專利名稱：光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的方法及傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測技術(shù)領(lǐng)域，是通過光電化學(xué)方法對(duì)化學(xué)物質(zhì)的基因毒 性進(jìn)行定性定量檢測的一種光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的方法及傳感器。
背景技術(shù)：
隨著我國工業(yè)化程度的提高，大量的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入生態(tài)環(huán)境。據(jù)統(tǒng)計(jì)，
已合成的化學(xué)物質(zhì)總計(jì)近10萬，而且每年還有新合成化合物IOOO種。這
些物質(zhì)對(duì)人體有潛在的危害，其中一些化合物已經(jīng)被證實(shí)具有致突變、致 癌、致畸變等遺傳毒性。目前評(píng)定化合物對(duì)機(jī)體的毒性作用，主要是通過 細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)周期長，人力、物力耗費(fèi)大，而且無法在 分子水平上準(zhǔn)確提供關(guān)于化合物結(jié)構(gòu)與毒性關(guān)系的信息。核酸損傷的分子
標(biāo)記物，如DNA加和物和氧化產(chǎn)物，可以通過色譜/質(zhì)譜等分離-檢測聯(lián)用 技術(shù)準(zhǔn)確測量。這種方法要求對(duì)核酸樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，而且需要復(fù) 昂貴的大型儀器。上述這些原因致使絕大部分化學(xué)物質(zhì)沒有毒性測試數(shù) 據(jù)，國家的環(huán)境安全和人民群眾的生活質(zhì)量受到嚴(yán)重威脅。
近年來，隨著分子生物學(xué)和分子毒理學(xué)的迅速發(fā)展，各種新興的分子 生物學(xué)技術(shù)和生物分子標(biāo)志物被用于核酸損傷檢測，其中包括單細(xì)胞凝膠
電泳技術(shù)(即彗星試驗(yàn))、DNA加合物測定(免疫法、熒光法和32P-后標(biāo)記 法)和基因傳感器技術(shù)(參考，周啟星等，生態(tài)毒理學(xué)，科學(xué)出版社，2004)。 上面大多數(shù)都是細(xì)胞試驗(yàn)，雖然周期從動(dòng)物試驗(yàn)的幾個(gè)月縮短到幾天，但 時(shí)間仍然偏長。而且試驗(yàn)涉及多個(gè)步驟，操作需要專業(yè)人員在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室 進(jìn)行，沒有并行性，不適合環(huán)境化合物的大規(guī)模篩查?；騻鞲衅骷夹g(shù)具 有高通量、高并行性的優(yōu)勢，不過涉及到復(fù)雜的樣品前處理(核酸提取和 標(biāo)記)、探針設(shè)計(jì)和嚴(yán)格的雜交條件，加上復(fù)雜、昂貴的光學(xué)檢測儀器， 不禾U于普及、推廣(參考E. F. Nuwaysir等，Molecular Carcinogenesis， 24: 153 (1999))。
因此，有必要研究簡單、快速的遺傳毒性檢測方法和傳感技術(shù)，對(duì)已 經(jīng)存在的和新合成的化學(xué)物質(zhì)的毒性進(jìn)行大規(guī)模篩査。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的方法，該方法 可以定性定量的確定待測分析物的基因毒性。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是 一種光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的方法，包括
(a) 將可能具有基因毒性的分析物與核酸接觸；
(b) 如果待測分析物需要活化后才表現(xiàn)出基因毒性，則用相應(yīng)的酶作為 活化劑；
(c) 用光電化學(xué)活性分子作為信號(hào)指示劑；
