專利名稱：從蛹蟲草中提取精制蟲草素和蟲草多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從蛹蟲草中提取精制蟲草素和蟲草多糖的方法，屬于醫(yī)藥保健、化 工領(lǐng)域?？傮w上涉及物質(zhì)的提取、分離，更具體地講，本發(fā)明涉及一種從蛹蟲草中提取 精制蟲草素和蟲草多糖的方法。二背景技術(shù)：
蛹蟲草是一種名貴的中藥材，性平味甘，具有滋肺補腎、止血化痰的功效。近年來 的研究結(jié)果表明，蛹蟲草是冬蟲夏草的重要人工替代品之一，其在降血脂，防治動脈硬 化，保護心、腦組織，鎮(zhèn)靜催眠，增強巨噬細胞活性，抗癌、抗炎、抗菌、抗缺氧等方 面具有良好功效。蛹蟲草的功能性成分、藥理藥效作用與天然冬蟲夏草基本一致，其子 實體富含蟲草素和蟲草多糖等重要的生理活性成分。據(jù)現(xiàn)代科學(xué)論證蟲草素是一種具 有抗菌活性的核苷類物質(zhì)，對多聚腺苷酸聚合酶有很強的抑制作用，能抑制癌細胞的生長，并有降血糖的作用；蟲草多糖是一種高度分枝的半乳甘露聚糖，它能促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化，提高血清IgG的抗體含量和機體的免疫功能，增強機體自身抗癌抑癌的能力。目前，根據(jù)國內(nèi)外公開專利報道，提取精制蟲草素和蟲草多糖的方法主要有水煮法、醇提法、超臨界C02萃取法等。中國專利CN1339440報道了以食用真菌蟲草或北蟲草人工 培養(yǎng)后的發(fā)酵物為原料，采用超臨界技術(shù)萃取有效成分，同時結(jié)合常規(guī)方法除去雜質(zhì)、 濃縮、結(jié)晶獲得蟲草素。較之于傳統(tǒng)的浸提法，超臨界C02萃取克服了前者提取時間長、 溫度高、系統(tǒng)開放的缺點，可萃取出較多的極性組分，可以更加真實、全面的反映藥材 的化學(xué)組份，但由于超臨界C02萃取技術(shù)用于蟲草素提取階段成本過高，難以進行大規(guī)模實踐。中國專利CN1560085A公開了一種利用蟲草人工培養(yǎng)中產(chǎn)生的培養(yǎng)基下腳料提取蟲 草多糖的工藝，該法可變廢為寶，減少資源的浪費，提高經(jīng)濟效益，但是在多糖制備過 程中使用了氯仿等有機溶劑，不利于食品安全。目前有關(guān)蛹蟲草活性成分綜合提取精制 方面的專利還未見報道，現(xiàn)有提取技術(shù)多是單一的或間歇的，往往通過一套系統(tǒng)單純提 取蟲草素或蟲草多糖，這樣非連續(xù)性的提取技術(shù)不便于工業(yè)化生產(chǎn)；另外，由于提取分 離步驟太多，使得現(xiàn)有技術(shù)提取的有效成分總含量不高，造成資源極大的浪費。三
發(fā)明內(nèi)容
牛支術(shù)問題本發(fā)明主要克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種低成本，并且對環(huán)境污染小 的蟲草素和蟲草多糖的精制方法，目的是使蟲草素和蟲草多糖能同時被提取、避免單一 提取給蛹蟲草活性成分帶來的損失，以提高蛹蟲草綜合利用度，降低投資和運行成本， 最大價值的發(fā)揮蛹蟲草的綜合經(jīng)濟效益。
技術(shù)方案一種從蛹蟲草中提取精制蟲草素和蟲草多糖的方法，包括如下步驟(1) 將蛹蟲草子實體粉碎過40 60目篩；(2) 向粉碎的原料中加入95%乙醇或無水乙醇以冷滲法進行提取，蛹蟲草粉和95%乙醇或 無水乙醇的混合比例按重量計為1:5-20，將醇溶性色素之類的雜質(zhì)以濾液的形式初步分 離出來；(3) 棄濾液，將濾渣回收于55'C真空烘干；(4) 將烘干后的濾渣與乙醇混合，蛹蟲草粉和10-30%乙醇的混合比例按重量計為1:15-40， 進行超聲波輔助提取，超聲波頻率為20-40KHz，超聲處理時間為30-90分鐘，重復(fù)處理 1-3次，其中乙醇濃度為10-30%;提取結(jié)束后，過濾，合并多次濾液，在35-45°C， 300-700mmHg下減壓濃縮，添加95%乙醇或無水乙醇，使溶液中乙醇重量含量為55-卯％， 靜置8-24小時，使水溶性蛹蟲草粗多糖析出；(5) 取醇析后的上清液，在35-45。