專(zhuān)利名稱(chēng)：一種甘露聚糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甘露聚糖的制備方法。
技術(shù)背景酵母是一種單細(xì)胞真菌，是迄今為止人類(lèi)使用最廣泛、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的微生物。國(guó)際FDA認(rèn)可啤酒酵母為安全的微生物，已經(jīng)在飲料和食品的生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。目 前，我國(guó)年消耗酵母約2000噸，產(chǎn)生約3噸的廢酵母泥。由于酵母細(xì)胞壁是啤酒制 造產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物，而且現(xiàn)今對(duì)其的主要處理方法就是作為粗詞料廉價(jià)售出或者 直接排放，給環(huán)境造成很大的資源浪費(fèi)和污染。已經(jīng)有多個(gè)研究結(jié)果表明，純凈的酵母細(xì)胞壁對(duì)動(dòng)物具有明顯的免疫促進(jìn)作用， 而且還表現(xiàn)出促進(jìn)生長(zhǎng)作用。進(jìn)一步的證據(jù)表明，其主要機(jī)理是其中含有的e -1， 3/1， 6-葡聚糖和甘露聚糖具有相應(yīng)的免疫和生長(zhǎng)促進(jìn)作用，已有大量試驗(yàn)研究結(jié) 果表明，P-1,3/1, 6-葡聚糖和甘露聚糖是效果顯著的動(dòng)物機(jī)體功能調(diào)節(jié)劑。而且， 隨著飼用抗生素的逐漸禁用，安全、可替代的生物飼料添加劑正逐漸成為行業(yè)主流。甘露聚糖的制備化工方法相對(duì)得率較低，工藝流程中需要較多不穩(wěn)定化學(xué)制劑， 安全系數(shù)較低。目前，主要采用微生物發(fā)酵結(jié)合化學(xué)提取的方法制備甘露聚糖。主 要過(guò)程為應(yīng)用基因工程，從多種酵母菌種篩選出細(xì)胞壁中甘露聚糖含量較高的菌株 并對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，待其增殖后，收集酵母細(xì)胞壁(用超聲波技術(shù)將酵母細(xì)胞震碎， 再將震碎的酵母細(xì)胞溶液經(jīng)多次清洗過(guò)濾，除去苦味物質(zhì)和雜質(zhì)，進(jìn)行化學(xué)處理步 驟)?；瘜W(xué)處理的步驟大體相似，將所獲得的酵母細(xì)胞壁清洗之后重懸，在高溫高 壓條件下，使其破碎，以冷甲醇萃取得白色粗提物質(zhì)，以有機(jī)物質(zhì)去蛋白并用乙酸 洗漆，重新用乙醇萃取得最終產(chǎn)物。這樣處理的步驟可以降低所得產(chǎn)品中的蛋白含 量，并且甘露聚糖的含量也有所保證；缺點(diǎn)就是在最初的步驟中即采用超聲波處理， 由于酵母細(xì)胞壁的韌性，使得破壁效率并不高，最終產(chǎn)品得率也偏低。在甘露聚糖 的提取過(guò)程中，大量應(yīng)用了有機(jī)物質(zhì)，徹底去除較難并且給工業(yè)化生產(chǎn)提出挑戰(zhàn)。 傳統(tǒng)的酵母細(xì)胞壁中3 -1， 3/1， 6-葡聚糖的提取工藝中將甘露聚糖列為廢棄物，浪費(fèi) 巨大。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種甘露聚糖的制備方法。 本發(fā)明所提供的甘露聚糖的制備方法，包括下述步驟 1) 酶解破壁處理將酵母細(xì)胞壁的懸浮液中加入溶菌酶，在35 4(TC下，酶解30分鐘 1小時(shí)，離心收集沉淀；2) 堿處理將步驟l)得到的酶解后的沉淀，在0.5 1.5 mol/L的NaOH溶液 中，在75 9(TC下，進(jìn)行攪拌處理2 3小時(shí)，然后離心收集上清液；3) 脫脂、去除蛋白將步驟2)得到的上清液進(jìn)行酶法處理或酸法處理后，將 獲得的上清液與質(zhì)量百分濃度為12 20X的CTAB溶液和質(zhì)量百分濃度為0. 3 0. 8% 的硼酸鈉一乙酸鈉緩沖液混合均勻，靜置24 48h，離心，將上清液迸行干燥得到甘 露聚糖；所述酶法處理是將所述步驟2)得到的上清液調(diào)整pH值至中性，加入中性蛋白 酶，在35 4(TC酶解處理2 3小時(shí)后離心收集上清液；所述酸法處理是將所述步驟 2)得到的上清液調(diào)節(jié)pH值至5. 