(d) 評(píng)價(jià)所述分析物和核酸之間的結(jié)合和/或反應(yīng)，即在電極存在的情況
下，評(píng)價(jià)光電信號(hào)分子在光的作用下和電極之間電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流， 根據(jù)核酸和分析物接觸前后光電流響應(yīng)的不同，對(duì)所述分析物的基因毒性 進(jìn)行定性或定量分析。
所述分析物為單環(huán)芳烴、多環(huán)芳烴、芳香胺類化合物、N-亞硝胺類化 合物、黃曲霉素或其代謝物。
所述分析物為金屬離子、非金屬離子，包括鎘、鎳、鈷、鐵、銅、 汞、鉛、硒、砷、磷、氯等，或其有機(jī)、無機(jī)化合物。
所述核酸，為核糖核酸、脫氧核糖核酸或寡核苷酸。
所述電極為二氧化錫電極，所述光電活性分子是金屬與有機(jī)配體的絡(luò) 合物。所述的金屬為釕或鋨，所述的有機(jī)配體為聯(lián)吡啶、連吡嗪、聯(lián)三 吡啶、菲酚、酞氰染料、取代的聯(lián)吡啶、取代的連吡嗪、取代的聯(lián)三吡啶 或取代的菲酚。
所述分析物活化，為所有酶參與的可將間接基因毒性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為直接
基因毒性物質(zhì)的反應(yīng)；或所有酶參與的可催化產(chǎn)生H202的反應(yīng)，H202 和分析物質(zhì)一起作用，具有基因毒性。
所述將間接基因毒性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為直接基因毒性物質(zhì)的酶，為細(xì)胞色素 P450、血紅蛋白、肌紅蛋白或辣根過氧化酶；所述可催化產(chǎn)生H202的酶 為氧化酶，包括葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸 氧化酶、L-a-羥基酸氧化酶、單胺氧化酶或黃嘌呤氧化酶。
所述評(píng)價(jià)分析物和核酸之間的結(jié)合和/或反應(yīng)，為所有改變核酸結(jié)構(gòu)的 結(jié)合和/或反應(yīng)，包括核酸堿基脫落、堿基垸基化、堿基氧化修飾、鏈斷裂、 鏈交聯(lián)、嵌入劑嵌入核酸堿基。
所述評(píng)價(jià)為在電極和再生劑存在的情況下用光將具有光電化學(xué)活性 的分子轉(zhuǎn)化成激發(fā)態(tài)，并且測定激發(fā)分子和電極之間的電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的 電流。電子轉(zhuǎn)移后產(chǎn)生的處于基態(tài)的被氧化或被還原的光電化學(xué)活性分子 被再生劑還原或氧化再生，可以被再次激發(fā)。核酸現(xiàn)場損傷前后結(jié)合光電 信號(hào)分子的量不同，產(chǎn)生的光電流也就不同，評(píng)價(jià)核酸現(xiàn)場損傷前后光電 流的變化。或在電極的情況下用光將具有光電化學(xué)活性的分子轉(zhuǎn)化成激發(fā) 態(tài)，被激發(fā)的物質(zhì)失去電子后，與核酸堿基進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，評(píng)價(jià)核酸 現(xiàn)場損傷前后氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的電流的變化。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的傳感
器0
光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的傳感器，包括
(a) 在合適條件下可以與分析物結(jié)合或反應(yīng)的核酸探針；
(b) 具有光電化學(xué)活性的信號(hào)分子；
(c) 可以將間接基因毒性物質(zhì)活化的酶；
(d) 適合分析光電信號(hào)分子與電極之間的電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流的
電極；
(e) 電化學(xué)池，該池壁可以讓激發(fā)信號(hào)分子的光透過；
