專利名稱：：H5亞型禽流感病毒中和表位模擬肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及H5亞型禽流感病毒中和表位模擬肽，及其保守性變異體或活性片段，或模擬肽及其類似物的相關(guān)編碼序列，及應(yīng)用該模擬肽或類似物于預(yù)防或診斷的用途。
背景技術(shù)：
：自H5型禽流感于1996年首先在我國廣東省農(nóng)場的鵝群暴發(fā)以來(XuXetal.，1999，Virology),由此病毒演生出來的另一林H5病毒在香港的禽鳥農(nóng)場(1997年4月)及市場(1997年11月)暴發(fā)，引起了歷史上禽流感病毒第一次直接由禽傳人事件，前后共18例確診病例中有6人死亡。2003年以來，H5病毒林在整個(gè)東亞及東南亞國家的相繼暴發(fā)，WHO及流感專家預(yù)測H5禽流感病毒將最有可能成為下一次人類大流感暴發(fā)的流行抹。2004年初，H5型高致病性禽流感也先后在我國十幾個(gè)省暴發(fā)，并在中國香港、泰國、荷蘭等發(fā)現(xiàn)H5型禽流感傳染雞、鴨、蒼鷺、虎、貓等多種動(dòng)物的事件。更令人擔(dān)憂的是，在泰國已經(jīng)出現(xiàn)疑似人傳染人事件，馬來西亞也有多例報(bào)道。進(jìn)入2005年，羅馬尼亞、俄羅斯、土耳其等歐洲國家相繼發(fā)現(xiàn)禽類感染H5型禽流感病毒致死事件，專家認(rèn)為此乃帶毒候鳥遷移的結(jié)果，這使得控制高致病性H5型禽流感病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散傳播變得更為困難。專家預(yù)測，隨著侯鳥的傳播，H5型禽流感病毒有可能通過歐亞、亞非大陸橋進(jìn)一步傳播到衛(wèi)生條件極差的非洲國家，使得H5型禽流感病毒獲得和其它人流感病毒充分重組的機(jī)會(huì)和時(shí)間，屆時(shí)將很可能形成一種對(duì)人類高度致命的全新流感病毒，其給人類帶來的各種損失將難以估計(jì)。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)結(jié)果，截止2006年1月19日，全球因感染H5N1病毒死亡的人類個(gè)案已達(dá)80例，給全球公共衛(wèi)生安全帶來極大的考驗(yàn)。最新研究結(jié)果(Li，K.S.etal.，2004，Nature)表明，華南水禽(家鴨)為H5型禽流感病毒的主要攜帶者及傳播者，H5型禽流感的爆發(fā)有明顯的季節(jié)性，并伴隨著生物多態(tài)型(多種基因型)的演變。然而，分子流行病學(xué)研究表明，目前鴨群中大約有30%的陽性感染并無任何癥狀，雞群中也有達(dá)10%的流行且無癥狀帶毒。這些受感染的動(dòng)物又能夠不斷使人受到新的感染，對(duì)人類的健康構(gòu)成巨大的威脅。有關(guān)專家一致認(rèn)為要控制好H5型高致病性禽流感病毒在整個(gè)東亞、東南亞以及歐洲各國'的流行，早期診斷是先決條件，然后才能做到早隔離、早處理，對(duì)人做到早治療。由于H5型禽流感病毒(其中Goose/Guangdong/1/96為代表林)屬高致病性病毒，對(duì)目前常用的動(dòng)物模型均有致死性，而釆用基因工程方法表達(dá)的血凝素蛋白(HA)又不能完整取得抗原性，世界上多個(gè)著名實(shí)驗(yàn)室先后嘗試制備針對(duì)該病毒系的單克隆抗體均未獲成功。目試劑要求的由A/chicken/Pennsylvania/1370/83(H5N2)和A/chicken/Pennsylvania/8125/83(H5N2)制備的單克隆抗體。本實(shí)驗(yàn)室利用不同時(shí)間、不同地點(diǎn)、不同宿主分離到的多個(gè)禽流感病毒H5N1代表林免疫小鼠，持續(xù)進(jìn)行單克隆抗體的制備，已制備出了包含388株具有血凝抑制(HI)活性的H5特異性單克隆抗體的H5單抗庫。根據(jù)對(duì)近千林全球各地H5N1病毒基因組序列進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化分析，我們篩選出34抹不同地域、不同進(jìn)化分支、不同宿主來源的H5N1代表林，加上2006年最新分離出的7個(gè)毒林共41個(gè)毒林組成代表性H5N1病毒庫，對(duì)這41林H5N1病毒進(jìn)行各單抗的HI活性測定，可根據(jù)HI活性的差異將這388林單抗分為10個(gè)類型，同時(shí)可將這41林代表性病毒分為八個(gè)HI活性分支。初步篩選出69林對(duì)60%以上病毒林有強(qiáng)反應(yīng)(HI滴度大于1600)的單抗，對(duì)34林H5N1代表抹進(jìn)行病毒微量中和實(shí)驗(yàn)，證實(shí)這些單抗均可對(duì)數(shù)目不同的毒林具有不同程度的中和活性，為治療性抗體研究奠定了基礎(chǔ)。血凝素(HA)抗原是禽流感病毒疫苗的最主要靶標(biāo)，但同時(shí)也是病毒變異最活躍的抗原。現(xiàn)有流感疫苗必須不斷根據(jù)最新的病毒流行林的抗原變異特征的變化而更新用于疫苗制備的毒林，而且由于各地流行病毒林并不一定完全一致，造成疫苗林選擇的巨大困難。同時(shí)，由于新疫苗的制備必須經(jīng)一定的時(shí)間，為應(yīng)對(duì)流感疫情，必須提前對(duì)病毒流行趨勢進(jìn)行預(yù)測，這種預(yù)測也不能保證每次都正確。因此，發(fā)現(xiàn)禽流感病毒高保守中和表位并進(jìn)行針對(duì)性的通用疫苗研究開發(fā)具有極大的吸引力。在我們制備的H5N1單抗庫中，已發(fā)現(xiàn)有4林單抗對(duì)目前所檢測的全部H5N1變異林都有很強(qiáng)的中和活性，提示H5N1病毒HA上可能存在重要的高保守性中和位點(diǎn)，從而提供了一個(gè)克服H5N1禽流感病毒高變異這一巨大障礙的重要突破口。我們利用其中的1個(gè)保守中和單抗(8H5)，從噬菌體肽庫中篩選特異結(jié)合的表位模擬肽。多肽表面展示是一種新的基因操作技術(shù)，它使表達(dá)的多肽以融合蛋白形式展現(xiàn)在噬菌體，細(xì)胞或某些載體表面，保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。該技術(shù)可用于研究多肽(蛋白質(zhì))的性質(zhì)、相互識(shí)別和作用，并據(jù)此從巨大展示庫中選擇特定靶功能的多肽結(jié)構(gòu)。表面展示技術(shù)可用于人工抗體和疫苗的制備、抗原決定簇的定位、蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的確定、特異調(diào)節(jié)分子的分離、細(xì)胞表面工程的研究、多肽藥物的研制，.以及生物分子實(shí)驗(yàn)定向進(jìn)化等研究。近年來噬菌體肽庫技術(shù)應(yīng)用范圍很廣，日益受到人們的重視，此肽庫技術(shù)也日趨成熟，根據(jù)應(yīng)用目的不同而構(gòu)建了各種不同的肽庫，且成功地應(yīng)用到了4艮多領(lǐng)域(Parmley，S.F.andSmith,G.F.，1988，Gene;Cwirla，S.E.etal"1990，ProcNatlAcadSciUSA;Scott，J丄andSmith，G.P.，1990，Science;;Smith，G.P.andScott，J.K.，1993，MethodsEnzymol)。如才艮據(jù)載體種類可分為絲狀噬菌體肽庫、T4噬菌體肽庫、A噬菌體肽庫；根據(jù)用途不同可分為隨機(jī)短肽庫、天然肽庫、多肽構(gòu)象庫、cDM展示庫和基因突變體展示庫。用噬菌體隨機(jī)肽庫從事蛋白質(zhì)抗原表位的分析，在研究線性短肽、折疊的蛋白質(zhì)，甚至非蛋白質(zhì)分子等受體的相應(yīng)配體時(shí)，噬菌體隨機(jī)肽庫被認(rèn)為是配體的"萬能庫"。這些配體不一定和天然的配體完全相同，但它能模擬天然配體的結(jié)合特性。基于此理論，在抗原-抗體的識(shí)別研究中，人們不'殺使用天然抗原，就可以從隨機(jī)肽庫里直接篩選出能和抗體結(jié)合的表位。這些表位既可以是線性表位，也可以是模擬的構(gòu)象型表位，而且不必預(yù)先確定蛋白質(zhì)的氨基酸序列。噬菌體隨機(jī)肽庫是模擬肽篩選技術(shù)中的強(qiáng)有力的武器。它由特定長度的隨機(jī)短肽序列組成，理論上文庫中包括某一固定長度短肽所有的氨基酸排列組合方式，即這一長度的所有表位。用抗體篩選隨機(jī)肽庫得到與其高親和力結(jié)合的小分子模擬肽，進(jìn)行短肽的序列確定后，可根據(jù)此序列進(jìn)行短肽重組合成和進(jìn)一步修飾，以獲得最佳的抗原呈遞，得到高特異性的新型疫苗，刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。但應(yīng)避免用某一單克隆抗體篩選隨機(jī)肽庫，那樣雖可得到具有與目標(biāo)蛋白相同抗原性的表位模擬肽(mimotope)，但該表位模擬肽也可能結(jié)合于同一抗體中的不同CDR區(qū)。所以，可視為候選疫苗的模擬表位肽必須具有與識(shí)別天然表位的抗體結(jié)合的抗原性及誘導(dǎo)與天然表位有交叉反應(yīng)的抗體的免疫原性。
發(fā)明內(nèi)容在第一方面，本發(fā)明提供了能特異性結(jié)合禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和單克隆抗體的模擬肽，其氨基酸序列為SEQIDN0s:1，3，5，7，9，11，13，15，17,19，21或23,或者所述模擬肽經(jīng)氨基酸插入、延伸、刪除而得到的保守性變異體或活性片段，其氨基酸序列為SEQIDN0s:2S-48之一，所述變異體或活性片段仍保持與禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和性單克隆抗體特異結(jié)合的能力。在第二方面，本發(fā)明提供了編碼權(quán)利要求上述模擬肽或其保守性變異體或活性片段的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述核苷酸序列為SEQIDNO:2，4，6，8,10,12，14，16,18，20，22或24。在第三方面，本發(fā)明提供了包含上述模擬肽或其保守性變異體或活性片段的融合蛋白，其具有與禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和單克隆抗體特異結(jié)合的能力。優(yōu)選地，其中所述模擬肽或保守性變異體或活性片段與其它秉白或毒素等載體融合。更優(yōu)選地，所述其它蛋白為239蛋白或BBc。在第四方面，本發(fā)明提供了展示上述模擬肽或保守性變異體或活性片段或類似物的類病毒顆粒，仍具有與禽流感病毒血凝素蛋白廣鐠中和單克隆抗體特異結(jié)合的能力。在笫五方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核苷酸序列的核酸載體。在第六方面，本發(fā)明提供了用上述核酸載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在第七方面，本發(fā)明提供了上述模擬肽及其保守性變異體或活性片段或類似物、上述融合蛋白或類病毒顆粒用于制備預(yù)防禽流感疾病的疫苗的用途。在第八方面，本發(fā)明提供了上述模擬肽及其保守性變異體或活性片段或類似物、上述融合蛋白或類病毒顆粒在制備用于診斷禽流感疾病的組合物中的用途。在第九方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，包含本發(fā)明所述模擬肽或保守性變異體或活性片段或其類似物，或所述融合蛋白或所述類病毒顆粒。在第十方面，本發(fā)明提供了抗體，其特異于本發(fā)明的模擬肽或保守性變異體或活性片段或其類似物。本發(fā)明也提供了所述特異性抗體在制備用于診斷和治療禽流感疾病的組合物中的用途。本發(fā)明申請中涉及的有關(guān)術(shù)語的定義如下本發(fā)明中的"血凝素"一詞指禽流感病毒的包膜糖蛋白。血凝素蛋白介導(dǎo)流感病毒針對(duì)宿主細(xì)胞的吸附和進(jìn)入。禽流感病毒的血凝素蛋白有16個(gè)血清學(xué)亞型，即HAl-HA16，分別對(duì)應(yīng)于16個(gè)病毒亞型，即HI-H16。本發(fā)明中的"抗體"一詞指任意一種免疫球蛋白，包括能結(jié)合特異性抗原的單抗、多抗、雙特異性或多特異性抗體。一個(gè)完整的抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈含有一個(gè)可變區(qū)和第一、第二、第三等三個(gè)恒定區(qū)；每條輕鏈包含一個(gè)可變區(qū)和一個(gè)恒定區(qū)?？