5靜置30分鐘 1小時(shí)后離心收集上清液；所述方法中，所述步驟l)中，所述酶解溫度優(yōu)選為37i:。所述方法中，所述步驟1)中，所述溶菌酶的添加量為0.5 3mg/g (10000 60000U/g)酵母細(xì)胞壁干重，優(yōu)選為lmg/g (20000U/g)酵母細(xì)胞壁干重；所述溶菌 酶在所述酵母細(xì)胞壁的懸浮液中的濃度為2000 12000U/ml，優(yōu)選為4000U/ml。所述方法中，所述步驟l)中，30分鐘 1小時(shí)。優(yōu)選為30分鐘。所述方法中，所述步驟2)中，所述NaOH溶液的濃度優(yōu)選為lmol/L;所述堿處 理的溫度優(yōu)選為85X:，堿處理時(shí)間優(yōu)選為3小時(shí)。所述方法中，所述步驟2)中，所述酶解后的產(chǎn)物干重與所述NaOH溶液的質(zhì)量 /體積比為lg: 5-12ml，優(yōu)選為lg: 5-6ml。所述方法中，所述步驟3)中，所述CTAB溶液的質(zhì)量百分濃度為16%;所述硼 酸鈉一乙酸鈉緩沖液是含有質(zhì)量百分含量為O. 5%的硼酸鈉和質(zhì)量百分含量為0. 5%的 乙酸鈉的緩沖液；所述上清液與CTAB溶液和硼酸鈉一乙酸鈉緩沖液按照體積比為 20: 5: IO的比例混合。所述方法中，所述步驟3)中，所述酸法處理的pH值優(yōu)選為pH5.5，所述調(diào)節(jié) pH值用試劑為乙酸或鹽酸溶液，優(yōu)選為乙酸。所述方法中，所述步驟3)中，所述酶法處理中的調(diào)節(jié)pH值用試劑為O. lmol/L 的鹽酸溶液或質(zhì)量百分含量為36%的HAc溶液；所述酶法處理中的中性蛋白酶的添 加量為3500 10500U/ml上清液，優(yōu)選為3500 U/ml上清液。所述酶法處理的酶解 溫度為37'C，酶解時(shí)間為3小時(shí)。所述方法中，還包括將所述步驟l)收集的沉淀用水洗滌。上述方法中，所述步驟2)中離心得到的沉淀可以用來(lái)制備水不溶性P-1， 3/1,6-
葡聚糖，具體制備方法可為① 酸處理將上述方法中的步驟2)得到的沉淀在體積百分濃度為2 8%的乙 酸溶液中，室溫條件下，攪拌處理2 3小時(shí)，離心收集沉淀；② 脫脂、去除蛋白將步驟①酸處理后離心得到的沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮分別依次重懸攪拌洗滌30分鐘 1小時(shí)，然后靜止30 60分鐘，然后用乙醚重懸攪拌洗 滌30分鐘 1小時(shí)，然后靜置12 24小時(shí)，離心收集沉淀干燥得到水不溶性0 -l，3/l，6-葡聚糖。本發(fā)明采用酶解酵母細(xì)胞壁——堿處理細(xì)胞壁一一酸處理(酶處理)上清液—— 有機(jī)物質(zhì)脫脂去蛋白等具體步驟。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，分別考慮各個(gè)影響因素， 確定參數(shù)的優(yōu)選數(shù)據(jù)范圍，使獲得的甘露聚糖產(chǎn)品具有較高的純度(88.6%)和產(chǎn)率 (18.5%)，產(chǎn)物中蛋白含量、脂肪含量均小于1%。采用酶處理細(xì)胞壁和經(jīng)堿處理 上清液的方法，可大大提高細(xì)胞壁破比率、并降低進(jìn)一步化學(xué)處理的難度，有利于 提高最終產(chǎn)品得率。本發(fā)明的方法一次處理工業(yè)副產(chǎn)物——酵母細(xì)胞壁，可同時(shí)獲 得甘露聚糖和水不溶性e -1, 3/1， 6-葡聚糖。經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證均為適合動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐 中應(yīng)用的免疫調(diào)節(jié)劑。