(f) 發(fā)光裝置，該裝置具有能激發(fā)信號(hào)分子的光源。 所述核酸探針、光電信號(hào)分子、酶等組分需組裝于電極表面，不限制
其組裝順序，根據(jù)需要還可以組裝上其它組分，如蛋白分子、聚合物、 納米粒子等。
所述組裝方式包括物理吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法或?qū)訉?br> 自組裝法。
所述發(fā)光裝置的光源為中空的陰極燈、氙弧燈、氙汞燈、金屬鹵化 物、發(fā)光二極管或激光
本發(fā)明的檢測方法，是簡單、快速的遺傳毒性檢測方法，該檢測方法 使用的光電化學(xué)核酸傳感器制作簡單、實(shí)用。


圖1為不同核苷酸修飾的Sn02/avidin-Ru電極的光電流響應(yīng)(a) poly—G， (b) ss-DNA， (c) poly—A， (d) ds—DNA， (e) poly—C, (f) poly—U
和(g)無核苷酸修飾；
圖2為修飾電極Sn(Vavidin-Ru/ds-DNA/PDDA/GOx檢測金屬離子基因
毒性的示意圖3為修飾電極Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/PDDA/GOx和以下試劑反應(yīng) 后的光電流響應(yīng)(a) Fe27葡萄糖，(b) Fe2+， (c)葡萄糖；
圖4為修飾電極Sn(Vavidin-Ru/ds-DNA/Hb檢測有機(jī)污染物苯乙烯潛 在基因毒性的示意圖5為修飾電極Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/Hb和以下試劑反應(yīng)后的光 電流響應(yīng)(a)苯乙烯/雙氧水(b)苯乙烯(c)雙氧水；
圖6為信號(hào)分子Ru(bpy)2(dppz)2+對(duì)不同核苷酸修飾的Sn02/avidin 電極的光電流響應(yīng)(a) ds-DNA; (b) ss-DNA; (c) poly-C， (d)無核苷酸；
圖7為修飾電極Sn02/PDDA/GOx/PDDA/ds-DNA檢測金屬離子基因毒性 的示意圖8為修飾電極Sn02/PDDA/G0x/PDDA/ds-DNA和以下試劑反應(yīng)后的光 電流響應(yīng)(a)葡萄糖，(b) Fe2+, (c) Fe"/葡萄糖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明一種光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的傳感器，包括電極；其在電 極表面，有序地設(shè)置光電信號(hào)分子、核酸和酶三個(gè)組分。 光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的傳感器，至少應(yīng)包括
(a) 在合適條件下可以與分析物結(jié)合或反應(yīng)的核酸探針；
(b) 具有光電化學(xué)活性的信號(hào)分子；
(c) 可以將間接基因毒性物質(zhì)活化的酶；
(d) 適合分析光電信號(hào)分子與電極之間的電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流的
電極；
(e) 電化學(xué)池，該池壁可以讓激發(fā)信號(hào)分子的光透過；
(f) 發(fā)光裝置，該裝置具有能激發(fā)信號(hào)分子的光源。 該核酸探針、光電信號(hào)分子、酶等組分需組裝于電極表面，不限制其
組裝順序，根據(jù)需要還可以組裝上其它組分，如蛋白分子、聚合物、納 米粒子等。
該核酸探針、光電信號(hào)分子、酶的組裝方式包括物理吸附法、共價(jià)結(jié) 合法、交聯(lián)法、包埋法或?qū)訉幼越M裝法。
該發(fā)光裝置的光源為中空的陰極燈、氙弧燈、氙汞燈、金屬鹵化物、 發(fā)光二極管或激光。 本發(fā)明一種光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的方法，用以評(píng)價(jià)待檢測物質(zhì) 的基因毒性；其酶反應(yīng)將相應(yīng)的待檢測化合物轉(zhuǎn)化為活性中間體，導(dǎo)致核 酸損傷，或者酶反應(yīng)產(chǎn)生雙氧水和待檢測物質(zhì)一起作用造成核酸損傷，根 據(jù)核酸損傷前后傳感器光電流響應(yīng)的不同，對(duì)待檢測樣品的基因毒性進(jìn)行 定性或定量分析。