贵w呈"Y"型，"Y"型結(jié)構(gòu)的頸部含有兩條重鏈的第二和第三恒定區(qū)，其通過二硫鍵結(jié)合形成。"Y"型結(jié)構(gòu)的每條臂含有其中一條重鏈的笫一恒定區(qū)和可變區(qū)，和一條輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)。輕鏈和重鏈的可變區(qū)決定抗原的結(jié)合；每條鏈的可變區(qū)均含有三個(gè)高變區(qū)，稱互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(輕鏈(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重鏈(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3(其由Kabat等人命名，見SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition(1991)，第1-3巻，證Publication91—3242，BethesdaMd)。其中，三個(gè)CDR由構(gòu)架區(qū)(FR)間隔開。構(gòu)架區(qū)比CDR區(qū)更保守并形成一個(gè)架子狀結(jié)構(gòu)支撐超變區(qū)。重鏈和輕鏈的恒定區(qū)與抗原結(jié)合無關(guān)，但具有多種效應(yīng)功能?？贵w依據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列可以分成幾類，主要是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些類還進(jìn)一步分成亞類，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl或IgA2等。本發(fā)明中的"抗體"一詞，除特指完整的免疫球蛋白外，也指免疫球蛋白的片段(如至少是免疫球蛋白分子的一個(gè)免疫活性區(qū)段)，如Fab、Fab'、F(ab02、Fv片段、單鏈抗體分子或由含有一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的免疫球蛋白分子的任意片段形成的多特異性抗體。另外，本發(fā)明涉及的抗體也可以是由一個(gè)特定的人免疫球蛋白中的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)結(jié)合一個(gè)或多個(gè)不同的人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)形成的抗體?？贵w相關(guān)的"Fab"片段是指含有一條輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)和一條重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)經(jīng)二硫鍵結(jié)合起來的抗體分子的一部分。本發(fā)明中的"抗原決定簇"(或稱表位)指的是抗原分子中與抗體結(jié)合的那部分氨基酸或原子基團(tuán)。本發(fā)明中的"單抗"一詞指的是來自一群高度同源的抗體分子中的一個(gè)抗體或抗體的一個(gè)片斷，也即除僅在少數(shù)情況下可能出現(xiàn)的自然突變外，一群完全相同的抗體分子。單抗對(duì)抗原上的單一表位具有高特異性。單抗與多抗不同，多抗是包含了識(shí)別抗原上的不同表位的抗體分子。雖然傳統(tǒng)的單抗是由雜交瘤細(xì)胞分泌的，但本發(fā)明涉及的單抗并不僅限于此制備方法。如，本發(fā)明涉及的單抗可采用Kohler等首次報(bào)道的雜交瘤技術(shù)獲得(Nature,256:495,1975),也可采用重組歸技術(shù)獲得(如參見U.S.P4，816，567)。本發(fā)明中"載體"一詞指的是，可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達(dá)的一種核酸運(yùn)載工具。載體可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)得以表達(dá)。舉例來說，栽體包括質(zhì)粒；噬菌粒；柯斯質(zhì)粒；人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)或Pl來源的人工染色體(PAC);噬菌體如A噬菌體或M13噬菌體及動(dòng)物病毒等。用作載體的動(dòng)物病毒種類有逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺伴隨病毒、皰滲病毒(如單純皰滲病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達(dá)的元件，包括啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報(bào)告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點(diǎn)。載體還有可能包括有協(xié)助其進(jìn)入細(xì)胞的成分，如病毒顆粒、脂質(zhì)體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質(zhì)。本發(fā)明中"宿主細(xì)胞"一詞指的是導(dǎo)入載體的細(xì)胞，包括如下許多細(xì)胞類型，如大腸桿菌或枯草菌等原核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或曲霉菌等真菌細(xì)胞，如S2果蠅細(xì)胞或Sf9等昆蟲細(xì)胞，或者如纖維原細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，NSO細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，BHK細(xì)胞，HEK293細(xì)胞或人細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞。"中和抗體"一詞指的是能清除或顯著降低目標(biāo)病毒抗原結(jié)合毒力的抗體或抗體片段。"特異性結(jié)合，，一詞指的是，兩分子間的非隨機(jī)結(jié)合反應(yīng)，如抗體和產(chǎn)生該抗體的抗原間的反應(yīng)。此處，結(jié)合第一種抗原的抗體對(duì)第二種抗原的結(jié)合親和力是檢測不到或很弱。在某些實(shí)施方式中，一個(gè)某抗原特異性抗體是指以親和力(KD)<10—5M(如l(TM、10—7M、10—8M、10—9M、10—"M等)結(jié)合該抗原，其中KD指解離率與結(jié)合率的比值(koff/kon)，其可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法進(jìn)行測定?？贵w本發(fā)明所述單抗能夠特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及能特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單抗及其相應(yīng)的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明所述抗H5單抗是由小鼠雜交瘤細(xì)胞株8H5所分泌的。單抗的名稱以其相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞林進(jìn)行命名。也就是，抗H5單抗由雜交瘤細(xì)胞林8H5產(chǎn)生，并命名為8H5。單抗8H5能特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白。小鼠雜交瘤細(xì)胞林8H5已在2006年1月17日于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，位于武漢的武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏號(hào)是CCTCC-C200607(雜交瘤細(xì)胞抹8H5)。可以采用Kohler等在Nature256:495(1975)中報(bào)道的雜交瘤制備方法來制備單抗。首先將免疫原(必要時(shí)候添加佐劑)免疫注射小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物。免疫原或佐劑的注射方式通常為皮下多點(diǎn)注射或腹腔注射。免疫原預(yù)先偶聯(lián)到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制劑上，可能會(huì)有助于增強(qiáng)抗原在宿主內(nèi)的免疫原性。佐劑可以利用弗氏佐劑或MPL-TDM等。動(dòng)物受免疫后，體內(nèi)會(huì)有分泌特異性結(jié)合免疫原的抗體的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。另外，淋巴細(xì)胞也可以利用體外免疫藎得。收集目的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞并用合適的融合劑，如PEG,進(jìn)行融合以獲得雜交瘤細(xì)胞(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103，AcademicPress,1996)。上述制備的雜交瘤細(xì)胞可以接種到合適的培養(yǎng)液中生長，培養(yǎng)液中最好含有一種或多種能夠抑制未融合的、母體骨髓瘤細(xì)胞生長的物質(zhì)。例如，對(duì)缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)的母體骨髓瘤細(xì)胞，在培養(yǎng)液中添加次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培養(yǎng)基)等物質(zhì)將可以抑制HGPRT-缺陷細(xì)胞的生長。利用傳統(tǒng)的免疫球蛋白純化方法，如蛋白A瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析等，可以將亞克隆細(xì)胞分泌的單抗從細(xì)胞培養(yǎng)液、腹水或血清中分離出來。本發(fā)明所述單抗還可以是通過基因工程重組技術(shù)獲得。利用特異性結(jié)合單抗重鏈和輕鏈基因的核酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以從雜交瘤細(xì)胞中分離得到編碼單抗重鏈和輕鏈基因的DNA分子。所得DNA分子插入表達(dá)載體內(nèi)，然后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS、CHO細(xì)胞、卑其它不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)并表達(dá)目標(biāo)抗體。本發(fā)明的單抗可以是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的傳統(tǒng)的"Y"型結(jié)構(gòu)狀的抗體。另外，所述抗體也可以是保持了對(duì)血凝素蛋白親和力的傳統(tǒng)的"Y"型結(jié)構(gòu)狀的抗體上的Fab片段、Fat/、F(ab)2、Fv、或其它類型的部分片段，其結(jié)合血凝素蛋白的親和力可以高于或低于傳統(tǒng)的"Y"型.結(jié)構(gòu)狀的抗體。本發(fā)明的抗體片段可以利用水解完整的抗體分子獲得(參見Morimotoetal.，J.Biochem.Biophys.Methods24:107-117(1992)andBrennanetal.，Science229:81(1985))。另外，這些抗體片段也可以直接由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生(綜述見Hudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999);Littleetal.，Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，F(xiàn)ab'片段可以直接從大腸桿菌細(xì)胞中獲得或化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab"2片段(Carteretal.