圖1為甘露聚糖的制備方法流程圖。 圖2為水不溶性P -1， 3/1, 6-葡聚糖的制備方法流程圖。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。 下述實(shí)施例中所述的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。 實(shí)施例1、甘露聚糖的制備及水不溶性0 -1， 3/1， 6-葡聚糖的制備 一、甘露聚糖的制備甘露聚糖的制備操作流程如圖l所示，具體步驟如下所述1、 酵母細(xì)胞壁的酶解將100g酵母細(xì)胞壁(產(chǎn)品購(gòu)自湖北宜昌安琪酵母股份 公司)、100mg (20000U/mg)溶菌酶(源自卵清蛋白，Cayman)和500ml水混合， 37'C條件下用勻速攪拌器中速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，200 300 轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為30分鐘，之后以3000轉(zhuǎn)/分鐘(上海安亭科學(xué)儀器廠， DL6000B型冷凍離心機(jī))離心20分鐘去上清得到95. 3 g沉淀，即為酵母細(xì)胞壁酶解 后的產(chǎn)物。2、 堿處理將步驟1中所得酵母細(xì)胞壁酶解后的產(chǎn)物95. 3 g加入500ml 1MNa0H 溶液中(即按照破壁后的產(chǎn)物干重與1MNa0H溶液的質(zhì)量/體積比約為lg: 5ml的比
例添加)，在85'C條件下用勻速攪拌器中速攪拌(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速 攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)，攪拌時(shí)間為3小時(shí)，然后以3600轉(zhuǎn)/分鐘離心20 分鐘，得到上清液510ml繼續(xù)用于提取甘露聚糖，和29.5g沉淀(用于提取水不溶 性e-1，3/1，6-葡聚糖)。3、 將步驟2所述的堿處理后離心得到的510ml上清液分成兩份，每份255ml， 用O. lmol/L的HCl溶液調(diào)整pH值至中性(體積增至約265ml)。4、 將步驟3中得到調(diào)整pH值至中性的兩份上清液，分別進(jìn)行如下酶法處理或 酸法處理酶法處理在上清液中加入26.5 g (927.5KU, 3500U/ml上清液)中性蛋白酶 (35000U/g)，勻速攪拌器中速攪拌，處理時(shí)間3小時(shí)，處理溫度37。C，酶濃度0. 1 g/mL (3500U/ml)，得到棕黃色懸濁液，離心(離心速度3000 rpm，離心時(shí)間10min) 取上清液待處理。酸法處理將上清液用乙酸溶液(體積百分含量為36%，市售冰乙酸)調(diào)節(jié)pH 值至5.5靜置60分鐘，得棕黃色懸濁液，離心(離心速度2400 rpm，離心時(shí)間10min) 取上清液待處理。5、 將步驟4酶法處理或酸法處理得到的上清液分別與質(zhì)量百分含量為16%的 CTAB溶液和含有質(zhì)量百分含量為0. 5%的硼酸鈉和質(zhì)量百分含量為0. 5%的乙酸鈉的 硼酸鈉一乙酸鈉緩沖液按照體積比為20: 5: 10的比例配成混合溶液，室溫靜止48h， 離心(離心速度3000 rpm，離心時(shí)間10min)，分別取上清液進(jìn)行噴霧干燥，結(jié)果 酶法處理得到18.73 g甘露聚糖粉末，酸法處理得到18.36 g甘露聚糖粉末。6、 對(duì)所得產(chǎn)物純度采用總糖測(cè)定法和薄層層析測(cè)定法確定，結(jié)果表明上述酶法 處理得到的甘露聚糖粉末的純度為88. 49%;上述酶法處理得到的甘露聚糖粉末的純 度為88.71%;得率采用產(chǎn)物量/所用細(xì)胞壁量相比，結(jié)果表明上述酶法處理得到的甘 露聚糖粉末的得率為18. 73%;上述酸法處理得到的甘露聚糖粉末的得率為18. 36%; 分子量按照熒光法(Rinsten， L., T. Stenberg and R. Andersson. 2003. Determination of P-glucan molecular weight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts. Cerea/ C/zem/欣;;,80(4):485-490)測(cè)定，約為30KD。結(jié)構(gòu)檢測(cè)經(jīng)紅外光譜和核磁共振分析如 下所示<formula>formula see original document page 7</formula> 產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和脂肪含量采用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，分別為蛋白含量為0.45%、脂肪 含量為0. 