解成短鏈的木寡糖。因此卩-l,4-D-木聚糖酶在食品，飼料和造紙工業(yè)中有著非常廣泛的應(yīng)用。其中，耐高溫木聚糖酶XynB屬于卩-l,4-D-木聚糖酶中的一種，耐高溫木聚糖酶XynB的編碼基因是mj^"B,，其GenBank登錄號為AY340789,該基因克隆自一種耐熱真細(xì)菌一海棲熱胞菌(T7iw附otoga/wfln'rimfl,MSB8),該酶的最適反應(yīng)溫度為90°C，最適反應(yīng)pH值為6.2,且在堿性條件下穩(wěn)定，因此在工業(yè)上，特別是在紙漿漂白工藝上具有巨大的應(yīng)用價值(參見WinterhalterC，LieblW.TwoextremelythermostablexylanasesofthehyperthermophilicbacteriumTTiermofogawzan'rimflMSB8.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1995,61(5):1810~1815)。目前，已有在大腸桿菌中表達(dá)來源于海棲熱袍菌(77^ATWOtogflmw他'mfl)MSB8木聚糖酶基因m:^"5的報道，雖然目的基因表達(dá)量高，但產(chǎn)物主要集中在細(xì)胞內(nèi)，使得后續(xù)的分離純化成本增高。本發(fā)明構(gòu)建了木聚糖酶的乳酸克魯維酵母表達(dá)載體，使得表達(dá)產(chǎn)物大部分分泌至胞外，有效解決了上述問題。
發(fā)明內(nèi)容(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種可在乳酸克魯維酵母中表達(dá)木聚糖酶基因的表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培養(yǎng)條件簡單，發(fā)酵時間短的表達(dá)耐高溫木聚糖酶的方法。(二)技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種耐高溫木聚糖酶的表達(dá)載體pKLAC1-m^A^(64)，它是將耐高溫木聚糖酶基因m^wB(64)插入到表達(dá)載體pKLACl上構(gòu)建得到的，其質(zhì)粒圖譜如附圖2所示。應(yīng)當(dāng)理解，考慮到密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的條件下，可以對pKLACl-mj^w5(64)的核苷酸序列進(jìn)行修改，同時可以對pKLACl的非必需區(qū)段進(jìn)行替換、添加和/或缺失一個或多個核苷酸，另外還可以對例如多克隆位點(diǎn)進(jìn)行修改，然而這些修改并沒有改變本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，均屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明還提供了一種耐高溫木聚糖酶的表達(dá)方法，其包括以下步1)將上述表達(dá)載體導(dǎo)入乳酸克魯維酵母中，篩選得到表達(dá)耐高溫木聚糖酶的工程菌；2)培養(yǎng)所述工程菌，并誘導(dǎo)耐高溫木聚糖酶的表達(dá)。所述培養(yǎng)條件為30。C,初始pH為7，250rpm,培養(yǎng)36-72小時后可誘導(dǎo)耐高溫木聚糖酶的表達(dá)。所述誘導(dǎo)條件為每24小時補(bǔ)充一次誘導(dǎo)物半乳糖，每次補(bǔ)充半乳糖至終濃度為2%。其中，培養(yǎng)時所用的YPG培養(yǎng)基組成為(w/v):酵母粉1%，蛋白胨2%，半乳糖2%。釆用本發(fā)明所述的方法，搖瓶培養(yǎng)48小時，細(xì)胞密度達(dá)OD6()0為20，胞外分泌酶量可達(dá)70mg/L,以RemazolBrilliantR-D-Xylan[(簡稱RBB-Xylan)，中文名稱為4-氧甲基-D-葡萄糖苷-D-木聚糖-Remazol-亮藍(lán)R]為底物，酶活為6105U/L。(三)有益效果本發(fā)明將耐高溫木聚糖酶基因mxyw5(64)插入到表達(dá)載體pKLACl上構(gòu)建得到pKLACl-m;o;B(64),將該表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸克魯維酵母(iao;veramyces/fl"")中獲得的工程菌能夠高效表達(dá)耐高溫木聚糖酶，表達(dá)的木聚糖酶大部分分泌到細(xì)胞外，降低了分離純化成本，而且表達(dá)效率提高，在搖瓶培養(yǎng)的條件下，以半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)時,胞外分泌酶量可達(dá)70mg/L,以RBB-Xylan為底物，酶活為6100U/L。本發(fā)明為該酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。