當(dāng)用相應(yīng)波長的光照射修飾于傳感器上的信號(hào)分子時(shí)，基態(tài)電子會(huì)吸 收光能量，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)電子有很強(qiáng)的活性可以很容易的 失去。例如，從它可以從受激信號(hào)分子轉(zhuǎn)移到具有較低能量的半導(dǎo)體電極 上，形成光電流，信號(hào)分子因失去一個(gè)電子變?yōu)檠趸瘧B(tài)。核酸的某些堿基
鳥嘌呤、腺嘌呤、8-氧化-鳥嘌呤、8-氧化-腺嘌呤和6-巰基-鳥嘌呤的氧 化還原電位比較低，可以作為還原劑使信號(hào)分子再生，從而參與到下一輪 的光電反應(yīng)中，使光電流增強(qiáng)。然而，完好未損傷的雙鏈DNA的堿基被它 的雙鏈嚴(yán)密的保護(hù)起來，使其很難參與到氧化還原反應(yīng)中，因此，未損傷 的ds-DNA的催化增強(qiáng)光電流的能力非常有限。若待檢測物質(zhì)具有基因毒 性，當(dāng)與核酸傳感器接觸后，傳感器上的DNA被損傷，它雙螺旋結(jié)構(gòu)遭到 破壞，堿基被不同程度的暴漏出來，使其更加容易的參與光電反應(yīng)，增強(qiáng) 光電流。這就為檢測化學(xué)物質(zhì)的基因毒性提供了理論基礎(chǔ)。
在這里，核酸分子修飾到半導(dǎo)體電極的最外層，選擇可以識(shí)別不同核 酸結(jié)構(gòu)的指示劑作為信號(hào)分子，例如二聯(lián)吡啶二吡啶并[3，2-a; 2' ,3' -c]吩嗪釕(Ru(bpy)2dppz2+)，分子中的dppz配體可以嵌入到ds-DNA的相 鄰堿基對(duì)中，這種和DNA的嵌入作用具有高選擇性和高親和性(結(jié)合系數(shù):
K=106-107 M—')。修飾到電極表面的核酸被具有基因毒性的試劑損傷后， 結(jié)合信號(hào)分子的位點(diǎn)減少，因此電極上信號(hào)分子減少，伴隨著光電流的減 弱，基于此可以定性定量的分析待檢測物質(zhì)的基因毒性。
本發(fā)明光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的方法，可以對(duì)下述環(huán)境污染物進(jìn) 行檢測
包括單環(huán)芳烴、多環(huán)芳烴或其代謝物。金屬離子包括鎘、鎳、鈷、 鐵或銅。
實(shí)施例1
信號(hào)分子聯(lián)吡啶釕的催化光電流。
將琥珀酰胺(NHS)活化的聯(lián)吡啶釕信號(hào)分子共價(jià)標(biāo)記于抗生素蛋白
avidin上，組合成avidin-Ru。在室溫下將10 u L的avidin-Ru溶液均勻 鋪展在制備好的納米Sn02電極表面，靜止吸附1小時(shí)，取出水搖洗5分鐘， 氮?dú)獯蹈桑玫絘vidin-Ru修飾的半導(dǎo)體電極，Sn02/avidin-Ru。用同樣 的方法將不同的核苷酸修飾到電極表面，如雙鏈DNA (ds-DNA)、單鏈 DNA (ss-DNA)、聚鳥嘌呤核苷酸(polyG)、聚胸腺嘌呤核苷酸(polyA)、 聚胞嘧啶核苷酸(polyC)、聚尿嘧啶核苷酸(polyU)。再將各種核苷酸修 飾的半導(dǎo)體電極傳感器置于電解池中，在磷酸緩沖液中檢測光電流，所用 電化學(xué)工作站為CHI 630A，基于時(shí)間模式下進(jìn)行檢測，光源為473nm的藍(lán) 色激光，參比電極為Ag/AgCl，對(duì)電極為鉑電極。不同核苷酸修飾電極的 光電流響應(yīng)見圖1，可以看出，由于鳥嘌呤的還原作用，可以使信號(hào)分子 釕的絡(luò)合物循環(huán)再生，因此，polyG修飾的電極的得到最強(qiáng)的催化光電流，
polyli和polyC由于沒有催化作用，因此沒有表現(xiàn)出增強(qiáng)的光電流；另外， 和ds-DNA相比較，ss-DNA由于具有更加開放式的結(jié)構(gòu)，因此也表現(xiàn)出較 強(qiáng)的催化電流。這說明組裝的核酸傳感器可以區(qū)別出不同的核酸結(jié)構(gòu)，這 就為檢測核酸損傷和分析化合物的基因毒性提供了可行性。