33%。二、水不溶性e-l，3/l，6-葡聚糖的制備上述步驟一中步驟2所述的堿處理后離心并洗滌得到的沉淀用于制備水不溶性 P-1， 3/1， 6-葡聚糖(具體操作流程請(qǐng)見(jiàn)圖2)。具體步驟如下所述1、 酸處理將步驟一中步驟2中所得堿處理后離心得到的沉淀產(chǎn)物用水洗滌三 遍，得到28.7g沉淀。將該沉淀加入300 ml體積百分含量為4%乙酸溶液中(即按 照堿處理后的產(chǎn)物干重與4%乙酸溶液的質(zhì)量/體積比約為lg/10ml的比例添加)， 在室溫條件下用勻速攪拌器(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器)中速(200 300轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為2小時(shí)，之后以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘去上清。 得到22.2g沉淀，將沉淀用水洗滌三遍。將沉淀用水洗滌三遍，得到21.5g沉淀。2、 乙醇洗滌將步驟3中所得酸處理后的產(chǎn)物(21.5g)按照0.2-0.25g產(chǎn)物 (干重)/ml的量加入到無(wú)水乙醇中，室溫(18 25°C)條件下用勻速攪拌器(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器)中速(200 300轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為1 小時(shí)，之后以3000轉(zhuǎn)/分鐘速度離心20分鐘去上清，收集沉淀。3、 丙酮洗滌將步驟4中所得乙醇洗滌后的沉淀產(chǎn)物按照0.2-0.25g產(chǎn)物(干 重)/ml的量加入到無(wú)水丙酮中，室溫條件下用勻速攪拌器(上海標(biāo)本模型廠，驃馬 牌可調(diào)速攪拌器)慢速攪拌(100 150轉(zhuǎn)/分鐘)，攪拌時(shí)間為1小時(shí)，之后以2400 轉(zhuǎn)/分鐘速度離心20分鐘去上清，收集沉淀。4、 乙醚洗滌將步驟5中所得丙酮處理后的沉淀產(chǎn)物按照0.2-0.25g產(chǎn)物(干 重)/ml的量于通風(fēng)櫥中加入到無(wú)水乙醚中，室溫條件下用勻速攪拌器(上海標(biāo)本模 型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器)慢速(100 150轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為l小時(shí)， 之后將容器蓋蓋后室溫靜置12 24小時(shí)。然后，2400轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘去上清， 干燥(氣流吹干或減壓蒸干或冷凍干燥)，得到20. 1 g水不溶性e-l，3/1，6-葡聚 糖。5、 所得產(chǎn)物純度采用總糖測(cè)定法和薄層層析測(cè)定法確定，結(jié)果表明上述得到的 水不溶性3 -1， 3/1, 6-葡聚糖得純度為91. 5%;得率采用產(chǎn)物量/所用細(xì)胞壁量相比， 結(jié)果表明上述得到的水不溶性P -1， 3/1, 6-葡聚糖的得率為20. 1%;分子量按照熒光 法(Rinsten, L., T. Stenberg and R. Andersson. 2003. Determination of卩-glucan molecular weight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts. Cere"/ C/zem/s^y, 80(4):485-490)測(cè)定，約為800 850KD。結(jié)構(gòu)檢測(cè)經(jīng)紅外光譜和核磁共振 分析如下所示