圖l目的基因DNA酶切回收電泳圖，目的片段l.Okb(箭頭所示)，其中M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(kb)，由上到下所對應(yīng)的條帶分別為4.5，3.0，2.0,1.2,0.8，0.50.2;1為目的基因DNA酶切回收片段；圖2表達(dá)質(zhì)粒pKLACl-附""丑(64)構(gòu)建流程圖3表達(dá)質(zhì)粒pKLACl-m;^w^64)的酶切電泳圖，其中，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(kb)，由上到下所對應(yīng)的條帶分別為10,7.5,5,2.5，1,0.25;1表示質(zhì)粒pKLACl-mjc戸A的；2表示質(zhì)粒pKLACl-/wx_yw^64)經(jīng)JWoI和酶切后的結(jié)果；圖4乳酸克魯維酵母GG799-pKLACl-mx^5(64)搖瓶培養(yǎng)細(xì)胞密度及胞外酶活檢測圖。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中涉及的百分含量均為質(zhì)量百分含量，所涉及的酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。引物合成及測序由英駿(Invitrogen)生物公司完成。實(shí)施例1、乳酸克魯維酵母表達(dá)質(zhì)粒pKLACl-mx"J(64)的構(gòu)建1.1引物設(shè)計根據(jù)GenBank中，w5(64)基因的序列(GenBank登錄號為AY340789)以及乳酸克魯維酵母表達(dá)載體pKLACl多克隆位點(diǎn)的特征，設(shè)計合成了以下一對引物PX1:FW:5,-CCCctcgagAAAAGAATGAAAATATTACCTTC-3，PX2:REV:5，-TTTggtaccTCATTTTCTTTCTTCTATCTTTTTCT-3，PX1、PX2兩端分別設(shè)計有Z/ioI和ii:;7wI酶切位點(diǎn)(見上述序列中小寫并有下劃線的部分)1.2耐高溫木聚糖酶基因WJ07I丑(64)的PCR擴(kuò)增釆用PX1、PX2引物，提取77ieA7wotogflmfln'"mfl，MSB8(海棲熱袍菌)的基因組DNA作為模板，(T7^mzotogflmarifima,MSB8基因組在GenBank的注冊號NC000853，MSB8菌株可在德國菌種保藏中心DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，簡稱DSMZ購買獲得)，反應(yīng)體系為模板DNA(10pgV)10xBufferdNTP(2.5mmol/|il)0，primer(PX1)(lOpmo,)O.一primer(PX2)(10pmol/|al)O単Taq酶ddH2014.8jli1總體積20|xl反應(yīng)條件為95。C5min;95。C30s,53。Clmin，72°C1min，循環(huán)30次；72°C10min。1.3從PCR反應(yīng)產(chǎn)物中回收目的片段從PCR產(chǎn)物中純化回收目的基因片段釆用切膠過柱的方法，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈的照射下切下目的基因DNA(目的基因長度為l.Okb(圖1),按照DNA回收試劑盒說明書(購自天根公司，產(chǎn)品編號為DP209-02)的方法進(jìn)行回收。1.4TA克隆將PCR回收產(chǎn)物連接到載體pMD18-T-Simple上(購自TaKaRa公司)，連接反應(yīng)按照TaKaRa公司所提供的試劑盒(CodeNo.D104A)說明書操作。1.5目的基因連接到乳酸克魯維酵母表達(dá)載體pKLACl(#E1000S，NewEnglandBioLabsInc.生產(chǎn)，購自經(jīng)科宏達(dá)公司)用限制性內(nèi)切酶Z7wl和Kpwl分別對pMD18-T-;t^2萬(64)和pKLACl進(jìn)行雙酶切，然后對目的片段進(jìn)行回收，用T4連接酶將其連接，得到表達(dá)質(zhì)粒pKLACl-mx);"B(64),構(gòu)建流程圖見附圖2。表達(dá)質(zhì)粒pKLACl-mj^W(64)的檢測結(jié)果見附圖3,結(jié)果表明外源片段(1.0kb)和載體(9.0kb)大小均正確。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(購自上海生工生物工程有限公司)。實(shí)施例2耐高溫木聚糖酶基因(附J07iB(64))在乳酸克魯維酵母GG799中的分泌表達(dá)2.1乳酸克魯維酵母GG799[購自NewEnglandBioLabsInc.(NEB)]電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備及其電擊轉(zhuǎn)化(1)挑取新鮮的單菌落于5mlYPD液體培養(yǎng)基(酵母粉1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%)中，于30'C，250rpm過夜培養(yǎng)。