實(shí)施例2
修飾電極Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/PDDA/G0x檢測金屬離子Fe"的基因 毒性。
將avidin-Ru、 ds-DNA、聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)、葡萄糖 氧化酶(G0x)按實(shí)施例1所述方法依次組裝于半導(dǎo)體電極表面，得到修 飾好的傳感器電極:Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/PDDA/GOx，見圖2。將修飾 好的傳感器置于lmM FeS04/50mM葡萄糖溶液中，在37°C，反應(yīng)lh。溶液 中葡萄糖在這里用來和組裝在電極上的葡萄糖氧化酶反應(yīng)，產(chǎn)生雙氧水， 雙氧水可以和Fe2+發(fā)生Fenton反應(yīng)產(chǎn)生高活性氧，損傷核酸，這是體內(nèi)金 屬離子展現(xiàn)基因毒性的主要途徑。反應(yīng)結(jié)束后電極取出，水沖洗，氮?dú)獯?干，置于20mM磷酸緩沖液中檢測光電流，單獨(dú)的FeS04和葡萄糖溶液作為 對(duì)照，檢測結(jié)果見圖3，從圖中可以看出，在Fe27葡萄糖中反應(yīng)后，光電 流增強(qiáng)了 10倍多，這說明葡萄糖氧化酶修飾電極Sn02/avidin-Ru /ds-DNA/PDDA/GOx可以用來檢測金屬離子的基因毒性。
'實(shí)施例3
修飾電極Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/Hb用來檢測苯乙烯的潛在基因毒
性。
將avidin-Ru、 ds-DNA、血紅蛋白(hemoglobin, Hb)按實(shí)施例l所述
方法依次組裝到半導(dǎo)體電極表面，得到修飾傳感器電極 Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/Hb，見圖4。在這里，血紅蛋白可以在雙氧水的
作用下將苯乙烯轉(zhuǎn)化為具有基因毒性的氧化苯乙烯，造成核酸的損傷，類 似于苯乙烯在人體肝臟內(nèi)的代謝，這也是大部分有機(jī)物的體內(nèi)核酸損傷途 徑，即在生物體內(nèi)首先被肝臟中的細(xì)胞色素P450酶催化轉(zhuǎn)化為活性代謝 物，再與核酸的堿基共價(jià)結(jié)合形成加合物，造成核酸的損傷。制備好的傳 感器電極Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/Hb置于2mM H202/2%苯乙烯溶液中，在 37。C下反應(yīng)3小時(shí)，單獨(dú)的HA和苯乙烯作為對(duì)照，電極取出后，水沖洗， 氮?dú)獯蹈?，?0raM的磷酸緩沖液中檢測光電流，檢測結(jié)果見圖5。從圖中 可以明顯的看出，在H2(V苯乙烯中作用后的傳感器光電流有非常明顯的增 強(qiáng)，這說明血紅蛋白修飾傳感器電極Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/Hb可以用來 檢測有機(jī)化合物苯乙烯的潛在基因毒性。
實(shí)施例4
信號(hào)分子二聯(lián)吡啶二吡啶并[3， 2-a; 2， ， 3， -c]吩嗪釕(Ru (bpy) 2dpPz2+
對(duì)不同核苷酸的光電流響應(yīng)。
按實(shí)施例1所述方法，分別將ds-DNA、ss-DNA和polyC組裝到avidin 封閉的半導(dǎo)體電極上，得到三種核苷酸修飾的電極。將50mM的信號(hào)分子 Ru(bpy)2d卯^+溶液均勻鋪展在核苷酸修飾好的電極上，室溫下吸附30分 鐘，電極取出后，水沖洗掉未和核酸結(jié)合的信號(hào)分子，氮?dú)獯蹈?，?0mM
的草酸緩存液(pH5.8)中檢測光電流，在這里，草酸用來催化增強(qiáng)光電 流信號(hào)。光電流響應(yīng)見圖6，從圖中可以看出，由于信號(hào)分子可以識(shí)別單 雙鏈，ds-DNA修飾的電極得到最強(qiáng)的光電流信號(hào)，其次是ss-函A和polyC， 這說明信號(hào)分子Ru(bpy)2dppz2+可以識(shí)別電極表面核酸結(jié)構(gòu)的變化。