-r-0-D-Gcp-(I，3)- P陽(yáng)D-Gcp-(I，3)陽(yáng)|B-D-Glcp-(1，3)- (3-D-GlcpNAc-l-I(3-D-Glcp-(l，6)-|3-D-Quip-(l,6)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和脂肪含量采用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，分別為蛋白含量為1.15%、脂肪含量為0. 43%。實(shí)施例2、甘露聚糖的制備及水不溶性0 -1， 3/1， 6-葡聚糖的制備 一、甘露聚糖的制備甘露聚糖的制備操作流程如圖l所示，具體步驟如下所述1、 酵母細(xì)胞壁的酶解將50g酵母細(xì)胞壁、lOOmg (20000U/mg)溶菌酶(源自 卵清蛋白，Cayman)和250ml水混合，35。C條件下用勻速攪拌器中速(上海標(biāo)本模 型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為60分鐘，之后 以3000轉(zhuǎn)/分鐘(上海安亭科學(xué)儀器廠，DL6000B型冷凍離心機(jī))離心25分鐘去上 清得到47.80 g沉淀，即為酵母細(xì)胞壁酶解后的產(chǎn)物。2、 堿處理將步驟1中所得酵母細(xì)胞壁酶解后的產(chǎn)物47. 80 g加入500ml 0. 5 M NaOH溶液中(即按照破壁后的產(chǎn)物干重與NaOH溶液的質(zhì)量/體積比為lg: 10ml的比 例添加)，在75。C條件下用勻速攪拌器中速攪拌(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速 攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)，攪拌時(shí)間為3小時(shí)，然后以3600轉(zhuǎn)/分鐘離心20 分鐘，得到上清液510ml繼續(xù)用于提取甘露聚糖，和12.6g沉淀(用于提取水不溶 性1,3/1, 6-葡聚糖)。3、 將步驟2所述的堿處理后離心得到的510ml上清液分成兩份，每份255ml， 用O. lmol/L的HCl溶液調(diào)整pH值至中性(體積增至約265ml)。4、 將步驟3中得到調(diào)整pH值至中性的兩份上清液，分別進(jìn)行如下酶法處理或 酸法處理酶法處理在上清液中加入26.5 g (927.5 KU， 3500U/ml上清液)中性蛋白酶 (35000U/g)，勻速攪拌器中速攪拌，處理時(shí)間2小時(shí)，處理溫度35"C，酶濃度0. lg/mL (3500 U/ml)，得到棕黃色懸濁液，離心(離心速度3000 rpm，離心時(shí)間10 min) 取上清液待處理。酸法處理將上清液用乙酸溶液(體積百分含量為36%，市售冰乙酸)調(diào)節(jié)pH 值至5. 0靜置30分鐘，得棕黃色懸濁液，離心(離心速度2400 rpm，離心時(shí)間10 min) 取上清液待處理。5、 將步驟4酶法處理或酸法處理得到的上清液分別與質(zhì)量百分含量為12%的 CTAB溶液和含有質(zhì)量百分含量為0. 3%的硼酸鈉和質(zhì)量百分含量為0. 3%的乙酸鈉的
硼酸鈉一乙酸鈉緩沖液按照體積比為20: 5: 10的比例配成混合溶液，室溫靜止48h， 離心(離心速度3000 rpm，離心時(shí)間10min)，分別取上清液進(jìn)行噴霧干燥，結(jié)果 酶法處理得到8.82 g甘露聚糖粉末，酸法處理得到8.48 g甘露聚糖粉末。6、所得產(chǎn)物純度采用總糖測(cè)定法和薄層層析測(cè)定法確定，結(jié)果表明上述酸法處 理得到的甘露聚糖粉末的純度為85. 31 %;上述酶法處理得到的甘露聚糖粉末的純度 為85.52 %;得率采用產(chǎn)物量/所用細(xì)胞壁量相比，結(jié)果表明上述酶法處理得到的甘 露聚糖粉末的得率為17.63%，上述酸法處理得到的甘露聚糖粉末的得率為16.95%; 分子量按照熒光法(Rinsten, L., T. Stenberg and R. Andersson. 2003. Determination of |3-glucan molecular weight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts. Cez-ea/ C/zem/W^, 80(4):485-490)測(cè)定，約為30KD。結(jié)構(gòu)檢測(cè)經(jīng)紅外光譜和核磁共振分析如 下所示+a-D-G-(l,6)- a-D-G-(l,6)- a-D-G-(l，6)- a-D-G-1-a-D-G-(l，2)-(或者)a-D-G-(1,3) 產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和脂肪含量采用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，分別為蛋白含量為0.54%、脂肪 含量為0. 