，Bio/Technology,10:163-167(1992))。再如，F(xiàn)(ab"2片段可以用亮氨酸拉鏈GCN4連接獲得。另外，F(xiàn)v、Fab或F(ab')2片段也可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)液中直接分離得到。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完全知曉制備抗體片段的其它技術(shù)。中和抗體另一方面，本發(fā)明提供了能夠中和H5亞型禽流感病毒之病毒活性的抗H5抗體。在一實(shí)施方式中，這種中和抗體能夠中和H5亞型禽流感病毒之病毒活性的至少60%，或至少70%,或優(yōu)選至少75%,或優(yōu)選至少80%,或優(yōu)選至少85%，或優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少99%。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全知曉利用傳統(tǒng)的技術(shù)方法可以測定抗體中和H5亞型禽流感病毒的病毒活性。如本發(fā)明的實(shí)施例1中所描述的中和試驗(yàn)的方法即可用于測定本發(fā)明中的某一個(gè)特定H5單抗的中和活性。模擬肽本發(fā)明還提供了一種模擬單克隆抗體識(shí)別表位的模擬肽。本發(fā)明還提供了12個(gè)與單克隆抗體8H5結(jié)合有特異性的含12個(gè)氨基酸的短肽即模擬肽(表1，SEQIDN0s:1-24)。該模擬肽123或125可用于制成融合蛋白239-123和239-125，該融合蛋白分別和8C11及8H5單克隆抗體結(jié)合得很好。該12肽123或125可用于和HBVcAg制成融合蛋白，該融合蛋白和8H5單克隆抗體而非其他抗體結(jié)合有特異性。融合蛋白HBc-122，HBc-124,HBc-128，HBc-129和8H5單克隆抗體而非其他抗體結(jié)合有特異性。融合蛋白HBc-122,HBc-124，HBc-128，HBc-129還可模擬單克隆抗體識(shí)別表位而形成類似病毒顆粒的組裝。本發(fā)明所指的肽含有天然或非天然氨基酸，包括D型氨基酸及氨基酸衍生物及氨基酸類似物，只要肽保持帶有希望的活性和功能。肽也可以被環(huán)化。肽骨架及肽鍵也可以被修飾。氨基酸及其衍生物都可以被修飾。非天然氨基酸及氨基酸類似物的替換可能增強(qiáng)肽的活性或特征，比如增強(qiáng)肽的穩(wěn)定性和生物學(xué)活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地對(duì)模擬肽進(jìn)行多種方法的修飾，以獲得最佳的抗原呈遞，有效刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞或體液免疫反應(yīng)。此近幾年對(duì)重組肽疫苗的研究主要著重于通過構(gòu)型的改建、增添分子等修飾，以提高其免疫原性及在體內(nèi)的穩(wěn)定性。其中一種方法是將模擬肽連接到大分子載體上，一般用MBS法、戊二醛法、碳二亞胺法、活潑酯法、亞胺酸脂法及卣代硝基苯法等偶聯(lián)載體與重組肽疫苗。蛋白類載體有人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、牛甲狀腺球蛋白(BTG)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)或其他y球蛋白。重組載體有多聚賴氨酸、二軟脂酰賴氨酸、三軟脂酸2S甘油半胱氨酰2絲氨?；z氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。也可以修飾模擬肽的空間結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)免疫原性，如將抗體重鏈第三互補(bǔ)決定區(qū)(CDR3)用外源小肽替代，借助CDR3環(huán)結(jié)構(gòu)兩側(cè)的P片層的空間限構(gòu)作用，成功實(shí)現(xiàn)了原表位的空間限構(gòu)，使具有抗原性的外源小肽獲得與相應(yīng)天然蛋白相似的穩(wěn)定構(gòu)象，增強(qiáng)了抗原呈遞效率和誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的能力。還可以用化學(xué)方法將模擬肽構(gòu)建成四價(jià)多抗原性肽。對(duì)模擬肽進(jìn)行修飾可以降低蛋白酶的水解。提高重組肽免疫原性的另一方法是構(gòu)建表達(dá)出融合蛋白，作為載體的大蛋白分子可以作為免疫載體，提供T細(xì)胞位點(diǎn)。一些病毒衣殼蛋白在原核或者真核系統(tǒng)中表達(dá)后，在一定條件下形成的類病毒顆粒(virus-likeparticles,VLPs)?？梢訴LP作為表位展示載體上，即將模擬肽融合表達(dá)到病毒衣殼蛋白上。將模擬肽融合到環(huán)區(qū)，就能很好的展示在VLP表面。再通過一個(gè)柔性的氨基酸連接體序列，模擬肽就能不受病毒衣殼蛋白的約束，自由的形成構(gòu)像。乙肝HBcAg、苜?；ㄈ~病毒、煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)、人孔頭瘤病毒HPV衣殼蛋白Ll、L2等都可以作為展示模擬肽的蛋白栽體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地合成本發(fā)明的模擬肽。制備合成肽的標(biāo)準(zhǔn)過程為本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉。檢測方法可以使用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、酶免疫檢測、化學(xué)發(fā)光免疫檢測、放射免疫檢測、熒光免疫檢測、免疫色鐠法、竟?fàn)幏邦愃茩z測方法。利用竟?fàn)幏ɑ驃A心法方式，上述檢測方法可以用于檢測目標(biāo)抗原或抗體。竟?fàn)幏ㄊ潜容^樣品中抗原和一種已知量的標(biāo)記抗原竟?fàn)幗Y(jié)合本發(fā)明所述單克隆抗體的數(shù)量關(guān)系。開展基于竟?fàn)幏ǖ拿庖邔W(xué)檢測是將含有未知數(shù)量的目標(biāo)抗原的樣品加入到事先用已知的物理或化學(xué)方法把本發(fā)明所述單抗包被到固相支持物上而得以進(jìn)行的。同時(shí)加入預(yù)定量的標(biāo)記后的目標(biāo)抗原進(jìn)行反應(yīng)。孵育后，沖洗固相支持物，檢測結(jié)合到該支持物上的標(biāo)記物的活性。治療方法和藥物組合物本發(fā)明提供了一種預(yù)防和治療禽流感病毒相關(guān)病毒感染患者的方法，包括對(duì)患者施用一定量的包含了一種或多種本發(fā)明所述模擬肽的有藥物活性的藥物成分。本發(fā)明還提供了一種含有本發(fā)明所述的一種或多種模擬肽的藥物成分或在此基礎(chǔ)上得到的鹽類藥物。本發(fā)明所述藥物成分的干預(yù)方式可以是傳統(tǒng)的干預(yù)途徑，包括口服、口腔、舌下、眼球、局部、腸胃外、直腸、葉鞘內(nèi)、內(nèi)胞漿網(wǎng)槽內(nèi)、腹股溝、膀胱內(nèi)、局部(如，粉劑、藥骨或滴劑)，或鼻腔途徑，但不僅局限于此。適合腸胃外途徑注射的藥物成分可能含有符合藥物制備要求的無菌水或非水溶液、氣霧劑、懸浮液或乳劑，可在臨用時(shí)重懸成可注射的溶液或氣霧劑的無菌粉劑。如適合的水性和非水性載體，工具和各種稀釋液如水、乙醇、多羥基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙二醇、丙三醇及其類似物)，合適的混合物，菜油(如橄欖油)，和可用于注射的有機(jī)脂，如乙烷油酸。如使用卵磷脂衣殼維持藥物的合適流動(dòng)性。如使用氣霧劑、表面活性劑以維持合適的顆粒尺寸。本發(fā)明所述的藥物組合物還可含有一些起保護(hù)性、保濕、乳化和氣霧化的佐劑，也可以含有預(yù)防微生物污染的速溶成分，如各種抗細(xì)菌試劑、抗真菌試劑，如對(duì)羥基苯曱酸酯類，氯丁醇，苯酚，山梨酸及類似物。也可以包括維持滲透壓的試劑，如糖、NaCl及其類似物。可使用延長吸附的試劑來延長注射用藥物成分吸附時(shí)間，如單硬脂酸鹽和凝膠等?？诜滔鄤┬桶z嚢、片劑、粉劑、顆粒劑等。這些固相劑型中的活性成分至少混有一種傳統(tǒng)的惰性藥物賦形劑(或載體)如檸檬酸鈉、磷酸鈣，或(a)填充劑或添加劑如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(b)粘合劑，如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯樹膠；(C)濕潤劑，如甘油；(d)碎裂劑，如瓊脂，碳酸鈣，馬鈴薯粉或木薯粉；(e)緩凝劑，如石蠟；(f)促吸收劑，如四氨基混合物；(g)保濕劑，如十六烷基醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，如高嶺土和斑脫土；(i)潤滑劑，如滑石，硬脂酸鉤，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，硫酸十二烷醇鈉，或其上述物質(zhì)的混合物。在片劑和膠嚢劑型中，可能還含有緩沖劑。固相劑型可以通過做成改良釋放或脈沖釋放劑型，是在上述提到的各種直接釋放賦形劑中添加一些能改變藥物釋放速率的賦形劑而形成，可以包含在劑型中也可以做成外衣的形式。速率釋放改造劑包括羧丙基曱基纖維素，甲基纖維素，碳曱基纖維素鈉，纖維素乙烷，醋酸纖維素，聚乙烯氧化物，黃原膠糖，異丙烯酸氨共聚物，氫化調(diào)味油，巴西棕櫚蠟，石蠟，鄰苯二酸醋酸纖維素，鄰苯二甲酸羧丙基甲基纖維素，甲基丙烯酸共聚物或上述物質(zhì)的混合物。改良釋放和脈沖釋放劑型可能含有一種或一組具有改良釋放速率的賦形劑。本發(fā)明所述藥物成分還可由快速的霧化劑或消溶劑(FDDFs)組成，包含如下成分天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，磺胺鉀，檸檬酸，交聯(lián)羧曱基纖維素鈉，交聚維酮，抗壞血酸，乙烷基丙烯酸鹽，乙烷基纖維素，明膠，氫氧基丙基甲基纖維素，硬脂酸鎂，甘露醇，曱基乙丁烯酸鹽，調(diào)味薄荷，聚乙二醇，氣化硅膠，二氧化硅，乙醇酸淀粉鈉，硬脂酸延胡索酸鈉，山梨醇，木糖醇。這里用于描述FDDFs的"霧化和消溶"一詞，依賴于所用藥物的溶解性，如藥物是不可溶的，可制成快速的霧化劑型，如藥物是可溶的，則可制成快速的溶劑型。類似形式的固相成分也使用諸如乳糖或牛奶糖或其它高分子量的聚乙二醇及類似的賦形劑制成軟明膠或硬明膠的填充劑型。諸如片劑、糖衣劑、膠嚢劑和顆粒劑等之類的固體劑型可以通過諸如腸衣或其它本領(lǐng)域普通人員均知曉的外包衣殼的方式制成。也可以是含有乳濁劑、也可以是含有能起緩慢、延遲、控制活性藥物釋放的類似的成分。也可以使用多聚物和石蠟等成分進(jìn)行包埋。如果合適，也可用上述一種或多種賦形劑把活性成分制成微嚢的形式的劑型。用于口服的液體劑型，包括符合藥物要求的乳狀劑、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑等。除了活性成分，液體劑型也可含有本領(lǐng)域常用的一些惰性溶液，如水或其它溶劑，可溶性試劑和乳化劑，如乙垸基醇，異丙基醇，乙烷基碳酸鹽，苯基安息香酸鹽，丙烯乙二醇，1，3-丁烯乙二醇，油，特別是，棉籽油，落花生油，玉米油，橄欖油，調(diào)味油和芝麻油，甘油，氫糠基醇，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及上述物質(zhì)的混合物或類似的物質(zhì)。除了這些惰性稀釋液，藥物成分也可包括保濕劑、乳化劑、懸浮劑、糖化劑、調(diào)味劑和香味劑等佐劑。另外，藥物成分還可包括乙氧基化均聚乙醇，聚氧乙烯烷基山梨醇和山梨聚糖脂，微晶纖維素，間氬氧化鋁，膨潤土，瓊脂聚合物和黃芪膠，或這些物質(zhì)的混合物之類的懸浮劑。本發(fā)明所述藥物成分也制成適合獸用治療的混合物，或符合獸用的鹽類，或符合獸用的溶劑或初成藥，并根據(jù)普通獸醫(yī)和獸醫(yī)從業(yè)者的要求制成一種最適合某種特定動(dòng)物的給藥劑量和途徑藥物的合適劑型。本發(fā)明所述一個(gè)或多個(gè)模擬肽可以結(jié)合其它抗病毒試劑用于預(yù)防和/或治療H5禽流感病毒感染相關(guān)疾病。模擬肽可以和這些抗病毒試劑同時(shí)、分開或連續(xù)給藥。其它抗病毒試劑包括利巴韋林，金剛烷，羧基脲，IL-2，IL-12和五羧鏈胞酸，但不僅限于這些。