(2)在室溫下以體積比0.1%的接種量接種于100ml新鮮配制的YPD液體培養(yǎng)基中，于30°C,250rpm培養(yǎng)至OD600為0.4~0.5。(3)在4。C下3000rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞；(4)用250ml冰預(yù)冷的無菌水洗滌細(xì)胞一次；(5)用50ml冰預(yù)冷的無菌電轉(zhuǎn)化緩沖液EB(g/L):蔗糖92.4，氯化鎂2.03，10mmoVLpH7.5的MES緩沖液1L洗滌細(xì)胞一次；(6)將細(xì)胞重懸于50ml冰預(yù)冷的無菌預(yù)處理緩沖液，于3(TC靜止培養(yǎng)30分鐘；(7)在4。C下3000rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞；(8)用10ml冰預(yù)冷的無菌電轉(zhuǎn)化緩沖液EB洗滌細(xì)胞一次；(9)用200^1冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化緩沖液EB重懸細(xì)胞，以每管50pl分裝于小管；(10)向每管中加入2(il線性化的表達(dá)質(zhì)粒pKLACl-mj^"萬(64)，混勻，冰上放置15分鐘；(11)將混合了DNA的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)入0.2cm的電轉(zhuǎn)杯；(12)在BIO-RAD的Ge"e-Pw/ser電轉(zhuǎn)儀上，在IOOOV，400Q，25pF條件下電擊細(xì)胞；(13)馬上加入lml冰預(yù)冷的YPD液體培養(yǎng)基于經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，混勻后轉(zhuǎn)入:L5ml離心管；(14)用lml無菌水洗滌細(xì)胞2次；(15)將細(xì)胞用無菌水稀釋1000倍，涂布含5mM乙酰胺的酵母基本碳源培養(yǎng)基YCB(1L):lmol/LpH7.0的磷酸鹽緩沖液30ml，YCB培養(yǎng)基粉末(NEBInc.#B9017S)11.7g，瓊脂20g，乙酰胺03g)瓊脂平板，3(TC培養(yǎng)35天觀察結(jié)果。2.2.乳酸克魯維酵母高拷貝轉(zhuǎn)化子及木聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選2.2.1乳酸克魯維酵母陽性轉(zhuǎn)化子的篩選轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞混合物被涂布于含有5mM乙酰胺的酵母基本碳源培養(yǎng)基YCB(培養(yǎng)基配方見2.1)。YCB培養(yǎng)基含有K生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)和碳源，但是缺少氮源。只有當(dāng)pKLACl上的am^基因表達(dá)的乙酰胺酶將培養(yǎng)基中加入的乙酰胺降解為氨時，才能被細(xì)胞所利用，故重組子能夠長成較大的菌落。根據(jù)此原理挑選較大的菌落作為陽性轉(zhuǎn)化子，并做進(jìn)一步鑒定。2.2.2酵母菌落PCR法鑒定正確整合的轉(zhuǎn)化子及多拷貝整合的轉(zhuǎn)化子在平板上選到陽性菌落，利用酵母菌落PCR的方法進(jìn)一步驗(yàn)證得到正確整合且具有高拷貝得轉(zhuǎn)化子。根據(jù)試劑盒(#E1000SNEBInc.)提供的引物Prl[5'd(TACCGACGTATATCAAGCCCA)3，]和Pr2[5，d(ATCACCTTGTCAGCGAAAGC)3'],可以利用菌落PCR的方法鑒定轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)框是否正確整合到K/ac&基因組，如果有1.9kb的片段擴(kuò)增出來則可證明表達(dá)框的正確整合。而用引物Pr2和Pr3[5，d(CAGTGATTACATGCATATTGT)3'],擴(kuò)增片段為2.3kb,則可以鑒定多拷貝整合的轉(zhuǎn)化子。模板的處理方法(1)用無菌的吸頭挑取菌落少許，溶解到50(J的D2-Buffer(1L):異硫氰酸胍472.64g，lmol/LpH8.0Tris'HCl緩沖液50ml,(3-巰基乙醇7ml，混勻；(2)將混合液于10(TC沸水浴5分鐘；(3)12000rpm,離心30秒，棄上清；(4)用無菌水洗滌沉淀2次；(5)將沉淀溶于20^1的ddH20，95'C作用5分鐘;(6)離心后得到上清液即為模板。PCR反應(yīng)體系模板2^1Prl2^1Pr22^1dNTP(2.5mM)0.5|il10xBuffer2^1Taq酶0.2|ilddH2011.3^1總體積20(il反應(yīng)條件95。