實(shí)施例5
傳感器電極Sn02/PDDA/GOx/PDDA/ds-DNA用來檢測金屬離子的基因毒性。
按實(shí)施例l所述方法，將PDDA、葡萄糖氧化酶、PDDA和ds-DNA依次 修飾到半導(dǎo)體Sn02電極表面，得到組裝好的傳感器電極 Sn02/PDDA/GOx/PDDA/ds-DNA，見圖7。將修飾電極置于lmM FeS04/50mM葡 萄糖試劑中，37T下反應(yīng)l小時(shí)，電極取出，水沖洗，氮?dú)獯蹈桑瑢?0mM 的信號(hào)分子Ru(bpy)2dppz2+溶液均勻鋪展于修飾好的電極表面，反應(yīng)30分 鐘，水沖洗掉未結(jié)合的信號(hào)分子，氮?dú)獯蹈?，置?0mM的草酸緩沖液(pH 5.8)中檢測光電流。單獨(dú)的FeSO,或葡萄糖溶液作為對(duì)照。光電流響應(yīng)見 圖8，從圖中可以看出，單獨(dú)的FeSO,或葡萄糖溶液處理過的核酸傳感器 的光電流最強(qiáng)，達(dá)到500nA，大約是FeS(V葡萄糖中反應(yīng)過的傳感器的5 倍，這說明，F(xiàn)eS(V葡萄糖造成了傳感器表面核酸的損傷，并被快速、靈 敏的檢測出來，該核酸傳感器可以用來檢測金屬離子Fe2+的基因毒性。
權(quán)利要求
1. 一種光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的方法，其特征在于，包括(a)將待測分析物與核酸接觸；(b)如果待測分析物需要活化后才表現(xiàn)出基因毒性，則用相應(yīng)的酶作為活化劑；(c)用光電化學(xué)活性分子作為信號(hào)指示劑；(d)評(píng)價(jià)所述分析物和核酸之間的結(jié)合和/或反應(yīng)，即在電極存在的情況下，評(píng)價(jià)光電信號(hào)分子在光的作用下和電極之間電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流，根據(jù)核酸和分析物接觸前后光電流響應(yīng)的不同，對(duì)所述分析物的基因毒性進(jìn)行定性或定量分析。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物為單環(huán)芳烴、多 環(huán)芳烴、芳香胺類化合物、N-亞硝胺類化合物、黃曲霉素或其代謝物。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物為金屬離子、非 金屬離子，包括鎘、鎳、鈷、鐵、銅、汞、鉛、硒、砷、磷、氯， 或其有機(jī)、無機(jī)化合物。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸，為核糖核酸、脫 氧核糖核酸或寡核苷酸。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述電極為二氧化錫電極；光電活性分子是金屬與有機(jī)配體的絡(luò)合物。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述金屬為釕或鋨；有機(jī)配 體為聯(lián)吡啶、連吡嗪、聯(lián)三吡啶、菲酚、酞氰染料、取代的聯(lián)吡啶、 取代的連吡嗪、取代的聯(lián)三吡啶或取代的菲酚。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶能夠?qū)㈤g接基因毒性 物質(zhì)轉(zhuǎn)化為直接基因毒性物質(zhì)，或酶催化產(chǎn)生仏02， ^02和分析物質(zhì)一 起作用，具有基因毒性。
8. 如權(quán)利要求7所述的酶，其特征在于，所述酶，為細(xì)胞色素P450、血 紅蛋白、肌紅蛋白、辣根過氧化酶、葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、L-a-羥基酸氧化酶、單胺氧化酶 或黃嘌呤氧化酶。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物和核酸之間的結(jié) 合和/或反應(yīng)，包括核酸堿基脫落、堿基烷基化、堿基氧化修飾、鏈斷 裂、鏈交聯(lián)、嵌入劑嵌入核酸堿基。