多肽篩選方法和抗體識(shí)別的多肽及疫苗本發(fā)明提供了一種篩選本發(fā)明所述單抗識(shí)別的表位模擬肽的檢測方法。而且，本發(fā)明也提供了本發(fā)明所述單抗識(shí)別的表位模擬肽。一方面，本發(fā)明公布的模擬肽含有氨基酸序列SEQIDNos:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25-48。這些模擬肽能夠結(jié)合本發(fā)明所述單抗。因此，這些模擬肽擁有和H5血凝素相同的抗原特異性。這些模擬肽也可用于制備H5亞型禽流感疫苗，也可以用于診斷抗H5血凝素抗體的存在。另一方面，本發(fā)明所述的篩選方法包括如下步驟(i)在特定條件下培養(yǎng)一個(gè)適合多肽表達(dá)的多肽展示文庫；(ii)把培養(yǎng)溶液和本發(fā)明的單抗混合；Uii)篩選特異性結(jié)合上述單抗的噬菌體克隆。用于篩選的單克隆抗體不僅限于單抗8H5。本申請實(shí)施例11-13中詳細(xì)描述了一種利用噬菌體展示多肽文庫成功篩選結(jié)合本發(fā)明所述單抗的模擬肽檢測方法。圖1為噬菌體多肽的ELISA檢測值OD(450/620)的矩形圖。圖2為pT0-T7與pTO-T7-239-123的質(zhì)粒示意圖。圖3為pTO-T7與pTO-T7-239-125的質(zhì)粒示意圖。圖4為融合蛋白239-123純化樣品的SDS-PAGE電泳圖，其中，1:分子重量標(biāo)簽；2:表達(dá)239-123的大腸桿菌(E.coli)全部溶胞產(chǎn)物；3:239-123之超聲溶胞產(chǎn)物的上清；4:緩沖液I中的239-123;5:2M尿素中的239-123純化融合蛋白；6:4M尿素中的239-123的純化融合蛋白；7:8M尿素中的239-123的純化融合蛋白。圖5為融合蛋白239-125純化樣品的SDS-PAGE電泳圖，其中，1:分子重量標(biāo)簽；2:表達(dá)239-125的大腸桿菌全部溶胞產(chǎn)物；3:全部溶胞產(chǎn)物之離心分離上清；4:緩沖液I中的239-125;5:2M尿素中的239-125的純化融合蛋白；6:4M尿素中的239-125的純化融合蛋白；7:8M尿素中的239-125的純化融合蛋白。圖6顯示了239-123融合蛋白的結(jié)合特性其ELISA檢測值OD(450/620)的色彩強(qiáng)度矩形圖，其中，239-123融合蛋白結(jié)合到水平軸所標(biāo)識(shí)的各種毒林上。圖7顯示了239-125融合蛋白的結(jié)合特性其ELISA檢測值0D(450/620)的色彩強(qiáng)度矩形圖，其中，239-125融合蛋白結(jié)合到水平軸所標(biāo)識(shí)的各種毒林上。圖8為在各種mAb稀釋下，239-123融合蛋白結(jié)合到8H5mAb(三角形點(diǎn)線)或8C11mAb(方點(diǎn)線)的ELISA檢測值OD(450/620)的色彩強(qiáng)度。圖9為pC149-mut與pC149-mut-123的質(zhì)粒圖。圖10為pC149-mut與pC149-mut-125的質(zhì)粒圖。圖11為小量表達(dá)的重組蛋白的全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖，其中，1:D123;2:T123;3:F123;4:Q123;5:D125;6:T125;7:F125;8:Q125。圖12為純化重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中，1:D123;2:T123;3:F123;4:Q123;5:D125;6:T125;7:F125;8:Q125。圖13為類病毒顆粒的電鏡圖，該類病毒顆粒是由HBVcAg片段的融合蛋白和結(jié)合抗體的多肽組裝而成的。圖14為顯示融合蛋白HBc-123/125與單抗8H5之間結(jié)合親和力的ELISA檢測值OD(450/620)的色彩強(qiáng)度矩形圖。圖15為顯示融合蛋白HBc-Q123或HBc-D125與各種單抗之間結(jié)合親和力的ELISA檢測值0D(450/620)的色彩強(qiáng)度矩形圖；結(jié)果表明，融合蛋白HBc-Q123和HBc-D125T特異性地結(jié)合單抗8H5。圖16顯示了ELISA檢測HBc-123融合蛋白免疫鼠血清抗體滴度上升曲線，其中，時(shí)間為0-4周，抗體滴度通過ELISA檢測。圖17顯示了ELISA檢測HBc-125融合蛋白免疫鼠血清抗體滴度上升曲線，其中，時(shí)間為0-4周，抗體滴度通過ELISA檢測。圖18顯示了免疫熒光檢測免疫鼠血清與SF21細(xì)胞中表達(dá)的HA蛋白的反應(yīng)。圖19為HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129重組蛋白組裝的類病毒顆粒的電鏡圖。圖20為顯示融合蛋白HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129與各種單抗之間的結(jié)合親和力的ELISA檢測值OD(450/620)的色彩強(qiáng)度矩形圖；結(jié)果表明，融合蛋白HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129特異性地結(jié)合到單抗8H5。圖21顯示了由12肽融合蛋白組裝的類病毒顆粒與H5N1病毒竟?fàn)幗Y(jié)合8H5酶標(biāo)抗體的結(jié)果，其中，縱軸是色彩強(qiáng)度(以O(shè)D(450/620)值表示)，水平軸是實(shí)驗(yàn)中所用的各種類病毒顆粒和PBS對(duì)照物。圖22顯示了239-D122和239-D129融合蛋白與各種單抗結(jié)合活性的ELISA檢測結(jié)果。結(jié)果表明239-D122和239-D129融合蛋白特異性結(jié)合8H5單抗。圖23顯示12肽融合蛋白與8H5抗體的結(jié)合活性的Dot-blot檢測結(jié)果。Al:239-125;A2:HBc-D125;A3:HBc-T125;A4:HBc-F12;A5:HBc-Q125;Bl:239-D122;B2:HBc-D123;B3:HBc-T123;B4:HBc-F123;B5:HBc-Q123;Cl:239-123;C2:239-D124;C3:239-D128;C4:239-D129;C5:239;Dl:HBc-D122;D2:HBc-D124;D3:HBc-D128;D4:HBc-D129;D5:HBcAg圖24顯示HBc-12肽融合蛋白與8H5反應(yīng)的Westernblot結(jié)果。1.HBcAg;2.HBc-D122;3.HBc-D123;4.HBc-D124;5.HBc-D125;6.HBc-D128;7.HBc-D129。只有HBc-D125的二聚體與8H5單抗有反應(yīng)活性。圖25顯示239-12肽融合蛋白與8H5反應(yīng)的Westernblot結(jié)果。1.239蛋白；2.239-D122;3.239-123;4.239-D124;5.239-125;6.239-D128;7.239-D129。239-D122和239-125的二聚體有很強(qiáng)的針對(duì)目標(biāo)抗體8H5活性，而239-D124和239-D129的二聚體有較弱的針對(duì)目標(biāo)抗體8H5活性。圖26顯示噬菌體多肽的ELISA檢測值OD(450/620)的矩形圖。圖27顯示噬菌體多肽的ELISA檢測值0D(450/620)的矩形圖。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例與附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步加以描述，但這些描述并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1從噬菌體12肽庫中篩選模擬8H5識(shí)別表位的短肽選用NewEnglandBiolabs公司的12肽噬菌體展示文庫(ph.D.12peptidelibrary)篩選與單克隆抗體8H5結(jié)合的12肽，按操作說明書進(jìn)行篩選。吸取50piProteinA-瓊脂糖介質(zhì)(50%的水懸液)于微量離心管中，加1mlTBS+0.1%Tween(TBST)溶液。輕彈管壁或溫和震蕩重懸介質(zhì)。低速離心30秒，沉淀介質(zhì)，小心吸去上清。介質(zhì)重懸于1ml封阻緩沖液中，4'C作用60分鐘，偶爾混勻。在此期間，用TBS緩沖液將2xl0"個(gè)噬菌體粒子(相當(dāng)于IOjLtl的原始文庫)和300ng抗體稀釋至終體積20Q抗體終濃度為10nM。室溫作用20分鐘。封阻反應(yīng)后，低速離心沉淀介質(zhì)，并用lmlTBS洗4次，每次均需沉淀介質(zhì)。將噬菌體-抗體混合物加入洗過的介質(zhì)中，溫和混勻，室溫作用15分鐘并不時(shí)混勻。低速離心沉淀介質(zhì)，棄上清，用1mlTBTS洗10次。重懸沉淀介質(zhì)于1ml0.2M的Glycine-HCl(pH2.2),1mg/mlBSA中，室溫作用10分鐘，洗脫結(jié)合的噬菌體。離心洗脫混合液l分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)入另一新的微量離心管中。立即用150jil1MTris-HCl，pH9.1的緩沖液中和洗脫液。取出約lpL滴定噬菌體滴度。將剩余的噬菌體溶液加入20niL對(duì)數(shù)生長前期的ER2738宿主菌液中，37C震蕩培養(yǎng)4.5h。將菌液移入50mL離心管中，10000rpm離心10min。吸取上部80%上清，加入1/6體積的PEG/NaCl(20%PEG-8000，2.5MNaCl)溶液，4"C靜置過夜。10000rpm4"C離心15min。倒掉上清，用lmLPBS溶解沉淀噬菌體。4"C離心5min，吸取上清，加入1/6體積的PEG/NaCl溶液，4X:靜置lh。10000rpm4匸離心15min。倒掉上清，用200jaLPBS溶解沉淀噬菌體，4t)保存。重復(fù)上述步驟，進(jìn)行再一輪的篩選。第三輪篩選后，取出約lul洗脫下來的噬菌體進(jìn)行滴定。挑取單一噬菌體空斑至對(duì)數(shù)期的ER2738菌中，37C培養(yǎng)4.5-5h，離心收集噬菌體上清進(jìn)行ELISA檢測。包被10ug/ffll濃度的鼠單抗8H5，以噬菌體上清為一抗，Anti-M13/HRP抗體(AmershamPhmarciaBiotech,UK)以l:5000稀釋為二抗，取禽流感相關(guān)抗體4DlmAb、10F7mAb以及抗HEVE2蛋白的不相關(guān)抗體8CllmAb為鼠單抗對(duì)照。圖1顯示其中較好的12個(gè)噬菌體多肽的檢測結(jié)果。由圖中結(jié)果可知，大部分噬菌體肽針對(duì)目標(biāo)抗體8H5的讀值高于對(duì)照抗體3倍以上，有較好的特異性。根據(jù)噬菌體ssDNA抽提試劑盒(Omega，USA)的常規(guī)操作抽提DNA，以該DNA模板進(jìn)行須'J序(Invitrogen，Shanghai,China)，獲得以上12林噬菌體展示12肽的核苷酸及氨基酸序列(見表1)。表1與單抗隆抗體8H5結(jié)合的12肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實(shí)施例2.12肽123和125與239蛋白融合表達(dá)及活性檢測239-123和239-125融合表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)室在大腸桿菌中表達(dá)了HEV0RF2的一個(gè)片段(a.a.368-606)，即蛋白239，獲得的重組蛋白239可組裝成為類病毒顆粒，具有良好的免疫原性。我們通過PCR方法，構(gòu)建出239序列的C端融合12肽序列的原核表達(dá)栽體pTO-T7-239-123(圖2)和pT0-T7-239-125(圖3)。首先，針對(duì)239序列和12肽序列設(shè)計(jì)引物(表2)，以239基因?yàn)槟０?，?yīng)用引物239-123F/239-123R1和239-125F/239-125R1進(jìn)行笫一輪PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物回收、純化后作為模板，應(yīng)用引物239-123F/239-123R2和239-125F/239-125R2進(jìn)行笫二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出239-123和239-125片段。然后，分別回收PCR產(chǎn)物239-123和239-125,NdeI和EcoRI雙酶切后克隆入載體pT0-T7中。