C， 300-700mmHg下減壓濃縮至干，向其中加蒸餾水溶 解，調(diào)pH值至3.0-4.0，上離子交換柱用0.1-0.3mol/L氨水洗脫除掉雜質(zhì)，收集洗脫液進 行再濃縮，冷藏析出晶體，用正丁醇重結(jié)晶，得到精制蟲草素；(6) 收集第(4)步沉淀出的水溶性蛹蟲草粗多糖，在50-6(TC下將之烘干；(7) 向烘干的蛹蟲草粗多糖中加入20-25倍體積蒸餾水溶解，加入木瓜蛋白酶進行脫蛋白 處理，木瓜蛋白酶在提取溶液中重量含量為1.5-3.0%。，在50-60。C， pH5.5-6.5條件下水 解4-6小時，離心去除沉淀得二次上清液，將二次上清液濃縮，上大孔樹脂柱床，用蒸 餾水洗脫至流出液呈無色透明，合并流出液，濃縮，加入95%乙醇或無水乙醇，使得溶 液中乙醇重量含量達到55-90%，沉淀出多糖，經(jīng)冷凍干燥后得到精制蛹蟲草多糖。上述從蛹蟲草中提取精制蟲草素和蟲草多糖的方法中，所述的冷滲法是在0-8'C環(huán)境 中，進行靜態(tài)提取l-3次，每次2-4小時。離子交換樹脂為732、 724型陽離子交換樹脂 或D113型大孔陽離子交換樹脂。大孔樹脂為普通大孔樹脂，其型號為AB-8型或D101 型。有益效果本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種低成本，并且對環(huán)境污染小的蟲草素和 蟲草多糖的精制方法，制備過程中只以水和乙醇為溶劑，減少污染，所用的樹脂再生后 可數(shù)次重復(fù)使用，成本低，制得的蟲草素純度在90%以上，多糖純度在85%以上。本發(fā)明方法以綜合利用蛹蟲草資源為前提，充分挖掘蛹蟲草功能性成分，實現(xiàn)蟲草素 和蟲草多糖的共同提取，保證了蟲草素和蟲草多糖的生物活性。最大限度地增加了原料 的利用率，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明方法適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。具體實施例方式下面的實施例是對本發(fā)明的進一步詳細描述，但并不意味著對本發(fā)明的任何限制。
實施例l
將lkg蛹蟲草子實體粉碎過60目篩，向粉碎的原料中加入5000毫升95 %乙醇以冷滲法 提取3次，每次3小時，將醇溶性色素之類的雜質(zhì)以濾液的形式初步分離出來，棄濾液， 濾液可留作其他用途。將濾渣回收于55'C真空烘干，將烘干后的濾渣與20%的乙醇按重 量比1:10混合，進行超聲波輔助提取3次，每次提取40分鐘。提取結(jié)束后，過濾，合并多 次濾液，減壓濃縮，添加95%乙醇，使溶液中乙醇含量為80°/。(重量)，靜置8小時。取上清液，減壓濃縮至干，向其中加水溶解，調(diào)pH值至3.5，上732型陽離子交換 柱用0.15mol/L的氨水進行洗脫除掉雜質(zhì)，收集洗脫液進行再濃縮，冷藏析出晶體，用8 毫升正丁醇重結(jié)晶，得到精制蟲草素0.489g，含量為97.1%。
收集沉淀出的水溶性蛹蟲草粗多糖，在55'C下將之烘干，收取蛹蟲草粗多糖，向烘 干的蛹蟲草粗多糖中加入15倍體積蒸餾水溶解，加入木瓜蛋白酶在55'C， pH6.0條件下 水解5小時，木瓜蛋白酶的加入量為加入木瓜蛋白酶后提取溶液重量的296。，離心去除沉 淀得二次上清液，將二次上清液濃縮，上D101型大孔樹脂柱床，用蒸餾水洗脫至流出液 呈無色透明，合并流出液，濃縮，加入95%乙醇，使得溶液中乙醇含量達到80%(重量 比)，沉淀出多糖，經(jīng)冷凍干燥后得到精制蛹蟲草多糖33.21g，含量為92.8%。