39%。二、水不溶性P-1，3/1，6-葡聚糖的制備上述步驟一中步驟2所述的堿處理后離心并洗滌得到的12. 6g沉淀按照實(shí)施例1 的方法制備水不溶性P-l，3/l，6-葡聚糖(具體操作流程請(qǐng)見(jiàn)圖2)，將得到的水不 溶性P -1, 3/1， 6-葡聚糖采用總糖測(cè)定法和薄層層析測(cè)定法確定，結(jié)果表明上述得到 的水不溶性P -1, 3/1， 6-葡聚糖得純度為89. 51 %;得率采用產(chǎn)物量/所用細(xì)胞壁量相 比，結(jié)果表明上述得到的水不溶性P-l,3/l，6-葡聚糖的得率為17.31 %;分子量以 改進(jìn)熒光法(Rinsten， L" T. Stenberg and R. Andersson. 2003. Determination of |3-glucan molecular weight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts. Cere"/ C7^m/欣j;,80(4):485-490)測(cè)定，約為800 850KD。結(jié)構(gòu)檢測(cè)經(jīng)紅外光譜和核磁共振 分析如下所示+0-D-Glcp-(l,3)- (3-D-Glcp-(l,3)- (3-D-Glcp隱(l，3V (3-D-GlcpNAc-卜 I L6(3-D-Glcp-(l,6)-p-D-Quip-(l,6)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和脂肪含量采用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，分別為蛋白含量為1.14%、脂肪含量為0. 52%。實(shí)施例3、甘露聚糖的制備及水不溶性P -1， 3/1， 6-葡聚糖的制備 一、甘露聚糖的制備甘露聚糖的制備操作流程如圖l所示，具體步驟如下所述-1、 酵母細(xì)胞壁的酶解將100g酵母細(xì)胞壁、300 mg (20000U/mg)溶菌酶(源 自卵清蛋白，Cayman)和500ml水混合，4(TC條件下用勻速攪拌器中速(上海標(biāo)本 模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為30分鐘，之 后以3000轉(zhuǎn)/分鐘(上海安亭科學(xué)儀器廠，DL6000B型冷凍離心機(jī))離心20分鐘去 上清得到95.4g沉淀，即為酵母細(xì)胞壁酶解后的產(chǎn)物。2、 堿處理將步驟1中所得酵母細(xì)胞壁酶解后的產(chǎn)物95. 4 g加入1000ml 1. 0 M NaOH溶液中(即按照破壁后的產(chǎn)物干重與NaOH溶液的質(zhì)量/體積比約為lg: 10 ral 的比例添加)，在9(TC條件下用勻速攪拌器中速攪拌(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可 調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)，攪拌時(shí)間為2.5小時(shí)，然后以3600轉(zhuǎn)/分鐘離 心20分鐘，得到上清液510ml繼續(xù)用于提取甘露聚糖，和28.7 g沉淀(用于提取 水不溶性P-l,3/1，6-葡聚糖)。3、 將步驟2所述的堿處理后離心得到的510ml上清液分成兩份，每份255ml， 用O. lmol/L的HCl溶液調(diào)整pH值至中性(體積增至約265ml)。4、 將步驟3中得到調(diào)整pH值至中性的兩份上清液，分別進(jìn)行如下酶法處理或 酸法處理酶法處理在上清液中加入79. 5 g (2782. 5 KU， 10500U/ml上清液)中性蛋白 酶(35000U/g)，勻速攪拌器中速攪拌，處理時(shí)間2小時(shí)，處理溫度4(TC，酶濃度 0.3g/mL (腳0U/ml)，得到棕黃色懸濁液，離心(離心速度3000 rpm，離心時(shí)間 10min)取上清液待處理。酸法處理將上清液用乙酸溶液(體積百分含量為36%)調(diào)節(jié)pH值至5.5靜置 40分鐘，得棕黃色懸濁液，離心(離心速度2400 rpm，離心時(shí)間10min)取上清液 待處理。5、 將步驟4酶法處理或酸法處理得到的上清液分別與質(zhì)量百分含量為20%的 CTAB溶液和含有質(zhì)量百分含量為0. 