連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566,小量表達(dá)及質(zhì)粒酶切鑒定，陽性克隆即為重組原核表達(dá)載體pTO-T7-239-123和pT0-T7-239-125。_表2239-123和239-125克隆引物序列_引物名稱引物序列239-123F5'_TTTmCATATGATAGCGCTTACCCTG-3，239-123R15'-GCTACCACCACCACCAGAACCACCACCACCGCGCGGAGGGGGGGCTAAAC-3，239-123R25，-TAGAATTCATGCCACTTCAAAGCCGTCTCCGTAAGAGGCGTCTCGCTACCTCCACCACC-3'239-125F5'-TTTTTACATATGATAGCGCTTACCCTG-3，239-125R15'-GCTACCACCACCACCAGAACCACCACCACCGCGCGGAGGGGGGGCTAAAAC-3，239-125R25，-TAGAATTCAACCAGCCGAAGAGCCGCCGTCGTCAGCGGAGTATCGCTACCTCCACCACC-3'239-123和239-125融合蛋白的表達(dá)和純化挑取轉(zhuǎn)化pT0-T7-239-123或pTO-T7-239-125質(zhì)粒的ER2566單菌落，于2mL含有Kn抗性的LB培養(yǎng)基中，37C震蕩培養(yǎng)至OD600約0.5,然后按照1:1000的比例轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)至500inLLB(含有Kn抗性)中，培養(yǎng)至OD600約1.0時(shí)，加入IPTG500yL，37t:誘導(dǎo)4h。4C下收集菌體，8000rpm離心10min。棄上清，菌體沉淀用20mL/瓶的裂解液重懸。冰水浴，采用超聲破碎儀處理破碎細(xì)胞。超聲條件如下工作時(shí)間10min;脈沖打2sec，停5sec;輸出功率70%。12000rpm離心10min,保留上清，沉淀用20mL2!Triton重懸，震蕩30min。12000rpm離心10min，保留上清，沉淀用20mLBufferI重懸，震蕩30min。重復(fù)Triton/BufferI處理一次。12000rpm離心10min，保留上清，沉淀用20mL2M脲/BufferI(20mmol/LTris-HCl(pH8.5)重懸，震蕩30min。12000rpm離心10min，保留上清，沉淀用20mL4M脲/BufferI重懸，震蕩30min。12000rpm離心10fflin，保留上清，沉淀用20mL詣脲/BufferI重懸，震蕩30min。12000rpm離心10min，保留上清。各保留上清制成蛋白上樣樣品以進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖4、圖5)。由SDS-PAGE分析得知，蛋白主要溶解于8M脲中，純度可達(dá)90。/。。將8M脲中的蛋白梯度透析至PBS中(8M脲-4M脲-2M脲-PBS)。239-123和239-125融合蛋白的活性檢測直接ELISA法檢測初步純化的239-123和239-125融合蛋白以10Mg/mL的濃度包被96孔板，37匸2h。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37TC2h后4n過夜。去封閉液后，每孔加入100pL不同的鼠單抗，包括8C11、7H8、3C8、8H5、1A6、13El、1D8、1G2、3G41、13A2、11H8、4D1、10HD4、14H12、6CF3、7D1、7E8、10DE2、16A12、3FC1、8E2、3D2、10D122、13E7共24抹單抗。其中8C11為239蛋白特異單抗，8H5為12肽篩選所用單抗，其余22林單抗為針對(duì)禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)單抗。371C孵育1h。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(1:10000)IOOijL，37。C孵育30min。PBST洗板5次，加入顯色液顯色10min，終止液終止，酶標(biāo)儀讀值。由圖6、圖7結(jié)果可知，239-123和239-125融合蛋白只與抗體8C11和8H5反應(yīng)，與其它單抗均無反應(yīng)。說明239-123和239-125融合蛋白的反應(yīng)特異性非常好。初步純化的239-123和239-125融合蛋白分別以10jag/mL的濃度包被96孔板，37t:2h。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37r2h后4t;過夜。每孔加入lOOjnL倍比稀釋的8H5抗體(同時(shí)帶有陽性對(duì)照8C11抗體)，371C孵育lh。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(1:10000)100yL，37n孵育30min。PBST洗板5次，加入顯色液顯色I(xiàn)Omin，終止液終止，酶標(biāo)儀讀值。圖8的結(jié)果表明，隨著8H5抗體濃度的降低，8H5與239-125融合蛋白的結(jié)合活性也隨之降低。這與陽性對(duì)照抗體8C11與239蛋白的結(jié)合活性變化一致。239-123融合蛋白檢測結(jié)果與此一致。進(jìn)一步說明239-123和239-125這兩種融合蛋白與抗體8H5的結(jié)合是特異性反應(yīng)。實(shí)施例312肽123和125與HBVcAg蛋白融合表達(dá)融合表達(dá)載體的構(gòu)建利用HBcAg的a.a.1-149在大腸桿菌中能以類病毒顆粒形式表達(dá)的性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)室將該149個(gè)氨基酸插入大腸桿菌表達(dá)載體pTO-T7中，并以連接子替代HBcAgB細(xì)胞優(yōu)勢表位區(qū)段的第79、80兩個(gè)氨基酸，構(gòu)建了突變型HBc表達(dá)質(zhì)粒pC149-mut。HBcAg有著很強(qiáng)的T細(xì)胞免疫原性，夕卜源多肽在HBcAg內(nèi)部MIR(mayorimmunodominantregion,a.a,78-83)的融合不會(huì)改變其顆粒的多聚特性，且可使外源表位暴露于顆粒表面。將123和125分別以1至5個(gè)拷貝插入HBcAg的第79和80位氨基酸，得到系列融合蛋白，分別統(tǒng)稱為HBc-123、HBc-125。根據(jù)12肽序列，以及pC149-mut的載體序列，分別設(shè)計(jì)含12肽序列的正向引物及通用反向引物149MRP(表3，下劃線表示插入的多肽序列)。以pC149-mut為模板，應(yīng)用引物HBcl23F2/HBcR和HBcl23F2/HBcR進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物回收、純化后作為模板，應(yīng)用引物HBcl23F1/HBcR和HBcl23F1/HBcR進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出連有12肽序列的C149a.a.81-149，經(jīng)BglII和EcoRI酶切后回收純化得到片段。同時(shí)以BamHI和EcoRI雙酶切載體pC149-MUT，回收栽體后與片段連接。連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566進(jìn)行表達(dá)鑒定及質(zhì)粒酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒即插入了一個(gè)12肽，分別命名為pC149-mut-123和pC149-mut-125。此質(zhì)粒再用BamHI和EcoRI雙酶切得載體，與之前經(jīng)BglII和EcoRI酶切的含有12肽序列的片斷連接，陽性克隆即為含有2個(gè)12肽拷貝數(shù)的重組原核表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為pC149iut-D123和pC149-mut-D125。用類似方法，構(gòu)建出分別含有3個(gè)拷貝、4個(gè)拷貝及5個(gè)拷貝數(shù)的重組原核表達(dá)載體pC149-mut-T123、pC149-mut-F123、pC149-mut-Q123和pC149-mut-T125、pC149-mut-F125、pC149-mut-Q125。構(gòu)建質(zhì)粒圖如圖9、圖IO所示(僅以pC149-mut-123和pC149-mut—125為例)。表3123、125與HBVcAg融合蛋白表達(dá)的克隆引物序列^_引物序列_HBcl23Fl5'-TTTAGATCT釘釘7TTGAGACGCCTCTTACGGAGACGGCTTTGAAGTGGC-3，HBcl23F25，-CGGCTTTGAAGTGGCATGGATCC釘m7TfCTGCAGGGTGGTGGAGGTTCAGG-3'HBcl25Fl5，-TTTAGATCT7(TGATACTCCCCTGACGACGGCGGCTCTTCGGCTGG3，HBcl25F25，-CGGCTCTTCGGCTGGTTGGATCC"7"^CTGCAGGGTGGTGGAGGTTCAGG-3，HBcR_5，_TTGAATTCTTAAACAACAGTAGTTT3，_(下劃線為12肽序列)融合蛋白的表達(dá)及純化將pC149-mut-D123、pC149-mut-T123、pC149-mut-F123、pC149-mut-Q123、pC149-mut-D125、pC149-mut-T125、pC149-mut-F125、pC149-mut-Q125表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)出來的融合蛋白分別稱為D123、T123、F123、Q123、D125、T125、F125、Q125。分別將含有八種表達(dá)質(zhì)粒的ER2566菌種，接種于2mL含有Kn抗性的LB培養(yǎng)基中，37X:震蕩培養(yǎng)至OD600約0.5，然后按照l:IOOO的比例轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)至500mLLB(含有Kn抗性)中，培養(yǎng)至OD,約0.8時(shí)，加入IPTG500jiL，18匸謙導(dǎo)20h。4匸下收集菌體，8000rpm離心10min。棄上清，菌體沉淀用20mL/瓶的裂解液重懸。冰水浴，采用超聲破碎儀處理破碎細(xì)胞。超聲條件如下工作時(shí)間10min;脈沖打2sec，停5sec;輸出功率:70%。12000rpm離心10min，保留上清。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，所有融合蛋白主要表達(dá)在上清中(圖11)。由于上清表達(dá)蛋白比較雜，故需要對(duì)其進(jìn)行純化。并且此類蛋白在適宜的條件下可以自發(fā)組裝形成顆粒，所以對(duì)蛋白進(jìn)行純化的同時(shí)，應(yīng)考慮其自發(fā)組裝形成顆粒的條件。我們采用以下方法對(duì)蛋白進(jìn)行純化以及促進(jìn)蛋白自發(fā)組裝形成顆粒以總體積20%的量加入飽和硫酸銨進(jìn)行蛋白沉淀，冰浴反應(yīng)30min。12000rpm離心10min，棄上清。沉淀用含有5MP-巰基乙醇的CBBuffer(0.29gNa跳，1.6gNa2C03，定容至1000mL)吹起，37"C震蕩30min，12000rpm離心10min，上清透析至PB5.8(含有300mMNaCl和50mMEDTA)的緩沖液體系中。每8h換液一次，換液6次后收集透析液，12000rpm離心10min，上清樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定純度。此方法中，先以20%飽和硫酸銨對(duì)蛋白進(jìn)行初步純化，再以含有5%0-巰基乙醇的CBBuffer促^f吏蛋白形成顆粒組裝引發(fā)二聚體，然后在低PH值及高鹽的條件下促進(jìn)蛋白自發(fā)組裝形成顆粒。同時(shí)此條件下，目的蛋白可以得到進(jìn)一步的純化(圖12)。以上表達(dá)的8種融合蛋白均以上述方法初步純化后，樣品用2%磷酸鎢負(fù)染，直接進(jìn)行電鏡觀察(圖13)。組裝成功的顆粒呈均勻的空心球形(部分顆粒為實(shí)心狀)，有大小兩種，直徑分別約為35nm及20nm。實(shí)施例4ELISA檢測HBc-123和HBc-125融合蛋白活性將八種融合蛋白分別以10lng/mL的濃度包被96孔板，2h。