實施例2將0.5kg蛹蟲草子實體粉碎過40目篩，向粉碎的原料中加入3000毫升無水乙醇以冷滲 法提取2次，每次4小時，將醇溶性色素之類的雜質(zhì)以濾液的形式初步分離出來，棄濾液， 濾液可留作其他用途。將濾渣回收于55"C真空烘干，將烘干后的濾渣與30%的乙醇按重 量比1:20混合，進行超聲波輔助提取2次，每次提取60分鐘。提取結(jié)束后，進行過濾，合 并多次濾液，減壓濃縮，添加無水乙醇，使溶液中乙醇含量為80%(重量)，靜置12小時。
取上清液，減壓濃縮至干，向其中加水溶解，調(diào)pH值至3.0，上724型陽離子交換 柱用0.211101凡氨水進行洗脫除掉雜質(zhì)，收集洗脫液進行再濃縮，冷藏析出晶體，用4毫 升正丁醇重結(jié)晶，得到精制蟲草素0.185g，含量為94.8%。收集沉淀出的水溶性蛹蟲草粗多糖，在55"C下將之烘干，收取蛹蟲草粗多糖，向烘 干的蛹蟲草粗多糖中加入20倍體積蒸熘水溶解，加入木瓜蛋白酶在55'C， pH6.0條件下 水解4小時，木瓜蛋白酶的加入量為加入木瓜蛋白酶后提取溶液重量的1.5%。，離心去除 沉淀得二次上清液，將二次上清液濃縮，上DIOI型大孔樹脂柱床，用蒸餾水洗脫至流出 液呈無色透明，合并流出液，濃縮，加入無水乙醇，使得溶液中乙醇含量達到80%(重量)， 沉淀出多糖，經(jīng)冷凍干燥后得到精制蛹蟲草多糖15.52g，含量為93.1%。
實施例3將0.8kg蛹蟲草子實體粉碎過40目篩，向粉碎的原料中加入4500毫升無水乙醇以冷滲 法提取2次，每次5小時，將醇溶性色素之類的雜質(zhì)以濾液的形式初步分離出來，棄濾液， 濾液可留作其他用途。將濾渣回收于55t:真空烘干，將烘干后的濾渣與20%的乙醇按重 量比1:25混合，進行超聲波 并多次濾液，減壓濃縮，添加無水乙醇，使溶液中乙醇含量為70%(重量)，靜置16小時。 取上清液，減壓濃縮至干，向其中加水溶解，調(diào)pH值至3.0，上D113型大孔陽離 子交換柱用0.15mol/L氨水:乙醇(80:20，體積比)的堿性洗脫液除掉雜質(zhì)，收集洗脫液 進行再濃縮，冷藏析出晶體，用7毫升正丁醇重結(jié)晶，得到精制蟲草素0.336g，含量為 94.8%。收集沉淀出的水溶性蛹蟲草粗多糖，在55'C下將之烘干，向烘干的蛹蟲草粗多糖中 加入20倍體積蒸餾水溶解，加入木瓜蛋白酶在55'C， pH6.5條件下水解6小時，木瓜蛋 白酶的加入量為加入木瓜蛋白酶后提取溶液重量的2%。，離心去除沉淀得二次上清液，將 二次上清液濃縮，上AB-8型大孔樹脂柱床，用蒸餾水洗脫至流出液呈無色透明，合并流 出液，濃縮，加入無水乙醇，使得溶液中乙醇含量達到70%(重量)，沉淀出多糖，經(jīng)冷 凍干燥后得到精制蛹蟲草多糖26.63g，含量為90.8%。實施例4將0.75kg蛹蟲草子實體粉碎過60目篩，向粉碎的原料中加入4800毫升95%乙醇以冷滲 法提取3次，每次4小時，將醇溶性色素之類的雜質(zhì)以濾液的形式初步分離出來，棄濾液， 濾液可留作其他用途。將濾渣回收于55t:真空烘干，將烘干后的濾渣與10%的乙醇按重 量比1:25混合，進行超聲波輔助提取2次，每次60分鐘。提取結(jié)束后，過濾，合并多次濾 液，減壓濃縮，添加無水乙醇，使溶液中乙醇含量為90%(重量比)，靜置24小時。取上清液，減壓濃縮至干，向其中加水溶解，調(diào)pH值至3.0，上732型陽離子交換 柱用0.2mol/L氨水進行洗脫除掉雜質(zhì)，收集洗脫液進行再濃縮，冷藏析出晶體，用6毫 升正丁醇重結(jié)晶，得到精制蟲草素0.321g，含量為96.8%。收集沉淀出的水溶性蛹蟲草粗多糖，在55'C下將之烘干，收取蛹蟲草粗多糖，向烘 干的蛹蟲草粗多糖中加入25倍體積蒸餾水溶解，加入木瓜蛋白酶在5(TC， pH5.5條件下 水解6小時，木瓜蛋白酶的加入量為加入木瓜蛋白酶后提取溶液重量的3.0%。