C5分鐘；95。C30秒，5(TC30秒，72'C2分鐘,說明書第8/8頁循環(huán)30次；72°CIO分鐘。分別挑取16個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)外源蛋白表達(dá)分泌量基本相同，選擇其中胞外木聚糖酶活相對較高(570U/L)的一株進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。2.3.乳酸克魯維酵母重組木聚糖酶的表達(dá)和檢測木聚糖酶XynB活性的測定釆用RBB-木聚糖法以1.15%的RBB-木聚糖為底物，在50mMpH6.5的MES(2-嗎啉代乙磺酸一水合物)緩沖液中9CTC保溫IO分鐘。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物的組成為1.15%RBB-木聚糖50nl，200mMMES緩沖液25W和合理稀釋的酶液25W。于9(TC保溫10分鐘后，加入200(xl無水乙醇終止反應(yīng)，同時沉淀殘留底物。靜止放置至少15分鐘，混合物以12000rpm離心5分鐘，取上清液，在00595波長下讀吸光值；空白對照的操作與上述一樣，只是以25pl水代替酶液。l個酶活單位(unit)的定義為在上述反應(yīng)條件下，每分鐘導(dǎo)致AODs95-1.0所需要的酶量為一個酶活單位。挑取新鮮的乳酸克魯維酵母陽性轉(zhuǎn)化子單菌落到5ml新鮮的YPD培養(yǎng)基活化后，以1/10的接種量接種于YPG培養(yǎng)基搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)，于30'C,250rpm培養(yǎng)72小時，每24小時補(bǔ)充一次誘導(dǎo)物半乳糖，每次補(bǔ)充半乳糖至終濃度為2%。每隔一定的時間取樣，測量其細(xì)胞密度(OD,)和胞外的木聚糖酶的活性。檢測結(jié)果如附圖4所示，從結(jié)果中我們可以看到在YPG培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)的條件下34小時酶活達(dá)到最高，而細(xì)胞密度的增長在此時也開始放緩。在2xYPG培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)條件下(初始pH為7,培養(yǎng)溫度為30°C),細(xì)胞密度和胞外酶活都有明顯的提高，培養(yǎng)48小時，細(xì)胞密度達(dá)OD6QQ為20，胞外分泌酶量可達(dá)70mg/L，以RBB-木聚糖為底物，酶活為6105U/L。權(quán)利要求1.一種表達(dá)載體pKLAC1-mxynB(64)，其質(zhì)粒圖譜如附圖2所示。2、一種表達(dá)耐高溫木聚糖酶的方法，其包括以下步驟1)將權(quán)利要求l所述的表達(dá)載體導(dǎo)入乳酸克魯維酵母中，篩選得到表達(dá)耐高溫木聚糖酶的工程菌；2)培養(yǎng)所述工程菌，并誘導(dǎo)耐高溫木聚糖酶的表達(dá)。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)中的培養(yǎng)條件為3(TC,初始pH為7,250rpm,培養(yǎng)36-72小時后誘導(dǎo)耐高溫木聚糖酶的表達(dá)。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)條件為每24小時補(bǔ)充一次誘導(dǎo)物半乳糖，每次補(bǔ)充半乳糖至終濃度為2%。5、根據(jù)權(quán)利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)時所用的YPG培養(yǎng)基組成為(w/v):酵母粉1%,蛋白胨2%，半乳糖2%。全文摘要本發(fā)明提供了一種耐高溫木聚糖酶分泌表達(dá)載體以及通過乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)高效表達(dá)耐高溫木聚糖酶的方法。采用本發(fā)明所述的方法，使得表達(dá)的木聚糖酶大部分分泌到細(xì)胞外，從而降低了分離純化成本，而且大大提高了表達(dá)效率；其中在搖瓶培養(yǎng)的條件下，以半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)時，胞外分泌酶量可達(dá)70mg/L，以RBB-木聚糖為底物時，酶活可高達(dá)6100U/L。文檔編號C12N1/19GK101372694SQ20071012062公開日2009年2月25日申請日期2007年8月22日優(yōu)先權(quán)日2007年8月22日發(fā)明者關(guān)國華,鐵印,穎李,李季倫,王珍芳申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)