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37'C2h后4t:過夜。每孔加入100liL8H5抗體，371C孵育lh。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(1:10000)100jiL，37'C孵育30min。PBST洗板5次，加入顯色液顯色10min,終止液終止，酶標(biāo)儀讀值。由圖14的結(jié)果可知，八種融合蛋白均具有與8H5抗體結(jié)合的活性。以Q123和D125蛋白為例，進(jìn)行抗體特異性的檢測。10ing/mL的蛋白濃度包被96孔板，2h。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，2h后4TC過夜。每孔加入IOOmL不同抗體，包括8H5、8G9、3C8、4D1、10F7、1G2、3D2、3CF1、7D1、6CF3、7H8、10DE2、13E7、16A12共14林單抗。其中8H5為12肽篩選所用單抗，其余13林單抗為針對(duì)禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)單抗，37匸孵育lh。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(1:10000)100jaL,37匸孵育30min。PBST洗板5次，加入顯色液顯色10min，終止液終止，酶標(biāo)儀讀值。對(duì)ELISA結(jié)果分析(圖15)，Q123和D125融合蛋白只與抗體8H5反應(yīng)，與其它禽流感單抗均無反應(yīng)。說明Q123和D125融合蛋白的反應(yīng)特異性非常好。實(shí)施例5HBc-123和HBc-125融合蛋白的免疫源性分析將上述經(jīng)過純化的八種HBc-123和HBc-125融合蛋白分別與等體積的弗氏佐劑混合(初次免疫時(shí)與完全弗氏佐劑混合，加強(qiáng)免疫時(shí)與不完全弗氏佐劑混合)，以肌肉多點(diǎn)注射的方式，免疫BALB/c小鼠，每只小鼠的免疫量為100jLig蛋白，3-4只小鼠為一組。初次免疫后，每隔一周加強(qiáng)免疫一次，同時(shí)采取眼球血。進(jìn)行抗血清分離將血懸液置37匸2hr，再移入4匸過夜，令血球凝集。4000g離心10min，吸取上清，即得到抗血清。存放于-20。C備用。以1/ag/孔包被239-123和239-125融合蛋白，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為酶標(biāo)二抗，建立抗12肽123或125特異抗體檢測的間接法ELISA，用來檢測動(dòng)物抗血清的123肽或125肽特異抗體與12肽反應(yīng)性以及抗體產(chǎn)生滴度情況。HBc-123的各融合蛋白免疫血清以1:1000稀釋后，ELISA檢測結(jié)果如圖16。HBc-125的各融合蛋白免疫血清以1:2000稀釋后，ELISA檢測結(jié)果如圖17。實(shí)施例6免疫小鼠血清的免疫熒光檢測在24扎細(xì)胞培養(yǎng)板中放置蓋玻片，在其中培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞SF21，通過昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在SF21細(xì)胞中表達(dá)禽流感病毒的HA蛋白。表達(dá)后的細(xì)胞經(jīng)過PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，山羊多抗血清封閉后，與1:20稀釋的T123和F125免疫鼠血清室溫孵育1小時(shí)，以HBc免疫鼠血清為陰性對(duì)照。以熒光標(biāo)記的羊抗鼠抗體(Sigma，St.Louis,MO，USA)為二抗，室溫反應(yīng)半小時(shí)，取DAPI(Sigma,St.Louis,MO，USA)染細(xì)胞核，室溫10分鐘，然后制片于正置熒光顯微鏡(Nikon)下觀察。由圖18的結(jié)果可知，T123和F125免疫鼠血清均能特異地與SF21細(xì)胞中表達(dá)禽流感病毒的HA蛋白結(jié)合。進(jìn)一步表明123和125較好的模擬了HA的抗原表位。實(shí)施例712肽122、124、128、129與HBVcAg蛋白融合表達(dá)及活性檢測4種12肽122、124、128、129，分別以兩個(gè)拷貝插入HBVcAg蛋白中，得到的融合蛋白分別稱為HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129。HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法與HBc-123、HBc-125融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法相同，所用引物如表19。第一輪的上游引物為F3，笫二輪的上游引物為F2，第三輪的上游引物為Fl，下游引物均為HBcR。通過3輪PCR，將目的12肽片斷與C149-mut片段相連，并以BglII和EcoRI雙酶切后，與BamHI和EcoRI雙酶切的pC149-mut載體連接，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒(具體方法詳見實(shí)施例15)。表4HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白克隆引物序列<table>complextableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白表達(dá)和純化與上述HBc-123、HBc-125融合蛋白的表達(dá)、純化方法相同(具體方法詳見實(shí)施例15)。HBc與12肽融合蛋白的表達(dá)情況以及顆粒組裝情況如表5所示。顆粒的電鏡觀察圖片如圖19。表5HBc與12肽融合蛋白的表達(dá)及VLP形成^口所含肽rm^~~顆粒組編可段名稱產(chǎn)物形式表達(dá)產(chǎn)量裝情況間接ELISA檢測HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白活性HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白以10jng/mL的濃度包被96孔板，37'C2h。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，2h后4C過夜。每孔加入100uL不同抗體，包括8H5、8G9、3C8、1G2、3D2、3CF1、7D1、6CF3、7H8、10DE2、13E7、16A12共12林單抗。其中8H5為12肽篩選所用單抗，其余l(xiāng)l林單抗為針對(duì)禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)單抗，37C孵育lh。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(1:10000)lOOpL,37r孵育30min。PBST洗板5次，加入顯色液顯色10min,終止液終止，酶標(biāo)儀讀值。由圖20的結(jié)果可知，HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白只與抗體8H5反應(yīng)，與其它禽流感單抗均無反應(yīng)，說明HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白與8H5單抗的反應(yīng)特異性非常好。實(shí)施例8展示12肽的類病毒顆粒與禽流感病毒的竟?fàn)嶦LISA實(shí)驗(yàn)HBc-122HBc-D123HBc-T123HBc-F123HBc-Q123HBc-124HBc-D125HBc-T125HBc-F125HBc-Q125HBc-128HBc-129122123123123123124125125125125m129可可可可可溶溶溶溶溶可溶/包體體含體可溶可溶/包含體可溶/包含體可溶/包含體可溶可溶/包含體+++++++++++++++++++好好絲好好好好絲絲絲好好取禽流感病毒H5N1特異鼠單抗2F2以10ug/ml包板，病毒林Ck/HK/Yu22/02以l:40稀釋后加入孔板中孵育，37C，lh;棄去孔中病毒，將10ug初純的類病毒顆粒與1:1000稀釋的8H5/HRP共同加入孔板中孵育，37°C，30min。126和127并不與H5單抗結(jié)合，但同樣展示于VLP上作為陰性對(duì)照，另又以PBS為不加VLP的陰性對(duì)照。結(jié)果如圖21所示，上述5個(gè)待測的類病毒顆粒均能與病毒竟?fàn)幗Y(jié)合8H5酶標(biāo)抗體，進(jìn)一步提示這5個(gè)12肽均有可能模擬了8H5抗原表位的部分空間結(jié)構(gòu)。實(shí)施例912肽122和129與239蛋白融合表達(dá)及活性檢測將實(shí)施例7中的第三輪PCR產(chǎn)物(目的12肽片斷與C149-mut片段相連的片段)進(jìn)行BglII和SalI雙酶切，然后與經(jīng)BamHI和SalI雙酶切的pTO-T7-239相連，構(gòu)建出在239序列的C端融合兩段相同12肽序列的pT0-T7-239-D122和pT0-T7-239-D129表達(dá)質(zhì)粒。239-D122和239-D129融合蛋白表達(dá)和純化與實(shí)施例2中的239-123和239-125融合蛋白相同(具體方法詳見實(shí)施例2)。目標(biāo)蛋白以包涵體的形式存在，純化后239-D122的濃度為2.8ug/ul，239-D129的濃度為0.222ug/ul.直接ELISA法檢測239-D122和239-D129融合蛋白的活性初步純化的239-D122和239-D129融合蛋白用CB溶液稀釋后以10jng/mL的濃度包被96孔板，371C2h。洗板1次，ED封閉液封閉，37*C2h。倒封閉液，96孔板充分扣干，每孔分別加入lOOpL不同的鼠單抗，包括8H5、8C11、8G9、1A6、1G2、3C8、4D11、10F7共8林單抗。其中8C11為239蛋白特異單抗，8H5為12肽篩選所用單抗，其余6林單抗為針對(duì)禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)單抗。37匸孵育lh。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(1:20000)100jnL，37X:孵育30min。PBST洗板5次，加入A、B顯色液顯色，37C孵育10min。終止液終止，酶標(biāo)儀讀值。由圖22結(jié)果可知，239-D122和239-D129融合蛋白只與抗體8C11和8H5反應(yīng)，與其他單抗均無反應(yīng)。說明239-D122和239-D129融合蛋白的反應(yīng)特異性非常好。實(shí)施例10Dot-blot檢測12肽融合蛋白與8H5抗體的結(jié)合活性Dotblot檢測12肽與HBcAg和239的融合蛋白與8H5單抗反應(yīng)性。待測分別為:HBc-D123、HBc-T123、HBc-F123、HBc-Q123、HBc-D125、HBc-T125、HBc-F125、HBc-Q125、HBc-D122、HBc-D124、HBc-D128、HBc-D129及239-D123、239-125、239-D122、239-D124、239-D128、239-D129,并以HBcAg蛋白和239蛋白為陰性對(duì)照。樣品濃度均調(diào)整為10ug/ul，分別經(jīng)過(1)沸水煮10min、(2)沸水煮20min和(3)4M尿素變性三種方式處理。處理過的樣品以及未處理過的樣品各取4ul點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，室溫(25t:)放置20min，使蛋白被膜充分吸附；加20ml的5%的脫脂奶，37。C封閉2h;加50ul8H5腹水抗體，37r反應(yīng)2h;用15ml的1xTNT洗膜三次，每次10分鐘，晾干；加20ml酶標(biāo)二抗AP-GAM(用封閉液以1:5000稀釋使用)，37。C反應(yīng)30min;用15ml的lxTNT再洗膜三次，每次10分鐘，晾干；加AP底物顯色液，37X:顯色10min;棄去顯色液，用純水清洗3次，終止顯色反應(yīng)；觀察結(jié)果，掃描。結(jié)果如下(圖23)，239-125和239-123融合蛋白經(jīng)煮沸或尿素處理后，與8H5單抗的結(jié)合活性減弱或近乎喪失。HBc-D124和HBc-D128經(jīng)煮沸后活性喪失。