8%的硼酸鈉和質(zhì)量百分含量為0. 8%的乙酸鈉的 硼酸鈉一乙酸鈉緩沖液按照體積比為20: 5: 10的比例配成混合溶液，室溫靜止48h， 離心(離心速度3000 rpm，離心時(shí)間10min)，分別取上清液進(jìn)行噴霧干燥，結(jié)果 酶法處理得到17.25 g甘露聚糖粉末，酸法處理得到17. 13 g甘露聚糖粉末。6、 所得產(chǎn)物純度采用總糖測(cè)定法和薄層層析測(cè)定法確定，結(jié)果表明上述酸法處 理得到的甘露聚糖粉末的純度為86.63%;上述酶法處理得到的甘露聚糖粉末的純度 為86.47 %;得率采用產(chǎn)物量/所用細(xì)胞壁量相比，結(jié)果為表明上述酶法得到的甘露 聚糖粉末的得率為17. 25 %，酸法得率為17. 13%;分子量按照改進(jìn)熒光法(Rinsten, L., T. Stenberg and R. Andersson. 2003. Determination of (3-glucan molecular weight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts. Cerea/ C7 ew/欲乂 80(4):485-490)觀!j定， 約為30KD。結(jié)構(gòu)檢測(cè)經(jīng)紅外光譜和核磁共振分析如下所示-r-a-D-G-(l,6)- a-D-G-(l,6)- a-D-G-(l，6)- a層D-G-l-a-D-G-(l,2)-(或者)a-D-G-(1,3)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和脂肪含量采用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，分別為蛋白含量為0.41%、脂肪 含量為0. 39%。二、水不溶性0-1，3/1,6-葡聚糖的制備上述步驟一中步驟2所述的堿處理后離心并洗滌得到的28. 7g沉淀按照實(shí)施例1 的方法制備水不溶性e-1,3/1, 6-葡聚糖(具體操作流程請(qǐng)見(jiàn)圖2)，將得到的水不 溶性e -1， 3/1， 6-葡聚糖采用總糖測(cè)定法和薄層層析測(cè)定法確定，結(jié)果表明上述得到 的水不溶性P -1, 3/1， 6-葡聚糖得純度為90. 37 %;得率采用產(chǎn)物量/所用細(xì)胞壁量相 比，結(jié)果表明上述得到的水不溶性e-l，3/l，6-葡聚糖的得率為18.54 %;分子量按 ,照、改進(jìn)熒光f去(Rinsten, L.， T. Stenberg and R. Andersson. 2003. Determination of P-glucan molecular weight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts. Ce/-ea/ C/zem/W 80(4):485-490)測(cè)定，約為800 850KD。結(jié)構(gòu)檢測(cè)經(jīng)紅外光譜和核磁共振 分析如下所示-「-p-D-Glcp-(l，3)- P-D-Glcp-(1,3)- (3-D-Glcp-(l，3)- 0-D-GlcpNAc-卜 I L6卩隱D-Glcp-( 1,6)-P-D-Quip-( 1,6)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和脂肪含量采用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，分別為蛋白含量為1.04%、脂肪含量為0. 40%。
權(quán)利要求
1、一種甘露聚糖的制備方法，包括下述步驟1)酶解處理將酵母細(xì)胞壁的懸浮液中加入溶菌酶，在35～40℃下，酶解，離心收集沉淀；2)堿處理將步驟1)得到的酶解后的沉淀，在0.5～1.5mol/L的NaOH溶液中，在75～90℃下，進(jìn)行攪拌處理2～3小時(shí)，然后離心收集上清液；3)將步驟2)得到的上清液進(jìn)行酶法處理或酸法處理后，將獲得的上清液與質(zhì)量百分濃度為12～20％的CTAB溶液和質(zhì)量百分濃度為0.3～0.8％的硼酸鈉-乙酸鈉緩沖液混合均勻，靜置24～48h，離心，將上清液進(jìn)行干燥得到甘露聚糖；所述酶法處理是將所述步驟2)得到的上清液調(diào)整pH值至中性，加入中性蛋白酶，在35～40℃酶解處理2～3小時(shí)后離心收集上清液；所述酸法處理是將所述步驟2)得到的上清液調(diào)節(jié)pH值至5.5靜置30～60分鐘后離心收集上清液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，所述酶解溫度 為37°C。