，離心去除 沉淀得二次上清液，將二次上清液濃縮，上AB-8型大孔樹脂柱床，用蒸餾水洗脫至流出 液呈無色透明，合并流出液，濃縮，加入無水乙醇，使得溶液中乙醇含量達到90%(重量)， 沉淀出多糖，經(jīng)冷凍干燥后得到精制蛹蟲草多糖22.17g，含量為89.7%。實施例5(一)蟲草素含量測定(高效液相色譜法)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別準(zhǔn)確稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品(購于Sigma公司，純度>98%) 10.0 mg，用甲醇定容至50ml，搖勻。分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品母液lml、 2ml、 4ml、 8ml和 10ml，用甲醇稀釋至10ml，搖勻，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。色譜條件色譜柱為Eclipse XDB C18 色譜柱(150mmx4.6mmi.d., 5pm);流動相為水:甲醇:甲酸二95:4:l(v/v/v);流速0.8ml/min; 柱溫25'C;檢測波長260nm。分別取上述制備的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液2(Hil，按色譜條件分別 進樣，測定峰面積，以峰面積Y為橫坐標(biāo)，對照品濃度X為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣品含量測定取精制的蟲草素0.0050g，加入甲醇稀釋至lOOml，過0.22pm微孔 濾膜，20pl進樣，通過標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計算蟲草素含量。(二)蟲草多糖含量的測定(蒽酮-硫酸法)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取105'C下干燥至恒重的無水葡萄糖約10.0mg，置 100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取0.2g蒽 酮和lg硫脲置于燒杯中，緩慢加入100ml濃硫酸，邊加邊攪拌，直至溶解后呈黃色透明 溶液，將其置于棕色瓶中于冷暗處保存。從葡萄糖對照品溶液中分別精密吸取0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0， 1.2ml，置于25ml干燥潔凈的具塞試管中，補水至2.0ml，混勻。在冰浴 中沿管壁緩慢加入蒽酮試劑4.0ml，混勻，將反應(yīng)液一并在沸水浴中加熱8min，取出在 流水中冷卻至室溫，同時以2.0ml蒸餾水加蒽酮試劑4.0ml作空白，在624nm波長處測 定吸光值。以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品含量測定準(zhǔn)確稱取O.OOlOg待測樣品，加蒸餾水溶解稀釋至10ng/ml，取0.5ml 置于25ml干燥潔凈的具塞試管中，補水至2.0ml，混勻。在冰浴中沿管壁緩慢加入蒽酮 試劑4.0ml，混勻，將反應(yīng)液一并在沸水浴中加熱8min，取出在流水中冷卻至室溫，同 時以2.0ml蒸餾水加蒽酮試劑4.0ml作空白，在624nm波長處測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回 歸方程計算蛹蟲草多糖含量。
權(quán)利要求