123、125、124、128、129與HBcAg的融合蛋白經(jīng)4M尿素變性后，其活性沒有明顯變化。123、125、129與HBcAg的融合蛋白經(jīng)煮沸處理，與8H5的結(jié)合活性也沒有明顯變化。說明123、125、124、128模擬肽是構(gòu)象表位，經(jīng)變性處理易喪失活性。而展示在HBcAg的類病毒顆粒上時(shí)則相對(duì)比較難破壞其空間構(gòu)象。實(shí)施案例11:Westernblot檢測12肽融合蛋白與8H5單抗的結(jié)合活性Westernblot檢測初步純化的12肽與HBcAg和239的融合蛋白與8H5單抗的結(jié)合活性。蛋白樣品進(jìn)行12y。SDS-PAGE膠電泳，一份進(jìn)行考馬斯亮蘭染色，另一份用于Westernblot檢測。電轉(zhuǎn)法將SDS-PAGE上的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，封閉后與8H5單抗反應(yīng)，二抗為由GAM-AP(按原始濃度1:3000使用)，以NBT/BCIP溶液系統(tǒng)顯色。由圖24和25的結(jié)果可知，在六種12肽與HBcAg的融合蛋白中，只有HBc-D125的二聚體與8H5單抗有反應(yīng)活性。在六種12肽與239的融合蛋白中，239-D122和239-125的二聚體有很強(qiáng)的針對(duì)目標(biāo)抗體8H5活性，而239-D124和239-D129的二聚體有較弱的針對(duì)目標(biāo)抗體8H5活性。實(shí)施例1212肽融合蛋白阻斷血凝抑制的檢測病毒血凝素效價(jià)的確定、抗體效價(jià)的確定、血凝抑制實(shí)驗(yàn)、蛋白阻斷血凝抑制實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞選擇、細(xì)胞微孔板中和實(shí)驗(yàn)均按照WHO流感實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法操作(http://www,who,int/csr/resources/publications/csrpublications/en/index8.html)。病毒血凝素效價(jià)的確定靜脈取血獲得正常健康雞血，添加千分之一肝素，搖勾置4x:保存。以PBS洗3次，末次經(jīng)2000g離心10分鐘，將紅細(xì)胞用PBS配成l。/。濃度。滅活病毒液在微孔血凝板中用PBS作1:2系列倍比稀釋，每孔加入50iuL后加入等量1%雞血紅細(xì)胞，搖勻，室溫靜置30min后觀察。以出現(xiàn)完全血凝的血凝素最高稀釋度為其血凝效價(jià)，即為1個(gè)血凝單位，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用4個(gè)血凝素單位。經(jīng)檢測血凝素效價(jià)為1:256，為1個(gè)單位，4個(gè)單位即為1:64稀釋。8H5抗體效價(jià)的確定(血凝抑制實(shí)驗(yàn))取前一實(shí)驗(yàn)校對(duì)過的4個(gè)血凝單位病毒用于本實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)樣品單抗8H5用PBS做系列倍比稀釋，在微孔血凝板上每孔加入25nL，加入等量已配好的4個(gè)血凝單位滅活病毒稀釋液，混勻置室溫30min，然后每孔加入50pL1%雞紅細(xì)胞，混勻置室溫30min后觀察。以出現(xiàn)完全抑制的樣品最高稀釋度的倒數(shù)為樣品中抗體的效價(jià)。經(jīng)檢測8H5抗體效價(jià)為1:8192。以上所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)進(jìn)行3次。12肽融合蛋白阻斷血凝抑制實(shí)驗(yàn)取前面實(shí)驗(yàn)確定的4個(gè)血凝單位病毒(1:64)和2倍抗體效價(jià)的單抗8H5(1:4096)進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。具體步驟如下將實(shí)驗(yàn)樣品蛋白239-D122(2.8mg/mL)和239-125(2.0mg/mL)用PBS做系列倍比稀釋，在微孔血凝板上每孔加入15jaL，然后再加入10ml單抗8h5稀釋液和25ml滅活病毒稀釋液，混勻置室溫30min，然后每孔加入50jnLl。/。雞紅細(xì)胞，混勻置室溫30min，觀察是否出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集。對(duì)結(jié)果分析(如圖)239-D122蛋白1—16倍稀釋(濃度2.8mg/ml—0.175mg/ml);239-125蛋白1—8倍稀釋(濃度2.Omg/ml—0.25mg/ml)時(shí)，可以有效阻斷單抗8H5與YU22、A6、B5、Cl、C3、D2、El、A5共七抹病毒的血凝抑制實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1312肽融合蛋白阻斷抗體對(duì)H5N1病毒的中和實(shí)驗(yàn)用MEM細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)239-D122(2.8mg/mL)和239-125(2.0mg/mL)蛋白進(jìn)行倍比稀釋，稀釋后每一濃度體積為20jLiL,再加入MuL適當(dāng)稀釋的8H5抗體，然后與40uL適當(dāng)?shù)味鹊腁IV于37'C孵育2h。前一天接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的MDCK細(xì)胞，以培養(yǎng)液洗滌一次，每孔加入35juL上述混合物，37n、5%C02培養(yǎng)箱中孵育lh，棄去上清，加入正常MEM培養(yǎng)液，371C、5%C(^培養(yǎng)72h。取上清，血凝抑制實(shí)驗(yàn)檢測是否有病毒存在。如果沒有出現(xiàn)血凝抑制，說明融合蛋白能與8H5抗體結(jié)合，所以不能阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞。實(shí)施例14122和125短肽單克隆抗體的制備和篩選經(jīng)過純化的融合蛋白239-D122、239-125分別與等體積的弗氏佐劑混合(初次免疫時(shí)與完全弗氏佐劑混合，加強(qiáng)免疫時(shí)與不完全弗氏佐劑混合)，以肌肉多點(diǎn)注射的方式，免疫BALB/c小鼠，每只小鼠的免疫量為100pg蛋白，3~4只小鼠為一組。初次免疫后，每隔一周加強(qiáng)免疫一次，免疫五周后，在融合前72hr對(duì)待融合鼠進(jìn)行最后一次免疫加強(qiáng)，采用脾臟免疫。脾臟免疫時(shí)，先用乙醚麻醉小鼠，然后剖開腹腔外皮取出脾臟，沿脾臟叢向注射100pL蛋白，最后用手術(shù)針線縫合腹皮切口。取待融合的BALB/C小鼠，摘除眼球放血致小鼠死亡，收集的血液制成抗血清，作為抗體檢測的陽性對(duì)照。自來水沖洗，浸泡于75%乙醇溶液中5min，隨即放入超凈臺(tái)內(nèi)小鼠解剖板上，右側(cè)臥位。無菌手術(shù)打開腹腔取出脾臟，用剪刀剪成小塊放于200目細(xì)胞篩網(wǎng)上，再用研磨棒擠壓研磨，同時(shí)用吹管滴加無血清RPMI-1640培養(yǎng)液(Invitrogen，USA)。補(bǔ)加適量無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，靜置3~5min，取上2/3部分懸液移入50mL塑料離心管中，上述過程反復(fù)2~3次。取無血清RPMI-1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞3次(1000rpm/minx10min)，之后重懸細(xì)胞。將制備的骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0與脾細(xì)胞混合于50mL離心管內(nèi)(1x108脾細(xì)胞+1x107骨髓瘤細(xì)胞，約10:1)，離心1500rpm/minx8邁in。離心后，輕輕彈擊管底J吏細(xì)胞疏松成糊狀。用吸管吸取0.8mL50%聚乙二醇(Mrl500)溶液(按1x108脾細(xì)胞+0.8mLPEG)加入離心管內(nèi)，邊加邊輕輕攪拌，PEG平均在60s內(nèi)加完，隨即加入10mL預(yù)溫至37C的RPMI-1640培養(yǎng)液，溫和攪拌。最后補(bǔ)加RPMI-1640培養(yǎng)液至40mL，離心1000rpm/minx5min。棄上清液，取少量HT培養(yǎng)液(100xHT稀釋至RPMI-1640培養(yǎng)液中)將細(xì)胞小心吹散，將細(xì)胞移入準(zhǔn)備好的HT培養(yǎng)液中。加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.lmL，放入C02孵育箱中培養(yǎng)。12hr后，配置適量的HAT培養(yǎng)液(100xHT,100xA稀釋至RPMI-1640培養(yǎng)液中)，每個(gè)孔中滴加O.lmL。5天后，用HT培養(yǎng)液給孔中的細(xì)胞上清進(jìn)行50-100%的換液。融合細(xì)胞培養(yǎng)約9-14天后，吸取上清檢測。采用Yu22滅活病毒進(jìn)行血凝抑制法(HI)篩選。初篩獲得的陽性上清的培養(yǎng)孔中通常會(huì)有二個(gè)以上的雜交瘤集落，進(jìn)一步通過有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)方法。把細(xì)胞按一定濃度進(jìn)行梯度稀釋，然后接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中，盡可能使孔內(nèi)只有一個(gè)細(xì)胞生長。細(xì)胞培養(yǎng)7~10天后，再次進(jìn)行HI檢測。重復(fù)克隆23次，直到100%陽性后認(rèn)為獲得了穩(wěn)定克隆林。將獲得的模擬肽特異的單克隆抗體對(duì)禽流感病毒進(jìn)行血凝抑制實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)。100xHT溶液稱取黃噤呤(hypoxanthn,H)136.1mg+胸腺嘧咬核苷(thymidine,T)38.8mg，ddH20加至lOOmL;4550X:條件下溶解后，過濾除菌；分裝，每支5mL，于-20匸保存。100xA溶液:稱取氨基蝶呤(aminopterin，A)1.76mg,d歸力口至90mL，再加lmol/LNaOH0.5mL;溶解后加0.5mLlmol/LHC1中和Na0H，并補(bǔ)加ddH20至100mL;過濾除菌，分裝，每支5mL，于-20T保存。實(shí)施例15122和125模擬肽氨基酸序列的突變模擬肽122(ETQLTTAGLRLL)和125(DTPLTTAALRLV)與239融合蛋白可以阻斷8H5單抗對(duì)病毒的血凝抑制。122和125的氨基酸序列非常相似，只有第1、3、8和12位氨基酸有差異，而第1和12位的氨基酸又屬于同一類型的氨基酸。因此在125的基礎(chǔ)上，針對(duì)第3和8位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行15種氨基酸的替換。含突變位點(diǎn)的引物序列見表6。依據(jù)實(shí)施例2所迷方法，以239基因?yàn)槟０澹?39-123F為上游引物，表6所列引物各為下游引物，擴(kuò)增出突變后的肽段，重新克隆至pT0-T7載體表達(dá)融合蛋白，初步純化融合蛋白，檢測與8H5的反應(yīng)，進(jìn)一步檢測對(duì)血凝抑制的阻斷效果，并免疫小鼠，檢測產(chǎn)生的抗體與病毒的反應(yīng)性。表6125肽段點(diǎn)突變與239蛋白融合表達(dá)的克隆引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>TTAGAATTCGTCGACAACCAGCCGAAGGTACGCCGTCGTCAG239C-T8H5125CR2-155TTAGAATTCGTCGACAACCAGCCGAAGGAACGCCGTCGTCAG239C-T8H5125CR2-165TTAGAATTCGTCGACAACCAGCCGAAGCCACGCCGTCGTCAG實(shí)施例16亞肽庫的構(gòu)建及針對(duì)8H5單抗的篩選選用NewEnglandBiolabs公司的ph.D多肽展示克隆系統(tǒng)(ph.D.peptidedisplaycloninglibrary),以125肽段為基礎(chǔ)，向兩端各隨機(jī)延伸兩個(gè)氨基酸，構(gòu)建16肽亞肽庫。