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述評(píng)價(jià)為在電極存在的情 況下，根據(jù)核酸現(xiàn)場損傷前后結(jié)合光電信號(hào)分子的量不同，評(píng)價(jià)光電 流信號(hào)的變化。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述評(píng)價(jià)為在電極的情況下 用光將具有光電化學(xué)活性的分子轉(zhuǎn)化成激發(fā)態(tài)，被激發(fā)的物質(zhì)失去電 子后，與核酸堿基進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，評(píng)價(jià)核酸現(xiàn)場損傷前后氧化還 原反應(yīng)所產(chǎn)生的電流的變化。
12.—種光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的傳感器，其特征在于，包括(a) 與分析物結(jié)合或反應(yīng)的核酸探針；(b) 具有光電化學(xué)活性的信號(hào)分子；(C)將間接基因毒性物質(zhì)活化的酶；(d) 適合分析光電信號(hào)分子與電極之間的電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流的電 極；(e) 電化學(xué)池，該池壁讓激發(fā)信號(hào)分子的光透過；(f) 發(fā)光裝置，該裝置具有能激發(fā)信號(hào)分子的光源。
13. 如權(quán)利要求12所述的光電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述核酸探針、 光電信號(hào)分子、酶組分需組裝于電極表面，不限制其組裝順序，根據(jù) 需要還在電極表面組裝上其它組分。
14. 如權(quán)利要求13所述的光電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述其它組分， 為蛋白分子、聚合物、納米粒子。
15. 如權(quán)利要求13所述的光電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述組裝方式包 括物理吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法或?qū)訉幼越M裝法。
16. 如權(quán)利要求13所述的傳感器，其特征在于，所述發(fā)光裝置的光源為 中空的陰極燈、氙弧燈、氙汞燈、金屬鹵化物、發(fā)光二極管或激光。
全文摘要
本發(fā)明一種光電化學(xué)檢測核酸現(xiàn)場損傷的方法及傳感器，提供一種簡單、快速、靈敏的檢測化學(xué)物質(zhì)基因毒性的方法。該方法包括(a)將可能具有基因毒性的分析物與核酸接觸；(b)如果待測分析物需要活化后才表現(xiàn)出基因毒性，則用相應(yīng)的酶作為活化劑；(c)用光電化學(xué)活性分子作為信號(hào)指示劑；(d)評(píng)價(jià)所述分析物和核酸之間的結(jié)合和/或反應(yīng)，即在電極存在的情況下，評(píng)價(jià)光電信號(hào)分子在光的作用下和電極之間電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流，根據(jù)核酸和分析物接觸前后光電流響應(yīng)的不同，對(duì)所述分析物的基因毒性進(jìn)行定性或定量分析。本發(fā)明方法及傳感器應(yīng)用于工業(yè)化學(xué)品的毒性篩查、環(huán)境污染物的毒性檢測、合成藥物的毒性測試以及環(huán)境毒性學(xué)研究等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101393146SQ20071012197
公開日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2007年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月19日
發(fā)明者梁敏敏, 郭良宏 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心