1.一種從蛹蟲草中提取精制蟲草素和蟲草多糖的方法，包括如下步驟(1)將蛹蟲草子實體粉碎過40～60目篩；(2)向粉碎的原料中加入95％乙醇或無水乙醇以冷滲法進行提取，蛹蟲草粉和95％乙醇或無水乙醇的混合比例按重量計為1∶5-20，將醇溶性色素之類的雜質(zhì)以濾液的形式初步分離出來；(3)棄濾液，將濾渣回收于55℃真空烘干；(4)將烘干后的濾渣與乙醇混合，蛹蟲草粉和10-30％乙醇的混合比例按重量計為1∶15-40，進行超聲波輔助提取，超聲波頻率為20-40KHz，超聲處理時間為30-90分鐘，重復(fù)處理1-3次，其中乙醇濃度為10-30％；提取結(jié)束后，過濾，合并多次濾液，在35-45℃，300-700mmHg下減壓濃縮，添加95％乙醇或無水乙醇，使溶液中乙醇重量含量為55-90％，靜置8-24小時，使水溶性蛹蟲草粗多糖析出；(5)取醇析后的上清液，在35-45℃，300-700mmHg下減壓濃縮至干，向其中加蒸餾水溶解，調(diào)pH值至3.0-4.0，上離子交換柱用0.1-0.3mol/L氨水洗脫除掉雜質(zhì)，收集洗脫液進行再濃縮，冷藏析出晶體，用正丁醇重結(jié)晶，得到精制蟲草素；(6)收集第(4)步沉淀出的水溶性蛹蟲草粗多糖，在50-60℃下將之烘干；(7)向烘干的蛹蟲草粗多糖中加入20-25倍體積蒸餾水溶解，加入木瓜蛋白酶進行脫蛋白處理，木瓜蛋白酶在提取溶液中重量含量為1.5-3.0‰，在50-60℃，pH5.5-6.5條件下水解4-6小時，離心去除沉淀得二次上清液，將二次上清液濃縮，上大孔樹脂柱床，用蒸餾水洗脫至流出液呈無色透明，合并流出液，濃縮，加入95％乙醇或無水乙醇，使得溶液中乙醇重量含量達到55-90％，沉淀出多糖，經(jīng)冷凍干燥后得到精制蛹蟲草多糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述從蛹蟲草中提取精制蟲草素和蟲草多糖的方法，其特征在于， 所述的冷滲法是在0-8"C環(huán)境中，進行靜態(tài)提取l-3次，每次2-4小時。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述從蛹蟲草中提取精制蟲草素和蟲草多糖的方法，其特征 在于，所述的離子交換樹脂為732、 724型陽離子交換樹脂或D113型大孔陽離子交換樹 脂。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述從蛹蟲草中提取精制蟲草素和蟲草多糖的方法，其特征 在于，所述大孔樹脂為普通大孔樹脂，其型號為AB-8型或D101型。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述從蛹蟲草中提取精制蟲草素和蟲草多糖的方法，其特征在于， 所述大孔樹脂為普通大孔樹脂，其型號為AB-8型或D101型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從蛹蟲草中提取精制蟲草素和蟲草多糖的方法，屬于醫(yī)藥保健、化工領(lǐng)域。將蛹蟲草粉末以冷滲法提取過濾，濾渣與乙醇混合，超聲波輔助提取、離心，上清液濃縮、醇析。醇析上清液減壓濃縮、洗脫，洗脫液濃縮結(jié)晶，用正丁醇重結(jié)晶，得到精制蟲草素；醇析沉淀進行酶解脫蛋白處理、離心，上清液濃縮、洗脫，流出液濃縮、醇析，冷凍干燥后得到精制多糖。本發(fā)明的制備過程中只以水和乙醇為溶劑，減少污染，所用樹脂可數(shù)次重復(fù)使用，成本低。本發(fā)明方法充分開發(fā)利用蛹蟲草生物活性成分，實現(xiàn)蟲草素和蟲草多糖的共同提取，保證了蟲草素和蟲草多糖的生物活性。最大限度地增加了原料的利用率，降低了生產(chǎn)成本，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A23L1/09GK101124988SQ200710122409
公開日2008年2月20日 申請日期2007年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月25日
發(fā)明者劉春泉, 宋江峰, 李大婧 申請人:江蘇瑞迪生科技有限公司 被以下專利引用 (4),