專利名稱：一種補料批式培養(yǎng)高產微生物油脂的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化工技術領域，特別涉及一種補料批式培養(yǎng)高產 微生物油脂的方法。
技術背景目前，全球性能源短缺與環(huán)境惡化日益嚴重，人們不得不從環(huán)境保 護與資源開發(fā)的角度出發(fā)，積極開發(fā)替代化石燃料的可再生新能源，生 物柴油就是一種具有很大發(fā)展?jié)摿Φ目稍偕鍧嵞茉?。目前國內外對?生物柴油制備的研究主要集中于植物油或餐飲廢棄油脂方面，但利用植物油為原料成本高，其成本占到總生產成本的70% 85%，以餐飲廢棄油 為原料，也存在原料難以收集和運輸?shù)睦щy，這些都嚴重地制約了生物 柴油的產業(yè)化進程，因此尋找一種廉價的原料成為了生物柴油產業(yè)化的微生物油脂(microbial oil)又稱單細胞油脂(single cell oil), 是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定的條件下，利用碳水化合 物、碳氫化合物和普通油脂作為碳源，在菌體內產生的大量油脂[l]。生 物柴油由各種動、植物油脂經(jīng)酯化或轉酯化工藝而得，而大部分微生物 油的脂肪酸組成和一般植物油相近，因此微生物油脂可替代植物油脂生 產生物柴油[2，3]。由于技術經(jīng)濟原因，過去單細胞油脂很少有規(guī)模化生 產的報道，但隨著工業(yè)生物技術的發(fā)展，微生物油脂發(fā)酵從原料到過程 都在不斷取得新的進展。最近美國國家可再生能源實驗室(NREL)的報 告特別指出，微生物油脂發(fā)酵可能是生物柴油產業(yè)和生物經(jīng)濟的重要研 究方向。通過微生物發(fā)酵制備微生物油脂，不僅可為生物柴油的制備提供更 加廉價而廣泛的原料，而且微生物具有細胞增殖快，生產周期短，生長 所需的原料豐富，價格便宜等優(yōu)點，因此利用微生物發(fā)酵生產油脂作為 制備生物柴油的原料在未來生物柴油產業(yè)中將發(fā)揮重要的作用。目前， 微生物油脂主要采用批式發(fā)酵5—7天，油脂含量可達細胞干重的20 — 50%。因此，仍需要開發(fā)新的工藝，提高油脂含量和生物量，從而降低 生產成本。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種補料批式培養(yǎng)高產微生物油脂的方 法，提高油脂含量和生物量，從而降低生產成本。本發(fā)明所述補料批式培養(yǎng)高產微生物油脂的方法是在菌體對數(shù)生長中期向發(fā)酵培養(yǎng)基中補加碳源，并以C/^40同時進行氮源的補加，其微生物油脂含量可顯著提高。具體工藝步驟如下(1)將保存在固體培養(yǎng)基中的粘紅酵母斯達凱依酵母，被孢露，拉曼被孢霉等可產生微生物油脂的菌種接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24—30h，以5 % — 10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基；搖瓶培養(yǎng)溫度25 —35°C,搖床轉速 150—250r/min;發(fā)酵罐培養(yǎng)pH=6. 0，通氣量0. 5 — 1. lvvm，攪拌轉速 300—600r/min;(2) 發(fā)酵培養(yǎng)至菌體對數(shù)生長中期20—30h進行補料，向發(fā)酵培養(yǎng) 基中補加10g/L—20g/L葡萄糖、木糖或纖維素水解液碳源，并以C/N=40 同時進行硫酸氨或硝酸鉀氮源的補加。(3) 發(fā)酵40 —120h結束，4°C， 3000-5000 r/min離心菌體，提取 微生物油脂進行測定。本發(fā)明所述的發(fā)酵菌種為粘紅酵母，斯達凱依酵母，被孢霉，拉曼 被孢霉可產生微生物油脂的菌種。本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明的補料批式培養(yǎng)工藝，較批式培養(yǎng) 可顯著提高微生物細胞油脂含量和油脂產量，降低了生產成本。且補料 方式簡單易行，便于操作。
具體實施方式
實例l(1) 菌種粘紅酵母(欣oflbtor"h 67〃"77j's，購自中科院微生物所)(2) 培養(yǎng)基a、 固體培養(yǎng)基酵母粉1%;蛋白胨2%;葡萄糖2%;瓊脂:2%; PH=6。b、 種子培養(yǎng)基葡萄糖1. 5%; (NH4)2S04: 0. 2%;酵母粉0. 1%; KH2P04: 0. 7%; Na2HP04: 0.2%; MgS04: 0.15%; pH=6.0。 C、發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖5%; (NH4)2S04: 0. 25%;酵母粉0. 1%; KH2P04: 0. 7%; Na2HP04: 0.2%; MgS04: 0.2%; CaCl2: 0.01%; FeCl3: 0.007%; pH=6.0。(3) 培養(yǎng)方式甘油管保藏的菌種轉接至固體斜面培養(yǎng)基，3(TC下活化12小時。 種子培養(yǎng)采用有氧培養(yǎng)，使用500ml三角瓶，裝液量50ml。培養(yǎng)溫度 30°C，搖床轉速180rpm。種子培養(yǎng)28h以5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基， 發(fā)酵培養(yǎng)使用1L發(fā)酵罐，裝液量700ml，通氣量l.Ovvm，攪拌轉速 600rpm。