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，所述溶菌酶的 添加量為10000 60000U/g酵母細(xì)胞壁干重，優(yōu)選為20000u/g酵母細(xì)胞壁干重；所 述溶菌酶在所述酵母細(xì)胞壁的懸浮液中的濃度為2000 12000U/ml，優(yōu)選為 4000U/ml。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，所述酶解時(shí)間 為30 60分鐘，優(yōu)選為30分鐘。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述NaOH溶 液的濃度為lmol/L;所述堿處理的溫度為85t:，堿處理時(shí)間為3小時(shí)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述酶解后的 產(chǎn)物干重與所述NaOH溶液的質(zhì)量/體積比為lg: 5 12ml，優(yōu)選為lg: 5-6ml。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，所述CTAB溶 液的質(zhì)量百分濃度為16%;所述硼酸鈉一乙酸鈉緩沖液是含有質(zhì)量百分含量為0.5% 的硼酸鈉和質(zhì)量百分含量為0. 5%的乙酸鈉的緩沖液；所述上清液與CTAB溶液和硼酸 鈉一乙酸鈉緩沖液按照體積比為20: 5: 10的比例混合。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，所述酸法處理 的pH值為pH5.5，所述調(diào)節(jié)pH值用試劑為乙酸溶液或鹽酸溶液，優(yōu)選為乙酸溶液。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，所述酶法處理 中的調(diào)節(jié)pH值用試劑為0. lmol/L的鹽酸溶液或質(zhì)量百分含量為36%的HAc溶液；所 述酶法處理中的中性蛋白酶的添加量為3500 10500U/ml上清液，優(yōu)選為3500 U/ml 上清液；所述酶法處理的酶解溫度為37X:，酶解時(shí)間為3小時(shí)。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法中，還 包括將所述步驟l)收集的沉淀用水洗滌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種甘露聚糖的制備方法。該方法，包括下述步驟1)酶解破壁處理將酵母細(xì)胞壁的懸浮液中加入溶菌酶，在35～40℃下，酶解，離心收集沉淀；2)堿處理將步驟1)得到的酶解后的沉淀，在NaOH溶液中，在75～90℃下，進(jìn)行攪拌處理，然后離心收集上清液；3)將步驟2)得到的上清液進(jìn)行酶法處理或酸法處理后，將獲得的上清液與質(zhì)量百分濃度為CTAB溶液和質(zhì)量百分濃度為0.3～0.8％的硼酸鈉-乙酸鈉緩沖液混合均勻，靜置24～48h，離心，將上清液進(jìn)行干燥得到甘露聚糖；本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，分別考慮各個(gè)影響因素，確定參數(shù)的優(yōu)選數(shù)據(jù)范圍，使獲得的甘露聚糖產(chǎn)品具有較高的純度和產(chǎn)率，產(chǎn)物中蛋白含量、脂肪含量均小于1％。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101117358SQ200710121860
公開(kāi)日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2007年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月17日
發(fā)明者咼于明, 博 張 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)