以125肽段為基礎(chǔ)，對(duì)笫3、5、7、10位氨基酸進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建12肽亞肽庫。構(gòu)建過程按操作說明書進(jìn)行。16肽亞肽庫的建庫引物設(shè)計(jì)如表7所示。取5ug引物libl25-16merRl與3倍量的Extensionprimer于50ulTE(含lOOmMNaCl)體系中退火，退火條件95"C，5min,逐漸冷卻至37T以下。取Klenowfragment(NEB)補(bǔ)平片段，37。C溫育10min，之后于65匸下15min滅活。取該補(bǔ)平片段與1ibl25-16merR2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得包含125肽段及兩端隨機(jī)肽段的目的片段。將目的片段與Ml3KE載體同時(shí)以Eagl與Acc651(NEB)雙酶切，酶切產(chǎn)物與載體經(jīng)過酚氯仿抽提，1/10(V/V)3MNaAC，2倍體積無水乙醇于-20。C沉淀后，進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得由隨機(jī)肽段和建庫栽體構(gòu)成的連接物。12肽亞肽庫的建庫引物為libl25-14mutR(表7)。取5ug引物libl25-16merRl與3倍量的Extensionprimer于50ulTE(含lOOmMNaCl)體系中退火，并用Kle畫fragment補(bǔ)平，以Eagl與Acc651(NEB)雙酶切，連至M13KE載體，具體過程同上。表7構(gòu)建亞肽庫的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備用槍頭糸L取ER2738單克隆菌落，投入盛有5mlLB的試管中，37度，220rpm培養(yǎng)12-14小時(shí)，同時(shí)做陰性對(duì)照；培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取3ml菌液倒入300mlLB液體培養(yǎng)基中，37度，220rpm，振搖2-3小時(shí)，每半小時(shí)測一次OD，當(dāng)OD值達(dá)到0.3-0.4時(shí)，停止培養(yǎng)；將菌液在冰上預(yù)冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500ml預(yù)冷的離心杯中，2500rpm離心10分鐘；棄上清，離心杯中加入少量ddH20，使沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯，4000rpm離心IO分鐘；重復(fù)ddH20洗滌一次；棄上清，往離心杯中加入少量10%甘油，使沉淀懸浮后，再加滿10%甘油，4000rpm離心IO分鐘；棄上清，在離心杯中加入300ul10%甘油，使沉淀懸浮后，將菌液分裝于1.5ml離心管中，100ul/管。電轉(zhuǎn)化連接物及收獲亞庫取3ul連接物與100ul現(xiàn)制備的ER2738感受態(tài)細(xì)胞于冰上混合，加入0.lcm的電轉(zhuǎn)杯中(Bio-rad)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)儀(Bio-rad)條件設(shè)定為2.5kV,25yF,20mQ,電轉(zhuǎn)時(shí)間為4.94~5.02ms。每個(gè)電轉(zhuǎn)杯電轉(zhuǎn)后立即加入lmlSOC,輕輕重懸菌體，轉(zhuǎn)至37X:，振蕩培養(yǎng)30min。取1M1上清稀釋100倍，于LB/IPTG/Xgal培養(yǎng)板上培養(yǎng)，測定文庫中噬菌體的滴度。其余電轉(zhuǎn)化菌體轉(zhuǎn)入1L對(duì)數(shù)生長前期的ER2738宿主菌液中，37"C震蕩培養(yǎng)4.5h。將菌液移入離心管中，10000rpm離心15min。吸取上部80%上清，加入1/6體積的PEG/NaCl(20%PEG-8畫，2.5MNaCl)溶液，4匸靜置過夜。10000rpm4"C離心15min。棄上清，加入100mLTBS重懸沉淀，加入1/6體積的PEG/NaCl溶液，4X:靜置重復(fù)沉淀噬菌體。再以10000rpm4X:離心15min。棄上清，加入10mlTBS，4"C振蕩重懸沉淀噬菌體。測定文庫擴(kuò)增滴度，以50%甘油于-20匸凍存。從亞肽庫中篩選模擬8H5單抗識(shí)別表位的短肽，篩選流程參照實(shí)施例1進(jìn)行。第三輪篩選后，取出約lul洗脫下來的噬菌體進(jìn)行滴定。挑取單一噬菌體空斑至對(duì)數(shù)期的ER2738菌中，37n培養(yǎng)4.5-5h，離心收集噬菌體上清進(jìn)行ELISA檢測。包被10ug/ml濃度的鼠單抗8H5，以逸菌體上清為一抗，Anti-M13/HRP抗體(AmershamPhmarciaBiotech,UK)以1:3000稀釋為二抗，取禽流感相關(guān)抗體8G9mAb以及抗HEVE2蛋白的不相關(guān)抗體8CllmAb，12A10mAb為鼠單抗對(duì)照。圖26表示了23個(gè)噬菌體多肽的檢測結(jié)果。由圖中結(jié)果可知，大部分噬菌體肽針對(duì)目標(biāo)抗體8H5的讀值高于對(duì)照抗體3倍以上，有較好的特異性。根據(jù)噬菌體ssDM抽提試劑盒(Omega，USA)的常規(guī)操作抽提DNA，以該DNA模板進(jìn)行測序(Invitrogen,Shanghai,China)，獲得21林噬菌體展示16肽的氨基酸序列(見表8)。表8與單抗隆抗體8H5結(jié)合的16肽序列Table8Thesequencesofthehexadecapeptidebindingwith8H5mAb<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>NADTPLTTAALRLVRM16H-8(SEQIDNO:32)QEDTPLTTAALRL濯16H-9(SEQIDNO:33)MPDTPLTTEALRLVYQ16H-10(SEQIDNO:34)AIDTPLTTAALRLVRN16H-18(SEQIDNO:42)TLDTPLTTAALRLVKY16H-19(SEQIDNO:43)GMDTPLTTAALRLVQK16H-20(SEQIDNO:44)NLDTPLTTAALRLVSI16H-21(SEQIDNO:45)突變12肽庫的篩選流程同樣參照實(shí)施例1進(jìn)行。第三輪篩選后，取出約lul洗脫下來的噬菌體進(jìn)行滴定。挑取單一噬菌體空斑至對(duì)數(shù)期的ER2738菌中，371C培養(yǎng)4.5-5h，離心收集噬菌體上清進(jìn)行ELISA檢測。包被lOug/ml濃度的鼠單抗8H5，以噬菌體上清為一抗，Anti-M13/HRP抗體(AmershamPhmarciaBiotech,UK;以1:3000稀釋為二抗，取禽流感相關(guān)抗體8G9mAb以及抗HEVE2蛋白的不相關(guān)抗體8CllmAb，6F8mAb為鼠單抗對(duì)照。圖27表示了23個(gè)噬菌體多肽的檢測結(jié)果。由圖中結(jié)果可知，大部分噬菌體肽針對(duì)目標(biāo)抗體8H5的讀值高于對(duì)照抗體3倍以上，有較好的特異性。根據(jù)噬菌體ssDNA抽提試劑盒(Omega,USA)的常規(guī)操作抽提DNA，以該DM模板進(jìn)行效'J序(Invitrogen，Shanghai,China),獲得3林噬菌體展示12肽的氨基酸序列(見表9)。表9與單抗隆抗體8H5結(jié)合的12肽序列Table9Thesequencesofthedodecapeptidebindingwith8H5mAb編號(hào)氨基酸序列DTSLMTIALNLV12MH1(SEQIDNO:46)12MH2DTELTTIALKLV(SEQIDNO:47)12MH3DTELTTQALKLV(SEQIDNO:48)挑選與8H5單抗特異結(jié)合的肽段，與HBcAg融合表達(dá)，檢測與8H5反應(yīng)性，檢測對(duì)血凝抑制的阻斷效果，檢測阻斷8H5單抗的中和活性。進(jìn)一步免疫小鼠，檢測產(chǎn)生的抗體與病毒的反應(yīng)性。SOC:溶解20g蛋白胨，5g酵母骨，0.5gNaCl于950ml去離子水，加入10ml250mMKCl，以.NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至1L，滅菌。用前補(bǔ)加無菌MgCh至lOmM，補(bǔ)加無菌葡萄糖至20mM。權(quán)利要求1、一種能特異性結(jié)合禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和單克隆抗體的模擬肽，其氨基酸序列為SEQIDNOs1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23，或者所述模擬肽經(jīng)氨基酸插入、延伸、刪除而得到的保守性變異體或活性片段，其氨基酸序列優(yōu)選為SEQIDNOs25-48之一，所述變異體或活性片段仍保持與禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和性單克隆抗體特異結(jié)合的能力。2、編碼權(quán)利要求1所述模擬肽或其保守性變異體或活性片段的核苷酸序列。3、權(quán)利要求2的核苷酸序列，其為SEQ訓(xùn)0:2，4，6，8，10，12，14，16,18，20,22或24。4、包含權(quán)利要求1所迷模擬肽或其保守性變異體或活性片段的融合蛋白，其具有與禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和單克隆抗體特異結(jié)合的能力。5、權(quán)利要求1所述模擬肽或保守性變異體或活性片段與其它蛋白或毒素或脂類等大分子載體或重組載體偶聯(lián)或融合而得到的復(fù)合物。6、權(quán)利要求4的融合蛋白，其中所述其它蛋白為239蛋白或HBcAg。7、展示權(quán)利要求1所述模擬肽或保守性變異體或活性片段或類似物的類病毒顆粒，仍具有與禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和單克隆抗體特異結(jié)合的能力。8、包含權(quán)利要求2或3所述核苷酸序列的核酸載體。9、權(quán)利要求8所述核酸載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。10、權(quán)利要求1所述模擬肽及其保守性變異體或活性片段或類似物，權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述融合蛋白或復(fù)合物或權(quán)利要求7所述類病毒顆粒用于制備預(yù)防禽流感疾病的疫苗的用途。11、權(quán)利要求1所述模擬肽及其保守性變異體或活性片段或類似物，權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述融合蛋白或或復(fù)合物或權(quán)利要求7所述類病毒顆粒在制備用于診斷禽流感疾病的組合物中的用途。12、一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1所述模擬肽或保守性變異體或活性片段或其類似物，或權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述融合蛋白或復(fù)合物或權(quán)利要求7所述類病毒顆粒。13、一種抗體，其特異于權(quán)利要求1所述的模擬肽或保守性變異體或活性片段或其類似物。14、權(quán)利要求13所述特異性抗體在制備用于診斷和治療禽流感疾病的組合物中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了可特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白中和表位模擬肽，及其保守性變異體或活性片段，及其相關(guān)編碼序列，及應(yīng)用該模擬肽或保守性變異體或活性片段于預(yù)防或診斷的用途。文檔編號(hào)C12N15/11GK101353371SQ200710129838公開日2009年1月28日申請日期2007年7月27日優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日發(fā)明者夏寧邵,軍張,王明橋,羅文新,陳毅歆,陳瑛煒申請人:廈門大學(xué);養(yǎng)生堂有限公司