在發(fā)酵進行到20h補加葡萄糖7g (補加量按10g/l計算)，同 時補加硫酸銨0. 33g (補加量按C/N=40計算)，以不補料的批式培養(yǎng) 為對照。(4) 發(fā)酵結果發(fā)酵55h，對照菌體生物量達到12.7g/1，油脂含量26.3%，油脂 產量3.3g/1。補料批式培養(yǎng)菌體生物量15.3g/1，油脂含量38.4%，油 脂產量5. 5g/1。采用補料培養(yǎng)較對照批式培養(yǎng)菌體生物量提高20. 5%， 油脂含量和產量分別提高46%和67%。 實例2(1) 菌種粘紅酵母(朋oobz^2Y/7a 67""77&，購自中科院微生物所)(2) 培養(yǎng)基(A) 固體培養(yǎng)基 同實例1(B) 種子培養(yǎng)基葡萄糖1. 5%; KN03: 0. 3%;酵母粉0. 1%; KH2P04: 0. 7%; Na2HP04: 0.2%; MgS04: 0.15%; pH=6.0。(C) 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖5%;跳:0.4%;酵母粉0.1%; KH2P04: 0.7%; Na2HP04:0.2%; MgSO" 0.2%; CaCl2: 0.01%; FeCl3: 0.007%; pH二6.0。(3) 培養(yǎng)方式甘油管保藏的菌種轉接至固體斜面培養(yǎng)基，3(TC下活化12小時。 種子培養(yǎng)采用有氧培養(yǎng)，使用500ml三角瓶，裝液量50ml。培養(yǎng)溫度 30°C，搖床轉速180rpm。種子培養(yǎng)28h以5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，
發(fā)酵培養(yǎng)使用1L發(fā)酵罐，裝液量700ml，通氣量l.Ovvm，攪拌轉速 550rpm。在發(fā)酵進行到28h補加葡萄糖9. 8g (補加量按14g/l計算)， 同時補加硝酸鉀0.71g (補加量按C/N二40計算)，以不補料的批式培 養(yǎng)為對照。 (4)發(fā)酵結果發(fā)酵60h，對照菌體生物量達到18.9g/1，油脂含量41.3%，油脂 產量7.8g/1。補料批式培養(yǎng)菌體生物量22.4g/1，油脂含量60.4%，油 脂產量13. 5g/1。采用補料培養(yǎng)較對照批式培養(yǎng)菌體生物量提高18. 5%， 油脂含量和產量分別提高46. 2%和73%。實例3(1) 菌種粘紅酵母(欣W"07Y/7a67〃"/7"，購自中科院微生物所)(2) 培養(yǎng)基同實例l(A) 固體培養(yǎng)基 同實例1(B) 種子培養(yǎng)基 同實例2(C) 發(fā)酵培養(yǎng)基 同實例2(3) 培養(yǎng)方式種子培養(yǎng)同實例1，發(fā)酵培養(yǎng)采用5L發(fā)酵罐，裝液 量3L，通氣量1. Ovvm，攪拌轉速520卬m。發(fā)酵進行到30h補加葡萄 糖60g (補加量按20g/l計算)，同時補加硝酸鉀4. 35g (補加量按 C/N二40計算)。以不補料的批式培養(yǎng)為對照。(4) 發(fā)酵結果發(fā)酵66h，對照菌體生物量達到17.2g/1,油脂含量40%，油脂產 量6.9g/1。補料批式培養(yǎng)菌體生物量19.8g/1，油脂含量57.8%，油脂 產量11. 4g/1。采用補料培養(yǎng)較對照批式培養(yǎng)菌體生物量提高15.1%, 油脂含量和產量分別提高44. 5%和65. 2%。
權利要求
1.一種補料批式培養(yǎng)高產微生物油脂的方法，其特征在于在菌體對數(shù)生長中期向培養(yǎng)基中補加碳源，并以C/N＝40同時進行氮源的補加，工藝步驟如下(1)將保存在固體培養(yǎng)基中的粘紅酵母斯達凱依酵母，被孢霉，拉曼被孢霉等可產生微生物油脂的菌種接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24-30h，以5％-10％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基；搖瓶培養(yǎng)溫度25-35℃，搖床轉速150-250r/min；發(fā)酵罐培養(yǎng)pH＝6.0，通氣量0.5-1.1vvm，攪拌轉速300-600r/min；(2)發(fā)酵培養(yǎng)至菌體對數(shù)生長中期20-30h進行補料，向發(fā)酵培養(yǎng)基中補加10g/L-20g/L葡萄糖、木糖或纖維素水解液碳源，并以C/N＝40同時進行硫酸氨或硝酸鉀氮源的補加。(3)發(fā)酵40-120h結束，4℃，3000-5000r/min離心菌體，提取微生物油脂進行測定。
2. 按照權利要求1所述方法，其特征在于，發(fā)酵菌種為粘紅酵母斯 達凱依酵母，被孢霉，拉曼被孢霉等可產生微生物油脂的菌種。
全文摘要
一種補料批式培養(yǎng)高產微生物油脂的方法，屬于生物化工技術領域。在以菌體對數(shù)生長中期向發(fā)酵培養(yǎng)基中補加碳源，并以C/N＝40同時進行氮源的補加，優(yōu)點在于，其微生物油脂含量和產量可顯著提高。且補料方式簡單易行，便于操作。
文檔編號C12P7/64GK101153299SQ20071012121
公開日2008年4月2日 申請日期2007年8月31日 優(yōu)先權日2007年8月31日
發(fā)明者劉宏娟, 周玉杰, 墨玉欣, 張建安, 建 李, 程可可 申請人:清華大學